Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

O objetivo deste procedimento é estudar a proliferação, colonização e migração de células de câncer de mama em um sistema de modelo de explante de tecido ósseo humano. Isso é realizado isolando fragmentos de tecido ósseo trabecular de espécimes cirúrgicos da cabeça do fêmur e cultivando-os com células de câncer de mama que expressam luciferase e proteína verde fluorescente. A imagem de bioluminescência é utilizada para medir a proliferação das células e verificar a colonização das células de câncer de mama nos fragmentos de tecido ósseo.

Padrões de colonização de células de câncer de mama são visualizados por microscopia de fluorescência. O compartimento medular pode ser lavado a partir dos fragmentos para análise por citometria de fluxo, por meio de ensaios de luminiscência e coloração. A migração de células de câncer de mama em direção a sobrenadantes de cultura de tecidos e fragmentos de tecido ósseo é medida em câmaras de migração Transwell com imagem de bioluminescência. O osso é o local mais frequente de metástase do câncer de mama, e, em última instância, este modelo fornece uma nova janela para o estudo de células de câncer de mama dentro do nicho metastático ósseo.

Uma grande vantagem deste modelo é que ele fornece acesso direto ao microambiente de fragmentos de tecido ósseo humano, permitindo-nos observar e analisar facilmente o comportamento das células de câncer de mama durante experimentos de cocultura de curta duração. Este método pode ser usado para estudar questões fundamentais sobre os mecanismos subjacentes ao câncer de mama, metástase para o osso, com o objetivo de identificar estratégias terapêuticas para prevenir e tratar eficazmente essa condição. Embora este modelo possa fornecer informações sobre a metástase do câncer de mama, ele também pode ser utilizado para estudar outras malignidades com tropismo ósseo, como o câncer de próstata.

Fragmentos de tecido ósseo devem ser coletados em vários pontos durante cada ensaio. Isso começa com a coleta e o transporte de uma amostra femoral em solução salina e com a preparação da estação de trabalho em uma cabine de segurança biológica usando uma luva cirúrgica. Segure a cabeça do fêmur com uma das mãos e use um instrumental cirúrgico para extrair o osso trabecular.

Os fragmentos apresentam cerca de dois a cinco milímetros de tamanho. Pinças não funcionarão nesta etapa. É necessário um bisturi cirúrgico de boa qualidade.

Para este experimento, prepare uma suspensão de células de câncer de mama com 100.000 células por 50 microlitros de DMEM acrescido de 10% de FBS. Além disso, prepare tampões de cera óssea para mobilizar os fragmentos ósseos utilizando as extremidades cortadas de uma ponteira de micropipeta, armazenando os tampões em uma placa de Petri. Em seguida, com pinça, transfira os tampões para uma placa de seis poços e, usando uma luva estéril, pressione os tampões na posição das 12 horas.

A seguir, pipete 50 microlitros da suspensão celular no centro de cada poço. Coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos por 45 minutos para promover a adesão celular enquanto a placa incuba, extraindo os fragmentos ósseos com as células aderidas à placa. Coloque um fragmento de tecido ósseo na cera óssea em três poços e pressione cada um usando o GER; três poços sem fragmentos servirão como controles.

Em seguida, adicione lentamente cinco mililitros de DMEM contendo 10% de FBS à parede de cada poço. O verniz ósseo e os fragmentos ósseos não devem ser deslocados. Incube, então, a cultura por 20 a 24 horas.

No dia seguinte, primeiro realize a imagem das células. Adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer a cada poço e, em seguida, imediatamente, image a placa com uma plataforma de imagem Ivis. Este experimento requer uma suspensão de células de câncer de mama como a anterior.

Após extrair os fragmentos ósseos, utilize uma pinça para transferir cada fragmento para um poço vazio de uma placa de 24 poços, em seguida, pipete 50 microlitros de suspensão celular diretamente sobre cada fragmento ósseo e transfira a placa para uma estufa por 45 minutos para promover a adesão celular. Uma vez que as células tenham aderido, adicione cuidadosamente um a dois mililitros de meio a cada poço, suficiente para submergir o fragmento ósseo. Em seguida, coloque a placa no incubador de cultura de tecidos por 20 a 24 horas.

Como preparação para a imagem Ivis, imagem de fluorescência ou coleta de células da medula para análise por imagem Ivis, transfira os fragmentos ósseos para uma placa de 24 poços com um mililitro de meio fresco por poço. Adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer a cada poço e prossiga conforme descrito anteriormente para microscopia de fluorescência. Pipete cinco microlitros de solução fluorescente de marcação com bisfosfato em cada poço para marcar as espículas ósseas do fragmento ósseo e incube a placa por mais 24 horas.

24 horas depois, use pinças para transferir os fragmentos para placas contendo meio livre de vermelho de fenol. Em seguida, observe as placas utilizando um microscópio de fluorescência configurado para imagens em 485 nanômetros para localizar células de câncer de mama que expressam GFP e em 680 nanômetros para identificar espículas ósseas marcadas com bisfosfato, a fim de esvaziar o compartimento da medula óssea para análise do número ou propriedades das células.

Transfira um fragmento para um filtro de 70 micrômetros sobre um tubo de 50 mililitros. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros com agulha de 25 graus para lavar vigorosamente o fragmento com 10 mililitros de PBS. Centrifugue a suspensão a 300 ×g durante três minutos à temperatura ambiente para obter o pellet celular; aspire e descarte o sobrenadante.

Reciprocione o pellet de células da medula em PBS ou outras soluções desejadas conforme ensaios de citometria de fluxo ou de viabilidade. Comece gerando uma rede de tecido ósseo. Coloque fragmentos de osso nos poços de uma 12.

Placa de poços contendo 2,2 mililitros de DMEM com 10% de FBS por poço, deixando alguns poços controle sem fragmentos ósseos. Incube a placa por 24 horas. Em seguida, aspire e substitua o meio e continue o cultivo por mais 24 horas; após 48 horas de cultivo, transfira 0,9 mililitro do sobrenadante para uma placa receptora, incubando temporariamente a placa receptora.

Coloque os inserts de transwell em uma placa de 24 poços vazia. Em seguida, plaque 100.000 células de câncer de mama em 350 microlitros sobre cada inserto. Após isso, cultive as placas por 45 minutos para promover a adesão celular. Após 45 minutos, use pinças para transferir os insertos para uma placa receptora.

Certifique-se de posicionar os insertos em ângulo ao colocá-los no recipiente. Supine bem para que não se formem bolhas. Em seguida, incube a placa com os insertos por 20 horas a 37 graus Celsius no dia seguinte.

Use pinças para remover os insertos e adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer a cada um. Realize a imagem de bioluminescência na placa receptora para detectar células de câncer de mama que migraram através das membranas e se aderiram ao fundo dos poços da placa receptora. Primeiro, carregue uma placa receptora com meio e coloque-a no incubador de cultura de tecidos.

Para semear os inserts. Inverta-os em uma caixa de tubos microfusos vazia com tampa. Em seguida, adicione 100.000 células em 50 microlitros à superfície inferior externa de cada membrana de insert.

Cubra a caixa deixando a tampa entreaberta e incube as inserções por 45 minutos no incubador de cultura de tecidos. Em seguida, use pinça para inverter e transferir as inserções, colocando os poços de uma placa receptora dentro de cada copo de inserção com 0,45 mililitros de DMEM contendo 10% de FBS. Depois, adicione um fragmento ósseo de três milímetros ou uma esfera de vidro a cada inserção e incube na placa por 20 horas.

No dia seguinte, utilize pinças para transferir os fragmentos e as esferas para uma placa com poços contendo um mililitro de meio fresco. Adicione 300 microgramas por mililitro de Lucifer por poço e prossiga com a imagem de bioluminescência. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Células de câncer de mama foram cultivadas em co-cultura adjacentes a fragmentos ósseos imobilizados para medir a proliferação das células mamárias. A imagem de bioluminescência após 24 horas de cultivo mostrou proliferação aumentada das células de câncer de mama na presença de fragmentos ósseos nas três primeiras poças, em comparação com a ausência de fragmentos ósseos nas três últimas poças. Os resultados de experimentos utilizando fragmentos de três espécimes cirúrgicos separados mostraram proliferação aumentada na presença em vez da ausência de osso.

Em todos os três casos, observou-se, com imagem de bioluminescência após 24 horas, a colonização de células MCF seven F Luke EGFP aderidas diretamente sob fragmentos de tecido ósseo. Um sinal reduzido foi associado à diminuição da densidade de semeadura após 48 horas. Fragmentos semeados diretamente e marcados com reagente bifosfonato revelaram colonização das células de câncer de mama positivas para GFP nos compartimentos mineralizado e medular.

Migração das células de câncer de mama através da membrana porosa de migração em direção ao cultivo de tecido ósseo, os sobrenadantes observados nos três poços superiores foram robustos em comparação com a migração para o controle. Meio observado nos três poços inferiores. Também foi observada migração em três fragmentos ósseos de um mesmo espécime de artroplastia total do quadril (THR), enquanto nenhuma migração sobre as microesferas foi observada.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair fragmentos de tecido ósseo humano de um espécime de cabeça femoral e iniciá-los em ensaios de cocultura para medir comportamentos de células de câncer de mama, incluindo migração, colonização e proliferação.