Name: Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprenda métodos para cultivar explantes de tecido ósseo humano e estudar a colonização de células de câncer de mama no nicho metastático ósseo usando imagens de bioluminescência e microscopia de fluorescência.

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Estes estudos foram financiados, em parte, por doações da Fundação de Pesquisa e Desenvolvimento Alternativo (107.588), o Instituto Nacional de Saúde (1U54CA136465-04S1) e do Programa de Pesquisa de Câncer da Califórnia mama (201B-0141). Agradecemos Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor para a generosa doação de seu <pkt2 lubig=""> transponson e PK / hubiC-SB11 plasmídeos transposase. Agradecemos John Tamaresis, Ph.D. para aconselhamento sobre métodos estatísticos, Timothy Brown para a realização de citometria de fluxo, Georgette Henrich para aconselhamento sobre migrações ensaios, e Nancy Bellagamba para facilitar a coleta de espécimes THR. </pkt2>

Cabeças femorais foram coletadas de pacientes submetidos à cirurgia eletiva THR no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. Todos os tecidos foram coletadas como espécimes identificados-de, em conformidade com a regulamentação do Compliance Office Research da Universidade de Stanford. 1. Seleção de uma linha (s) celular do cancro da mama <ol><li> Obter ou transfectar a linha celular de cancro da mama desejada (s) com uma construção repórter de luciferase-GFP. Os seguintes experimentos foram realizados utilizando o MCF-7 linhas celulares de cancro da mama projetados para a expressão estável de luciferase do pirilampo (FLUC) e reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) MDA-MB-231 e por transfecção com a Bela Adormecida transposon plasmídeo pKT2 / LuBiG e o pK transposase plasmídeo / hubiC-SB11 45,46. NOTA: As linhas de células transfectadas são referidos como MDA-MB-231-Fluc-EGFP, e MCF-7-Fluc-EGFP. </li></ol> 2. Isolar Tissue Fragments de cabeças femorais <ol><li> Após a cirurgia THR, recolher a cabeça femoral descartada em um recipiente estéril preenchido com soro fisiológico. Transferir a amostra para o laboratório e processá-lo dentro de 1-3 horas de cirurgia. Nota: se existir um atraso no processamento, colocar as amostras a 4 ° C. </li><li> Prepare uma área de trabalho, colocando os seguintes itens em uma manta absorvente em um fluxo laminar de cultura de tecidos capô: luvas estéreis, rongeur cirúrgico, pinças, copo com 70% isopropanol para lavar os instrumentos, e em vasos de cultura de tecidos, conforme estipulado abaixo para cada tipo de experimento . </li><li> Vestindo uma luva cirúrgica estéril para segurar a cabeça do fêmur rodada em uma das mãos, use o rongeur na outra mão para extrair fragmentos de osso trabecular do tamanho desejado (~ 2-5 mm) do eixo superior exposta do fêmur. Transferir fragmentos de osso no interior do vaso de cultura (por exemplo, 6-, 12-, ou placa de cultura de tecidos ou câmara de migração de 24 poços), dependendo do tipo de proliferação, colonization ou migração experiência, como descrito nos passos 3, 4 ou 5. NOTA: fragmentos de tecido ósseo deve ser colhida, como descrito acima, após a conclusão das etapas iniciais para cada ensaio de proliferação, colonização ou de migração específica. Fragmentos irá variar em tamanho, como mostrado na Figura 2. Os fragmentos podem ser pesados ​​antes ou após as experiências para a finalidade de normalização. </li></ol> 3. Co-cultura de células cancerosas da mama vizinhos a fragmentos ósseos medir mama índice de proliferação celular BLI <ol><li> Antes do experimento, preparar uma suspensão contendo 2 x 10 5 células de cancro da mama / 50 ul, e preparar velas de cera de osso para imobilizar fragmentos ósseos em cultura. Corte uma ponta P200 micropipeta em 3 pedaços e usar a parte mais estreita da maior peça de uma forma &quot;pré-fabricadas&quot; para cortar pequenas (~ 35 mg) pedaços de cera de osso. Use a grande final do menor pedaço para ejetar os plugues de cera de osso em uma placa de Petripara armazenamento. </li><li> Coloque um pedaço de cera de osso na posição de 12 horas de cada poço e pressione suavemente para baixo com um dedo indicador estéril de luvas. </li><li> Pipetar 50 ul de suspensão de células contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama em DMEM-10% FBS + Pen-Strep no centro de cada poço de uma placa de 6 poços. (Alternativamente, as células de semente num padrão disperso se desejado). Colocar a placa a 37 ° C incubadora de cultura de tecidos durante 45 min para promover a fixação das células. </li><li> Coloque fragmento de um osso em um pedaço de cera de osso para cada bem experimental e aplique uma leve pressão com o rongeur para prendê-lo. Realizar experiências em triplicado, de tal modo que a partir de três fragmentos de osso numa dada amostra THR são colocados em três poços de topo, enquanto que o fundo três poços contêm cera de osso apenas como controles. </li><li> Usando uma pipeta de 5 ml, cuidadosa e lentamente entregar 5 ml de DMEM-10% de FBS ao lado de cada poço para evitar a retirada das células da mama ou fragmentos de ossos. Colocar a placa num 3776; C incubadora de cultura de tecidos durante 20-24 horas. </li><li> Para a realização de imagem de bioluminescência (BLI) remover a placa da incubadora e adicionar substrato luciferina (para obter uma concentração de 300 ug / ml) a cada poço. Imagem da placa imediatamente em uma plataforma de imagem IVIS usando os seguintes parâmetros: f-stop de 1, pequena binning, tempo de exposição de 1 segundo, o nível de D. Medir a intensidade do sinal de cada bem como radiância média (fótons / segundo centímetro / praça / steradian). </li><li> Use software de imagem para definir regiões de interesse (ROI) para quantificar o brilho médio para todos os poços experimental e controle. Exportação valores médios radiância para uma folha de Excel para executar estatísticas e gerar gráficos. </li></ol> 4. As células do cancro da mama-cultura Co semeadas diretamente em fragmentos de ossos para estudar Colonização e número de celular <ol><li> Utilize uma pinça para colocar os fragmentos ósseos directamente nos poços vazios de uma placa de 24 poços de cultura de tecidos (1 fragmento / poço). </li><li> PipETTE um 50 ul de suspensão de células de gotículas de DMEM-10% FBS contendo 1 X outubro 3-6 células de cancro da mama directamente no topo de cada fragmento de osso. Colocar a placa a 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante 45 minutos para promover a fixação das células. Adicionar cuidadosamente 1-2 mL de DMEM-10% de FBS para o lado de cada cavidade de tal modo que o fragmento é inteiramente submerso no meio. Incubar a placa em uma temperatura de 37 ° C cultura de tecidos incubadora durante 20-24 hr. </li><li> Após a incubação, utilize uma pinça para transferir cada fragmento de tecido ósseo de uma placa de 24 poços frescas contendo 1 mL de DMEM-10% de FBS em cada poço. Para executar BLI, siga os passos 3,6-3,7 acima. Além disso, os fragmentos podem ser visualizados utilizando um microscópio de fluorescência, ou descarregado para obtenção de uma população da medula para a análise do número de células de cancro da mama e as propriedades como descrito na etapa 6. </li><li> Para preparar os fragmentos intactos para uma avaliação qualitativa por microscopia de fluorescência seguinte BLI, pipeta de 5 mL de solução de etiquetagem fluorescente bisfosfonato (preparede de acordo com as instruções do fabricante) a cada poço para etiquetar as espículas mineralizadas dos fragmentos ósseos. Incubar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante mais 24 h. </li><li> Após 24 horas de cultura em fluorescente solução de etiquetagem com bifosfonatos, utilize uma pinça para transferir os fragmentos de placas de cultura de tecido contendo fenol médio e vista livre de vermelho usando um microscópio de fluorescência configuradas para GFP imagem (485 nm) e uma etiqueta com bifosfonatos (680 nm). </li></ol> 5. Medição de migração das células do cancro da mama para fragmentos de tecido ósseo e culta Osso Fragmento sobrenadantes <ol><li> A migração para o tecido ósseo sobrenadante da cultura. NOTA: Realizar experimentos em triplicata de tal forma que três fragmentos de uma dada amostra THR são usados ​​para gerar 3 sobrenadantes. Para cada experimento, a migração é comparado em três poços contendo sobrenadantes ósseas vs. três poços contendo apenas meio controle. <ol><li> Gerar tis ósseaprocessar sobrenadantes colocando fragmentos ósseos nos poços de uma placa de 12 poços contendo 2,2 mL de DMEM-10% FBS por poço. Cultura em uma temperatura de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora de 24 hr. Retirar o meio em 24 horas e substituir com 2,2 ml fresco DMEM-10% FBS. Tratar os poços de controlo contendo DMEM-FBS a 10% da mesma maneira. NOTA: O meio é mudado de 24 h para remover factores secretados em resposta a um trauma nos tecidos resultantes de cirurgia. Porque sobrenadantes tecido ósseo são geradas em FBS contendo médias, poços contendo FBS meio contendo apenas estão incluídos para controlar as contribuições de FBS a migração de células de câncer de mama. </li><li> Em 48 horas, recolher 0,9 ml de cada / sobrenadante e meio de controlo da pipeta para os poços de uma placa de receptor. As inserções serão posteriormente colocados nestas cavidades. Incubar a placa do receptor na cultura de tecidos incubadora enquanto semeando as inserções. Nota: O sobrenadante restante (~ 1 ml após a evaporação) podem ser coletadas para análise de secretoma factors se desejado 44. </li><li> Para semear as inserções Transwell, colocá-los em um padrão, vazio placa de 24 poços de cultura de tecidos. Pipetar 350 ul de suspensão de células contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama em DMEM-FBS a 10% sobre a superfície da membrana superior, interior de cada inserção como mostrado na Figura 1A. Colocar a placa de 24 poços contendo as inserções semeadas no 37 ° C incubadora de cultura de tecidos durante 45 min para promover a ligação. </li><li> Uma vez que as células se ligaram aos insertos, utilize uma pinça para transferir as inserções para a placa de receptor de acordo com as instruções do fabricante. Ângulo cada inserção ao colocá-la no receptor bem para evitar a formação de bolhas entre a membrana e o receptor de inserção bem sobrenadante. Incubar a placa receptor com inserções durante 20 horas em uma temperatura de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora. NOTA: Verifique a parte de baixo da placa de receptor para bolhas entre a membrana de inserção e o receptor bem supernatant. Se as bolhas são visíveis, remova as inserções específicas e colocá-los novamente no receptor bem até que não há bolhas de ar. </li><li> Após 20 forceps uso hr para remover as inserções a partir da placa do receptor. Utilizando os procedimentos em etapas 3,6-3,7 executar a imagem BLI as células que migraram para dentro e ligados ao fundo dos poços da placa de receptor. </li></ol></li><li> Migração para fragmentos de tecido ósseo. NOTA: Realizar experimentos em triplicata de tal forma que três fragmentos de uma dada amostra THR são colocados em três inserções separadas, e 3 esferas de vidro são colocadas em três inserções separadas como controles. <ol><li> Preparar a placa de receptor, pipetando 0,9 mL de DMEM-10% de FBS a cada poço. Coloque-o no tecido cultura incubadora enquanto prepara as inserções. </li><li> Para semear as inserções, inverter-los na superfície de uma caixa de tubo de plástico de microcentrífuga que tem uma tampa. Pipetar 50 ul de uma suspensão de células de gotículas de DMEM-FBS a 10% contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama directly na superfície exterior, no fundo de cada membrana de inserção (que está virada para cima sobre as inserções invertidas). Tampa da caixa de tubo de microcentrífuga com a tampa abriu e transferi-lo para o C incubadora tecido 37 ° por 45 min para promover a fixação das células. </li><li> Transfira a caixa de tubo de microcentrífuga para o capuz de cultura de tecidos, e utilizar uma pinça para ligar as inserções semeados lado direito para cima e transferi-los para os poços da placa de receptor. Pipetar 0,450 ml de DMEM-FBS a 10%, em cada copo de inserção. Utilizando uma pinça, transferir um fragmento de tecido ósseo (~ 3 mm) em cada copo de inserção preparado. Opcionalmente, use pérolas de vidro como controles negativos em poços adicionais. Colocar a placa num incubador de cultura de tecidos durante 20 horas. </li><li> Para medir a migração, preparar uma placa de 24 poços de cultura de tecidos padrão contendo 1 mL de DMEM-10% FBS por poço. Remova a placa do receptor da incubadora e utilizar uma pinça para transferir os fragmentos ósseos e os grânulos de cada inserir em cavidades separadas da placa padrão. Adicionar luciferinasubstrato (para se conseguir uma concentração final de 300 ug / ml) a cada poço e executar BLI utilizando os procedimentos em etapas 3,6-3,7. </li></ol></li></ol> 6. As análises adicionais de pré e pós-experimentais <ol><li> Análise de medula corado. <ol><li> Transferir um fragmento de osso em um filtro de células de 70 mm colocada na parte superior de um tubo de 50 ml. Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 25 G para lavar vigorosamente o fragmento com 10 ml de PBS para se obter uma suspensão de células de medula no tubo cónico. Centrifugar a suspensão de células durante 3 min a 300 xg e 21 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em PBS ou outra solução desejada para citometria de fluxo. NOTA: Os volumes ressuspensão irá variar dependendo do tamanho do agregado de células, após a centrifugação, e aplicação. </li><li> Para os ensaios de viabilidade ~ 75-300 volumes de PBS são apropriadas, e estas suspensões podem ser analisados ​​utilizando fluorescenc disponível comercialmentee os ensaios de viabilidade baseados de acordo com as instruções do fabricante, pipetada para um hemocitómetro convencional, e contados utilizando um microscópio invertido de fluorescência. </li><li> Para a análise de citometria de fluxo ou triagem com base na detecção de células de cancro da mama positivas para GFP, ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS contendo 2% de FBS, 2 mM de EDTA, e 10 mM de HEPES de modo a que a concentração é de 1 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E Coloração e imuno-histoquímica. <ol><li> Para processar os fragmentos de hematoxilina e eosina (H &amp; E) coloração e / ou imuno-histoquímica, colocar os fragmentos em cassetes plásticas marcadas com um lápis número 2, e submergir num recipiente cheio com 10% de formalina tamponada durante 24 horas. </li><li> Tecidos de processo para a inclusão em parafina, com secção e de coloração, usando protocolos de rotina, que incluem um passo descalcificação para dar conta das espículas mineralizadas dentro de cada fragmento. </li></ol></li></ol>

Nenhuma divulgação para relatar.

Mehra et ai. Descreveram anteriormente a recolha post-mortem e análise de amostras de osso de pacientes com cancro da próstata metastático colhidas no momento de autópsia, revelando tecidos de alta qualidade e validação do uso de amostras de ossos humanos para estudar o processo metastático 47. Aqui descrevemos protocolos para a coleta, processamento e utilização de fragmentos de tecidos ósseos humanos obtidos a partir de cabeças femorais descartados após a cirurgia THR em um sistema de co-cultura de...

O microambiente do tumor é amplamente reconhecido como um fator determinante para o comportamento de células de câncer durante a progressão do câncer de mama metastático e espalhar 1-3. O objetivo do método aqui apresentado é o de facilitar o estudo de células de câncer de mama, no microambiente do tecido ósseo humano, o local mais comum de metástase do câncer de mama 4-6. O osso é composto por mineralizado e medula compartimentos 7-9, tanto de células que abrigam e factores segregados implicados na progressão metastática 10,11. Embora amplamente utilizado em modelos in vivo rato facilitar estudos sistêmicos do processo metastático 12-15, interações celulares dentro do esqueleto não são facilmente acessíveis para observação e perturbação direta. Sistemas modelo para estudar e cultivar tecidos ósseos do mouse e as células da medula do mouse proporcionar um melhor acesso e têm rendido muitos insights em relação crosstalk e mecanismos subjacentes células do cancro da mama metastasis do esqueleto murino 16-22. No entanto, estudos sugerem que pode haver modelos de osteotropism específicas das espécies para o tecido ósseo 23,24. Esses padrões podem reflectir espécie-específicos inerentes diferenças nas propriedades do tecido ósseo, as diferenças resultantes de populações de medula óssea alterados em imuno-deficiente camundongos 11, e / ou a idade relativamente jovem de ratos utilizados em experimentos, os quais são possíveis determinantes do osso microambiente. In vitro abordagens para estudar as células de cancro da mama em co-culturas de ossos humanos têm tipicamente focada em tipos específicos de células de osso tais como os osteoblastos derivados de medula óssea ou de células do estroma cultivadas como monocamadas ou dentro engenharia sistemas modelo 3-dimensional 25-35. Embora os modelos de cultura de células 2-dimensional formaram o esteio da in vitro se aproxima para pesquisa do câncer, tem sido reconhecido que o comportamento da célula é fundamentalmente alterada em monolayer sistemas de cultura 18,36,37. Isto levou ao desenvolvimento de microambientes modificados que imitam a complexidade dos tecidos vivos 3-dimensionais, incluindo matriz- e modelos baseados em compostos de andaime de materiais naturais, tais como colagénio, polímeros sintéticos ou semeadas com tipos específicos de células para criar microambientes tecido semelhante 36-41. Abordagens de engenharia também incluíram a utilização de plataformas de biorreatores para controlar e estudar o ambiente hormonal do microambiente 18,19,41-43. Embora os modelos biomiméticos e biorreatores proporcionar muitos elementos de um microambiente tecido complexo em um ambiente controlado, e têm sido aplicados com sucesso para avançar no estudo da metástase do câncer de mama para os ossos 18,19,35,42,43, sistemas de modelos de engenharia em geral, não incorporam o espectro de tipos de células e componentes da matriz extracelular presentes no ambiente do osso nativo. Até recentemente, o câncer de mamaAs células não foram estudados no microambiente nativa intacta,, 3-dimensional do tecido ósseo humanos. Nós informou recentemente o desenvolvimento de um modelo de co-cultura utilizando fragmentos de tecidos ósseos humanos isolados de substituição total do quadril (THR) cirurgia espécimes 44. Estes espécimes abrigar tanto os compartimentos mineralizados e medula necessárias para estudar os mecanismos subjacentes micro-metástases em cultura de curto prazo. Em trabalho anterior estabelecemos prova de princípio para a utilização de imagem de bioluminescência (BLI) para monitorar a proliferação de células de câncer de mama que expressam luciferase (MDA-MB-231-FLUC) co-cultivadas com fragmentos de ossos 44. Aqui apresentamos detalhado protocolos experimentais para estudar a proliferação das células do cancro da mama, colonização e migração no contexto do microambiente nativa a partir de explantes de tecido ósseo humano. Primeiro apresentamos um protocolo para as células do câncer de mama co-cultura adjacentes a fragmentos de ossos para medir mamaproliferação celular utilizando BLI. Neste ponto, as suspensões de células da mama são semeadas como manchas de células em placas de 6 poços adjacentes aos fragmentos de osso, que são imobilizadas por pedaços de cera de osso. Os poços de controlo contêm cera de osso, mas nenhum fragmento ósseo. Uma vez que os pontos de células de anexar, o meio é adicionado e a placa é cultivada durante 24 h, após as quais a intensidade do sinal bioluminescente (associada com o número de células) é medida com BLI. No passo seguinte, apresenta-se métodos para células de cancro da mama co-cultura semeadas directamente sobre os fragmentos ósseos para estudar a colonização e proliferação. Aqui, as suspensões de células da mama são pipetados diretamente sobre os fragmentos de tecidos ósseos, que são monitoradas em cultura por BLI e microscopia de fluorescência ao longo do tempo para acompanhar a colonização e número de células. Neste método, a medula do compartimento podem ser retirados a partir dos fragmentos ósseos, em qualquer ponto de tempo para análise de células de cancro da mama colonizados por citometria de fluxo, ensaios de viabilidade ou medula. Além disso, desescriba duas abordagens diferentes para medir a migração de células de câncer de mama. No primeiro método passos são descritos para medir a migração para os sobrenadantes de cultura de tecido ósseo. Neste protocolo as células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies superiores dos interiores, Transwell inserir membranas com um tamanho de poro de 8 um (como mostrado na Figura 1A). As pastilhas são depois colocadas numa placa de receptor com poços contendo o sobrenadante de tecido ósseo ou meio de controlo. Ao longo de um período de incubação de 20 h, um pequeno número de células de cancro da mama migram através das membranas de inserção para dentro dos poços de cultura de tecidos mais baixos, onde eles se ligam para detecção pela BLI. No segundo método de migração de células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies inferiores exteriores, de membranas Transwell de inserção. Fragmentos de tecido ósseo são colocados em copos de inserção e as células de cancro da mama migrar para cima através das membranas para colonizar os fragmentos de osso (como mostrado na Figura 1B), o quesão então fotografada usando BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Suplementa todos os DMEM com 10% de soro fetal bovino e 1% de Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Complemente todos os McCoy's com 10% de soro fetal bovino e 1% de Pen/Strep</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidina (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Meio suplementar usado para linhagens celulares transfectadas.</td></tr><tr><td>Falcão&reg; Insertos de Cultura de Células para Placa de 24 Poços com Membrana PET Transparente (8.0 &mu; Tamanho dos poros m)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 24 Poços TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *para células de mamíferos*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina vaga-lume, sal de potássio 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células Estéreis 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Cluster de cultura de células tratadas com TC de 6 poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cluster de cultura de células tratadas com TC de 12 poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Cluster de cultura de células tratadas com TC de 24 poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Cera óssea</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Plataforma de Imagem</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>Versão 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Células de câncer de mama MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Células de câncer de mama</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Citoqueratina anti-humana monoclonal de camundongo anticorpo</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o estudo de câncer de mama colonização celular do niche metastático

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Óssea é o local mais comum de metástase do câncer de mama. Embora seja amplamente aceito que o comportamento de células de câncer influências microambiente, pouco se sabe sobre as propriedades das células de câncer de mama e comportamentos dentro do microambiente nativa do tecido ósseo humano. Nós desenvolvemos abordagens para acompanhar, quantificar e modulam as células de câncer de mama humanos dentro do microambiente de fragmentos humanos cultivados tecido ósseo isoladas de cabeças femorais descartados seguintes artroplastias totais de quadril. Usando células de câncer de mama projetados para luciferase e aprimorados proteína fluorescente (EGFP) expressão verde, somos capazes de quantificar reproducibly migração e proliferação padrões usando imagem de bioluminescência (BLI), as interações celulares pista dentro dos fragmentos ósseos através de microscopia de fluorescência, e avaliar as células da mama após colonização por citometria de fluxo. As principais vantagens deste modelo incluem: 1) a, microe nativa tecido arquitetura intactanvironment que inclui tipos de células humanas relevantes, e 2) o acesso directo ao microambiente, o que facilita quantitativa rápida e monitoramento qualitativo e perturbação de propriedades, comportamentos e interações de mama e de células ósseas. Uma limitação primária, na presente, é a viabilidade finita dos fragmentos de tecido, que confinam a janela de estudo à cultura de curto prazo. Aplicações do sistema de modelo incluem o estudo da biologia básica do câncer de mama e outros tumores malignos de osso buscando dentro do nicho metastático, e desenvolver estratégias terapêuticas para efetivamente como alvo as células de câncer de mama em tecidos ósseos.

Isolamento de fragmentos de tecido de cabeças femorais Cabeças femorais foram coletados a partir de um número igual de pacientes do sexo feminino (44-90 anos) submetidos a artroplastia electiva total da anca no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford e masculinos. Cada cabeça femoral descartada contém uma pequena porção do fêmur superior, que abriga tecido ósseo trabecular composto por espículas mineralizados e medula. Este tecido é acessível atr...

Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

O objetivo deste procedimento é estudar a proliferação, colonização e migração de células de câncer de mama em um sistema de modelo de explante de tecido ósseo humano. Isso é realizado isolando fragmentos de tecido ósseo trabecular de espécimes cirúrgicos da cabeça do fêmur e cultivando-os com células de câncer de mama que expressam luciferase e proteína verde fluorescente. A imagem de bioluminescência é utilizada para medir a proliferação das células e verificar a colonização das células de câncer de mama nos fragmentos de tecido ósseo.Padrões de colonização de células de câncer de mama são visualizados por microscopia de fluorescência. O compartimento medular pode ser lavado a partir dos fragmentos para análise por citometria de fluxo, por meio de ensaios de luminiscência e coloração. A migração de células de câncer de mama em direção a sobrenadantes de cultura de tecidos e fragmentos de tecido ósseo é medida em câmaras de migração Transwell com imagem de bioluminescência. O osso é o local mais frequente de metástase do câncer de mama, e, em última instância, este modelo fornece uma nova janela para o estudo de células de câncer de mama dentro do nicho metastático ósseo.Uma grande vantagem deste modelo é que ele fornece acesso direto ao microambiente de fragmentos de tecido ósseo humano, permitindo-nos observar e analisar facilmente o comportamento das células de câncer de mama durante experimentos de cocultura de curta duração. Este método pode ser usado para estudar questões fundamentais sobre os mecanismos subjacentes ao câncer de mama, metástase para o osso, com o objetivo de identificar estratégias terapêuticas para prevenir e tratar eficazmente essa condição. Embora este modelo possa fornecer informações sobre a metástase do câncer de mama, ele também pode ser utilizado para estudar outras malignidades com tropismo ósseo, como o câncer de próstata.Fragmentos de tecido ósseo devem ser coletados em vários pontos durante cada ensaio. Isso começa com a coleta e o transporte de uma amostra femoral em solução salina e com a preparação da estação de trabalho em uma cabine de segurança biológica usando uma luva cirúrgica. Segure a cabeça do fêmur com uma das mãos e use um instrumental cirúrgico para extrair o osso trabecular.Os fragmentos apresentam cerca de dois a cinco milímetros de tamanho. Pinças não funcionarão nesta etapa. É necessário um bisturi cirúrgico de boa qualidade.Para este experimento, prepare uma suspensão de células de câncer de mama com 100.000 células por 50 microlitros de DMEM acrescido de 10% de FBS. Além disso, prepare tampões de cera óssea para mobilizar os fragmentos ósseos utilizando as extremidades cortadas de uma ponteira de micropipeta, armazenando os tampões em uma placa de Petri. Em seguida, com pinça, transfira os tampões para uma placa de seis poços e, usando uma luva estéril, pressione os tampões na posição das 12 horas.A seguir, pipete 50 microlitros da suspensão celular no centro de cada poço. Coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos por 45 minutos para promover a adesão celular enquanto a placa incuba, extraindo os fragmentos ósseos com as células aderidas à placa. Coloque um fragmento de tecido ósseo na cera óssea em três poços e pressione cada um usando o GER; três poços sem fragmentos servirão como controles.Em seguida, adicione lentamente cinco mililitros de DMEM contendo 10% de FBS à parede de cada poço. O verniz ósseo e os fragmentos ósseos não devem ser deslocados. Incube, então, a cultura por 20 a 24 horas.No dia seguinte, primeiro realize a imagem das células. Adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer a cada poço e, em seguida, imediatamente, image a placa com uma plataforma de imagem Ivis. Este experimento requer uma suspensão de células de câncer de mama como a anterior.Após extrair os fragmentos ósseos, utilize uma pinça para transferir cada fragmento para um poço vazio de uma placa de 24 poços, em seguida, pipete 50 microlitros de suspensão celular diretamente sobre cada fragmento ósseo e transfira a placa para uma estufa por 45 minutos para promover a adesão celular. Uma vez que as células tenham aderido, adicione cuidadosamente um a dois mililitros de meio a cada poço, suficiente para submergir o fragmento ósseo. Em seguida, coloque a placa no incubador de cultura de tecidos por 20 a 24 horas.Como preparação para a imagem Ivis, imagem de fluorescência ou coleta de células da medula para análise por imagem Ivis, transfira os fragmentos ósseos para uma placa de 24 poços com um mililitro de meio fresco por poço. Adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer a cada poço e prossiga conforme descrito anteriormente para microscopia de fluorescência. Pipete cinco microlitros de solução fluorescente de marcação com bisfosfato em cada poço para marcar as espículas ósseas do fragmento ósseo e incube a placa por mais 24 horas.24 horas depois, use pin&ccedil;as para transferir os fragmentos para placas contendo meio livre de vermelho de fenol. Em seguida, observe as placas utilizando um microsc&oacute;pio de fluoresc&ecirc;ncia configurado para imagens em 485 nan&ocirc;metros para localizar c&eacute;lulas de c&acirc;ncer de mama que expressam GFP e em 680 nan&ocirc;metros para identificar esp&iacute;culas &oacute;sseas marcadas com bisfosfato, a fim de esvaziar o compartimento da medula &oacute;ssea para an&aacute;lise do n&uacute;mero ou propriedades das c&eacute;lulas.Transfira um fragmento para um filtro de 70 micrômetros sobre um tubo de 50 mililitros. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros com agulha de 25 graus para lavar vigorosamente o fragmento com 10 mililitros de PBS. Centrifugue a suspensão a 300 ×g durante três minutos à temperatura ambiente para obter o pellet celular; aspire e descarte o sobrenadante.Reciprocione o pellet de células da medula em PBS ou outras soluções desejadas conforme ensaios de citometria de fluxo ou de viabilidade. Comece gerando uma rede de tecido ósseo. Coloque fragmentos de osso nos poços de uma 12.Placa de poços contendo 2,2 mililitros de DMEM com 10% de FBS por poço, deixando alguns poços controle sem fragmentos ósseos. Incube a placa por 24 horas. Em seguida, aspire e substitua o meio e continue o cultivo por mais 24 horas; após 48 horas de cultivo, transfira 0,9 mililitro do sobrenadante para uma placa receptora, incubando temporariamente a placa receptora.Coloque os inserts de transwell em uma placa de 24 poços vazia. Em seguida, plaque 100.000 células de câncer de mama em 350 microlitros sobre cada inserto. Após isso, cultive as placas por 45 minutos para promover a adesão celular. Após 45 minutos, use pinças para transferir os insertos para uma placa receptora.Certifique-se de posicionar os insertos em ângulo ao colocá-los no recipiente. Supine bem para que não se formem bolhas. Em seguida, incube a placa com os insertos por 20 horas a 37 graus Celsius no dia seguinte.Use pin&ccedil;as para remover os insertos e adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer a cada um. Realize a imagem de bioluminesc&ecirc;ncia na placa receptora para detectar c&eacute;lulas de c&acirc;ncer de mama que migraram atrav&eacute;s das membranas e se aderiram ao fundo dos po&ccedil;os da placa receptora. Primeiro, carregue uma placa receptora com meio e coloque-a no incubador de cultura de tecidos.Para semear os inserts. Inverta-os em uma caixa de tubos microfusos vazia com tampa. Em seguida, adicione 100.000 células em 50 microlitros à superfície inferior externa de cada membrana de insert.Cubra a caixa deixando a tampa entreaberta e incube as inserções por 45 minutos no incubador de cultura de tecidos. Em seguida, use pinça para inverter e transferir as inserções, colocando os poços de uma placa receptora dentro de cada copo de inserção com 0,45 mililitros de DMEM contendo 10% de FBS. Depois, adicione um fragmento ósseo de três milímetros ou uma esfera de vidro a cada inserção e incube na placa por 20 horas.No dia seguinte, utilize pinças para transferir os fragmentos e as esferas para uma placa com poços contendo um mililitro de meio fresco. Adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer por poço e prossiga com a imagem de bioluminescência. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.Células de câncer de mama foram cultivadas em co-cultura adjacentes a fragmentos ósseos imobilizados para medir a proliferação das células mamárias. A imagem de bioluminescência após 24 horas de cultivo mostrou proliferação aumentada das células de câncer de mama na presença de fragmentos ósseos nas três primeiras poças, em comparação com a ausência de fragmentos ósseos nas três últimas poças. Os resultados de experimentos utilizando fragmentos de três espécimes cirúrgicos separados mostraram proliferação aumentada na presença em vez da ausência de osso.Em todos os três casos, observou-se, com imagem de bioluminescência após 24 horas, a colonização de células MCF seven F Luke EGFP aderidas diretamente sob fragmentos de tecido ósseo. Um sinal reduzido foi associado à diminuição da densidade de semeadura após 48 horas. Fragmentos semeados diretamente e marcados com reagente bifosfonato revelaram colonização das células de câncer de mama positivas para GFP nos compartimentos mineralizado e medular.Migração das células de câncer de mama através da membrana porosa de migração em direção ao cultivo de tecido ósseo, os sobrenadantes observados nos três poços superiores foram robustos em comparação com a migração para o controle. Meio observado nos três poços inferiores. Também foi observada migração em três fragmentos ósseos de um mesmo espécime de artroplastia total do quadril (THR), enquanto nenhuma migração sobre as microesferas foi observada.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair fragmentos de tecido ósseo humano de um espécime de cabeça femoral e iniciá-los em ensaios de cocultura para medir comportamentos de células de câncer de mama, incluindo migração, colonização e proliferação.

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Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

Este vídeo descreve a cultura de células de câncer de mama adjacentes a explantes ósseos de fêmur para medir a proliferação e colonização de células cancerígenas em um sistema modelo de explante de tecido ósseo humano.

Co-cultura de células BC: Cultura de células de câncer de mama com fragmentos ósseos para estudar a proliferação de células cancerígenas

Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido.

A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por&gt; 6 meses.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Aqui apresentamos um protocolo de co-cultura em três dimensões, que é útil para investigar interações multicelulares e modulação dependente de matriz extracelular do comportamento das células cancerígenas. Neste modelo experimental, as células cancerígenas são cultivadas em géis de colágeno incorporados com fibroblastos associados ao câncer humano.

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Este manuscrito descreve um sistema modelo ex vivo composto de meios condicionados por órgãos derivados do linfonodo, osso, pulmão e cérebro de camundongos. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos no tropismo de órgãos e no comportamento metastático das células cancerígenas.

Geração de mídia e aplicativos Organ-condicionado para o Estudo Influências específicas do órgão em cancro da mama metastático Comportamento

As células cancerígenas são incorporadas em um gel de colágeno e, em seguida, ensanduichadas em um gel de fibrina acelular para gerar um sistema de cultura 3D no qual a invasividade e a formação de tumores satélites podem ser monitoradas.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Há uma necessidade crítica de modelos 3D de câncer que capturem crosstalk heterocelular para estudar a metástase do câncer. Nosso estudo apresenta a geração de estroma-epitelial heteromulticelular em um ambiente scaffold e scaffold-free que pode ser usado para estudar a invasão e as distribuições espaciais celulares.

Células estromais heteromulticelulares em culturas 3D sem andaimes de células epiteliais cancerígenas para impulsionar a invasão

Este protocolo descreve métodos para cultivar, manipular e analisar CAFs murinos, incluindo ensaios funcionais in vitro / in vivo , transcriptômica e análise computacional. Além disso, descreve uma plataforma baseada na web desenvolvida para analisar os transcriptomas publicamente disponíveis de componentes estromais e epiteliais microdissecados por captura a laser de uma coleção de tumores de câncer de mama humano.

Fibroblastos Associados ao Câncer de Tumores Mamários de Camundongos como Ferramentas para Estudos Moleculares e Computacionais

Aprenda métodos para cultivar explantes de tecido ósseo humano e estudar a colonização de células de câncer de mama no nicho metastático ósseo usando imagens de bioluminescência e microscopia de fluorescência.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático (Vídeo) | JoVE Journal

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

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