Usando o Eletrorretinograma na Avaliação da Função na Roedor Retina e os efeitos protetores do remoto Limb Pré-Condicionamento Isquêmico

O objetivo geral deste procedimento é testar a função visual em ratos com lesão por luz normal e em ratos submetidos à precondicionamento isquêmico remoto e lesão por luz, utilizando o ERG, demonstrando assim os efeitos protetores da isquemia em membro remoto sobre a retina. Isso é realizado primeiramente escurecendo e adaptando os ratos por 12 horas. O segundo passo é registrar o ERG de adaptação escotópica basal utilizando estímulos de luz LED e um amplificador digital.

Em seguida, submeta os ratos a um estresse retiniano expondo-os à luz intensa contínua. O passo final é comparar os registros de ERG dos ratos com dano induzido pela luz e dos ratos submetidos à isquemia remota de membro, e medir as respostas dos fotorreceptores observadas na onda A e as respostas da retina interna observadas na onda B. Em última análise, o ERG em escotopia é utilizado para avaliar a função visual escotópica.

Portanto, este método pode fornecer informações sobre a neuroproteção baseada em isquemia remota. Também pode ser aplicado a outras formas de lesão e doenças da retina para testes farmacológicos, e para o rastreamento de animais com defeitos visuais. Para iniciar este procedimento, adapte a rata à escuridão por 12 horas, depois anestesie-a com a injeção de uma mistura de cetamina e xilazina.

Uma vez que o animal esteja inconsciente, verifique a profundidade da anestesia pinçando levemente o seu pé para garantir que a resposta reflexa esteja ausente. Em seguida, aplique uma gota de atropina e uma gota de proparacaína na córnea. Corte um fio preto com 10 centímetros de comprimento.

Em seguida, faça um laço com o fio e passe o laço ao redor do equador do olho, ajustando-o levemente para puxar o globo ocular ligeiramente para frente e manter a córnea livre da pálpebra. Posteriormente, aplique colírio carmer nas córneas. Posicione a rata sobre a cama absorvente em cima da plataforma aquecida, com a cabeça colocada na abertura do ganzfeld.

Em seguida, insira a sonda de temperatura interna no reto para garantir que a temperatura corporal seja mantida a 37 graus Celsius e fixe a sonda de temperatura no lugar, prendendo seu cabo à cauda do rato. Depois, insira o eletrodo de referência subcutaneamente na pata traseira. Posicione o eletrodo negativo firmemente na boca para evitar que o eletrodo saia da boca.

Fixe o cabo de conexão a uma superfície estável. Em seguida, posicione o eletrodo positivo sobre o centro da córnea e certifique-se de que o eletrodo toque suavemente a córnea utilizando um micromanipulador. Uma vez que os eletrodos estejam posicionados, cubra todo o conjunto, incluindo o ganzfeld e o animal, com um material opaco para preservar a adaptação à escuridão.

No software de aquisição, defina dois quilohertz como taxa de amostragem, com cinco milissegundos para amostragem pré-coleta e um tempo de coleta de 100 a 1000 milissegundos. Em seguida, configure os filtros passa-banda para um a 1000 hertz e certifique-se de que a amostragem seja acionada por um período de 100 milissegundos após um flash.

Agora, verifique a linha de base da gravação. Ela deve estar livre de ruídos estranhos, mas mostrar o ruído do amplificador e a oscilação respiratória. Em seguida, execute um flash de teste.

Esta é uma forma de onda ERG típica em resposta ao flash de teste. Quando concluído, permita que o animal readapte-se ao escuro por 10 minutos. Em seguida, verifique novamente a linha de base para obter um sinal estável.

Posteriormente, inicie a gravação. Ao final da sessão de gravação, verifique a estabilidade da temperatura corporal do animal. Remova os eletrodos e, em seguida, reaplique o polímero carmer nas córneas. Depois disso, permita que o animal se recupere sobre uma placa aquecida até que esteja totalmente móvel e ativo antes de devolvê-lo à instalação de criação.

Esta figura mostra a medição da onda a e da onda b a partir de um ERG escotópico. O traçado mostrado aqui é registrado da córnea de um olho escotopizado em resposta a um flash brilhante de luz fornecido no momento indicado como T zero. A amplitude da onda a é medida da linha de base até o primeiro vale.

A amplitude da onda B é medida a partir do ponto mínimo da onda A até o pico positivo seguinte. A latência é medida a partir do artefato do estímulo até o ponto de interesse no traçado, como o ponto mínimo da onda A. O sinal bruto de ERG dominado aumenta com o aumento do estímulo luminoso.

Uma onda torna-se aparente em aproximadamente 0,4 logs de candelas escotópicas por segundo por metro quadrado, e o paradigma do estímulo duplo tem sido utilizado para separar o sinal misto do ERG em respostas de cones e bastonetes. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até 30 minutos.