Name: Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a realizar análise eletroretinográfica em larvas de peixe-zebra usando micromanipulação precisa. Este método permite avaliar a função visual in vivo no modelo Danio rerio.

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Agradecemos aos membros da instalação de aquicultura de peixe-zebra da UNC pela manutenção do peixe-zebra. Também gostaríamos de agradecer à Diagnosys, LLC pela assistência na configuração do aparelho ERG. Agradecimentos adicionais vão para a Dra. Portia McCoy e o laboratório do Dr. Ben Philpot pela assistência com os métodos eletrofisiológicos. Também gostaríamos de agradecer a Lizzy Griffiths por sua ilustração de um peixe-zebra larval. Este trabalho foi apoiado pelos prêmios F32 EY022279 do National Institutes of Health (para JDC) e R21 EY019758 (para EW).

Manutenção de animais e protocolos experimentais foram aprovados pelos cuidados e uso Comitês da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill Animais Institucional, e atender a todas as necessidades do Gabinete NIH of Laboratory Animal Welfare e da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International. NOTA: Para obter larvas para análise ERG, publicado protocolos para criação de peixe-zebra padrão e manutenção foram empregados 18. As larvas são obtidas através da reprodução natural e alojados sob um ciclo claro / escuro de 10 horas 14 horas de luz. Este protocolo foi optimizado para as larvas em 5-7 dias pós-fertilização (DPF), mas poderia idealmente ser realizada em peixes mais velhos com pequenas modificações para o procedimento. Aqui, use a tensão TL de tipo selvagem larvas do peixe em 5 dpf. 1. Micropipeta Produção <ol><li> Puxe vários micropipettes usando 1,5 x 0,86 milímetros (diâmetro externo de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato polido-fogo comfilamento (temperatura de fusão, 821 ° C) e um P-97 Flaming / Brown Micropipeta extrator equipado com filamento caixa calor. Usar o programa para formar micropipetas descritos na Tabela 1. </li><li> Verifique cada micropipeta sob um microscópio com um governante graticule adequadas para garantir que as pontas são de 10-15 m de diâmetro e tem uma abertura de ponta suave (ou seja, sem bordas irregulares). </li><li> Armazenar cuidadosamente micropipetas para evitar danos ponta e exposição ao pó. As opções de armazenamento incluem placas de Petri com fita laboratório, caixas forradas com espuma, ou recipientes de armazenamento micropipeta comercialmente disponíveis. NOTA: Outros puxadores de micropipeta de vidro capilares e podem ser usadas, desde que o diâmetro correcta da micropipeta e uma ponta de alta qualidade seja atingido. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pressão </td><td> Calor </td><td> Puxe </td><td> Velocidade </td&gt; <td> Tempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Programa para a produção de micropipetas usando um P-97 flamejante / castanho Micropipeta Puller equipado com um filamento caixa de calor são feitas usando micropipetas de 1,5 x 1,0 mm2 (diâmetro exterior de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato-polidas ao fogo, com filamentos. (temperatura de fusão, 821 ° C). 2. Preparação Tampão <ol><li> Use filtrada, tampão oxigenado de Ringer peixe 19 no capilar de microeléctrodos e para saturar a esponja de álcool polivinílico (PVA), sobre o qual as larvas são colocadas para experiências. Como alternativa, use E3<html> meios de embrião ou de Solução Salina Equilibrada de Hank. </li><li> Preparar a solução de Ringer 10x peixe, tal como descrito na Tabela 2. Ajustar a pH 7,8, esterilizar e utilizando um filtro de 0,22 um e armazenar o estoque de 10x a 4 ° C. </li><li> Criar uma solução de trabalho no dia do experimento, diluindo a solução 10x de Ringer para 1x com água deionizada, destilada. Filtrar através de um sistema de filtro de 0,22 um. Composto oxigenado por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2 gasoso durante 10 minutos. Cap firmemente depois de assegurar que a solução permanece oxigenado. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Quadro 2: Preparação de solução 10x peixinho de Ringer. 3. Eletrorretinograma Platform <ol><li> Realizar experiências ERG sobre uma mesa de anti-vibração no interior de uma gaiola de Faraday para melhorar a relação sinal-ruído. Anexar uma plataforma de aço sob encomenda para a mesa de anti-vibração utilizando porcas. Coloque uma plataforma móvel de plástico com um polímero uretano de absorção de choque inferior viscoelástico sobre a mesa sob a fonte de luz. </li><li> Posicione a câmera com um stand magnetizado, voltado para baixo, para a plataforma móvel de plástico. Posicione o micromanipulator (que vai realizar a gravação de microeletrodos) com um segundo posto magnetizado para a direita da plataforma de plástico móvel. Assegure-se que a câmara e micromanipulador não será perturbada pelo movimento de outros equipamentos e que não bloqueiam a iluminação proveniente da fonte luminosa. </li><li> Ligue a câmara a um monitor de vídeo e posicioná-la para ver o olho dolarva para colocar o eletrodo na posição adequada. </li><li> Certifique-se de que a instalação esteja devidamente aterrado com fio de cobre. Para verificar o barulho, coloque o eletrodo de referência e na ponta do microeletrodos de gravação em um prato de 35 milímetros Petri preenchido com solução de Ringer. Verifique os níveis de ruído elétrico da instalação com um osciloscópio ou um recurso embutido do aparelho ERG. Os níveis de ruído não deve ser mais do que ± 10 mV a partir da linha de base. </li></ol> 4. Esponja Preparação <ol><li> Corte um retângulo pequeno de esponja de PVA seco que vai caber confortavelmente em uma placa de Petri de 35 mm. A espessura da esponja não deve ser maior do que a profundidade do prato. Use uma faca com uma lâmina de barbear limpa para o corte. </li><li> Realizar uma redução adicional na esponja para acomodar o eléctrodo de referência (ou um corte raso longitudinalmente na parte inferior da esponja ou uma borboleta cortado verticalmente através de uma das extremidades mais pequenas). </li><li> Use um marcador resistente a produtos químicospara marcar um pequeno ponto na esponja (onde a larva será colocado) que pode ser utilizado para posicionar a câmara. </li><li> Mergulhe a esponja PVA na solução de Ringer até à saturação. Retire e seque rapidamente sobre uma toalha de papel 2-3 vezes. Coloque a esponja em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri. </li><li> Posicionar a placa de Petri contendo a esponja sobre a plataforma de plástico de modo a que a marca pode ser visualizado pela câmara. </li></ol> 5. Preparação Eletrodo NOTA: A configuração do peixe-zebra consiste em um eléctrodo de referência em contacto com a solução saturada de PVA a esponja de Ringer e um eléctrodo de gravação em contacto com a córnea. O eletrodo de referência é constituído por uma pelota de Ag / AgCl. O eléctrodo de registo de uma micropipeta de vidro é puxado cheio com solução de Ringer e realizada por um suporte de microeléctrodo contendo um fio de Ag. <ol><li> Do cloreto de eletrodos, mergulhando-os em solução de hipoclorito de sódio a 6-9% (água sanitária) para 5 min (a micr gravaçãowire oelectrode) ou 15 minutos (o eletrodo de referência). Ar seco sobre um Kimwipe durante 5 min. <ol><li> Dependendo do estilo do corte feito no Passo 4.2, coloque o pellet Ag / AgCl do eletrodo de referência em (para o corte borboleta vertical) ou menos (para o corte raso longitudinal na parte inferior) da esponja. Fixe o cabo-eletrodo de referência para o sistema de gravação. </li><li> Alternativamente, se a configuração do ERG tem limitações de espaço ou não são particularmente fortes artefatos fotovoltaicos do eletrodo Ag / AgCl, conecte o eletrodo de referência para a esponja através de uma ponte de sal agar para mover o eletrodo para fora do caminho da luz. </li></ol></li><li> Anexar ~ 40 cm do tubo de tamanho adequado para a 5 ml de não-bloqueio Luer da seringa. Encha a seringa com solução de Ringer. Titulares microeletrodos que possuem portas de pressão são tipicamente enviados com adaptadores para acomodar tubos com diâmetros internos de 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;ou 5/32&quot;. </li><li> Encha um 1 ml Luer não seringa fechadura comSolução de Ringer e, usando um Micro-fil, preencha cuidadosamente o suporte de microeletrodos. Evitar a formação de bolhas. </li><li> Fixe a seringa de 5 ml para a porta de pressão do titular do microeletrodos com tubulação e usá-lo para garantir que o titular da microeletrodos está cheio de solução de Ringer. Usando o Micro-fil e 1 ml cheia com solução de Ringer, encher o copo micropipeta a partir da ponta e assegurar que não há bolhas de ar. </li><li> Fixe a micropipeta de vidro para o titular da microeletrodos, tendo o cuidado de manter a linha reta fio do eletrodo. Uma vez garantido, a utilizar seringa de 5 ml para forçar cuidadosamente solução de Ringer através do microeléctrodo até que uma pequena quantidade de solução é visível na ponta. Aplicação ocasional de pressão para a seringa (não quando aplicado a córnea) vai impedir a formação de bolhas de ar, bem como oclusões devido à acumulação de pó ou sal, na ponta da micropipeta. <ol><li> Se a solução sai como uma corrente, substituir o gmicropipeta moça, como a abertura da ponta é muito grande ou está danificado. </li></ol></li><li> Com cuidado, coloque o microeletrodos de gravação no micromanipulator e anexar a liderança para o sistema de gravação. </li></ol> 6. Análise Eletroretinograma NOTA: Devido ao predomínio cone da retina larval, os resultados do ERG de alta qualidade pode ser obtido quando os preparativos para a gravação são realizadas sob baixos níveis de luz branca indireta (&lt;1 lux) ou com curtos períodos de tempo (&lt;1 min) de maior intensidade ( ≤250 lux) luz de trabalho. Um curto período de adaptação ao escuro ainda é necessária antes da gravação (veja o passo 6.7). No entanto, experimentos podem ser realizados sob luz vermelha ou infravermelha dim usando uma câmera infravermelha de minúsculas. Todos os experimentos foram realizados em esterilizada por filtração (0,22 mm) de água do sistema do Mecanismo UNC Zebrafish aquicultura mas a mídia embrião alternativos podem ser utilizados. <ol><li> Corte quadrados de papel toalha medindo aproximadamente 1cm 2. </li><li> Se a medição potencial de receptor isolado massa cone, incubar 3-5 larvas em água do sistema com 500 uM (±) -2-4-Amino-phosphonobutyric ácido (APB) durante 5 min. NOTA: Enquanto APB é uma mistura racémica do composto activo (G) e inactivos formas de AP4 (R), é tão eficaz como a L-AP4 e é menos dispendiosa. </li><li> Anestesiar 3-5 larvas em água sistema com 0,02% (w / v) tricaina até sem resposta, cerca de 1-2 min. </li><li> Use uma bomba de pipeta e pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente larvas indivíduo para quadrados de papel toalha sob um estereoscópio dissecando com uma iluminação mínima (≤250 lux para &lt;1 min). Verifique a posição de cada larva e escolher um candidato que é lateral-se dorsal com um olho não obstruído. <ol><li> Para gravações prolongados (&gt; 30 min), manter a larva úmida por vidros do corpo até, mas não incluindo a cabeça com 3% de metilcelulose usando um pincel fino de pêlo de camelo. </li></ol></li><li> Utilizando uma pinça, transferir o squar toalha de papele com a larva à esponja úmida PVA. <ol><li> Para as gravações prolongados (&gt; 30 min), aplicar um fluxo contínuo de água saturado de 100% de O2 do gás através da larva, fazendo borbulhar o gás através de um difusor em um frasco de braço lateral contendo água destilada. Posicione o tubo que sai do lado do braço balão que transmite o oxigênio umidificado perto da cabeça do larva. NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo irá prolongar a vida do peixe 16. </li></ol></li><li> De acordo com um mínimo de iluminação, use o micromanipulator e câmera para posicionar a ponta de microeletrodos no ponto médio entre o nasal e extremidades caudais do olho e pressione suavemente sobre o limite dorsal da córnea. NOTA: Extravio da ponta do eletrodo para as áreas muito distantes da córnea pode resultar em formas de onda ERG de polaridade invertida. </li><li> Permitir larva para dark-se adaptar para 5-10 min. </li><li> Registrar as respostas flash de teste a luz fornecida a partir de uma fonte de luz LED ou estimulador ótico usando o avaiestimulação e gravação de equipamentos lable. Ajuste os parâmetros do protocolo, como a intensidade do flash, comprimento flash, cor flash, intensidade de fundo e configurações de cores e filtros para atender o experimento. </li><li> Quando terminar com o experimento, a eutanásia larvas de acordo com as diretrizes AVMA / IACUC. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo um procedimento simples para gravações ERG de peixe-zebra larval é detalhado. Este procedimento permite uma análise rápida e abrangente de function.There visual são vários passos críticos em todo o procedimento que deve ser mantido em mente. O larvas do peixe deve ser saudável antes do experimento para impedir a morte durante os tratamentos potenciais da droga e garantir meios de subsistência prolongada durante as gravações do ERG. Além disso, é importante que as larvas utilizadas nas experiências são es...

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo electrofisiológico que tem sido amplamente utilizado na clínica para determinar a função da retina em seres humanos. A actividade eléctrica em resposta a um estímulo de luz é medida colocando os eléctrodos de gravação sobre a superfície externa da córnea. As características do paradigma do estímulo e a resposta forma de onda de definir os neurónios da retina que contribuem para a resposta. Este método foi adaptado para utilização com um número de modelos animais, incluindo ratinhos e peixes-zebra. A resposta típica do ERG vertebrado tem quatro componentes principais: a uma onda, que é um potencial negativo córnea provêm de uma actividade celular de fotorreceptores; da onda b, um potencial positivo córnea derivado da EM células bipolares; a-d onda, um potencial positivo córnea interpretado como a actividade das células bipolares Off; e o c-ondas, que ocorre alguns segundos após a onda b e reflecte a actividade em Müller glia e a retinal epitélio pigmentar 1-4. Referências adicionais para a compreensão da história e os princípios de análise ERG em humanos e animais modelo são o livro on-line, WebVision, da Universidade de Utah e textos como os Princípios e Práticas de Eletrofisiologia Visual Clínica 4, 5. Danio rerio (peixe-zebra) tem sido favorecido como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à sua rápida maturação e transparência, o que permite uma análise morfológica não invasivo dos sistemas de órgãos, e ensaios comportamentais e inverso telas genéticos (para revisão, ver e Fadool Dowling 6). Larvas do peixe são altamente passíveis de manipulação genética e farmacológica, que, quando combinada com sua alta fecundidade, torná-los um modelo animal excelente para análises biológicas de alto rendimento. A maior proporção de cones para hastes no peixe-zebra larval - cerca de 1: 1 em comparação com os ratinhos (~ 3% de cones) - os tornam particularmente úteis para o estudo da função dos cones 7-9. Na retina de vertebrados, cones desenvolver antes de hastes 10. Curiosamente, cones de peixe-zebra são operativas logo em 4 dpf, permitindo a análise eletrofisiológica seletiva de cones nessa fase 6, 11,12. Em contraste, as respostas de ERG em hastes aparece entre 11 e 21 dpf 13. Portanto, larvas do peixe em 4-7 dpf servir funcionalmente como uma retina all-cone. No entanto, o photopic ERG resposta nativo de 4-7 larvas dpf é dominado pela onda b. Aplicação de agentes farmacológicos, tais como a L - (+) - 2-amino-4-butírico-ácido fosfono (L-AP4), um agonista para o receptor de glutamato metabotrópico (mGluR6) expressa pela SOBRE células bipolares, bloqueia eficazmente a geração da onda b e revela o potencial isolado massa cone receptor, (a &quot;uma onda&quot;) 14-17. Aqui nós descrevemos um simples e reliable método para análise do ERG usando equipamentos disponíveis comercialmente ERG concebido para utilização com ratos que foram adaptados para uso com larvas de peixes-zebra. Este sistema pode ser utilizado em larvas do peixe de diferentes origens genéticas, bem como aqueles tratados com agentes farmacológicos, para ajudar os investigadores na identificação de vias de sinalização que contribuem para a sensibilidade visual e adaptação de luz 16. Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo vai orientar os pesquisadores no uso de análise ERG para responder a uma variedade de questões biológicas relacionadas à visão, e demonstrar a construção de uma configuração flexível ERG.

<table><tbody><tr><td>Gaiola Faraday</td><td>80/20 Inc</td><td>personalizado</td><td>"Conjunto de Eretor Industrial" de alumínio personalizado para estrutura de gaiola</td></tr><tr><td>Esponja PVA</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Fornece uma plataforma macia e úmida para colocação de larvas de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Sistemas de filtro estéril de 150 ml</td> Soluções de filtragem de <td>431154 Corning</td><td></td><td>para evitar que pequenas articulações bloqueiem micropipetas</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Contato Diagnosys, LLC</td><td></td><td>Sistema modular de eletrofisiologia capaz de gerar estímulos visuais para qualquer estimulador e gravação digital e análise de respostas usando software proprietário, mais informações em http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Contato Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td></td><td>Estimulador de luz com LED RGB e fontes de luz de xenônio para Ganzfeld ERG, mais informações em http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Segurar e posicionar o microeletrodo de gravação</td></tr><tr><td>Suporte de anel magnético</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Segurar e posicionar a câmera e o eletrodo de referência</td></tr><tr><td>Extensões de eletrodo</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Cabos de chumbo sobressalentes fêmea para macho de 1,5 mm para conectar eletrodos</td></tr><tr><td>Pino macho para fêmea Adaptador SAFELEAD Grass</td><td>Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Conectando pinos de 2 mm a pinos de cabeceira de 1,5</td></tr><tr><td>Moldura de tela de janela (metal) e ranhura</td><td>Lowes ou Home Depot</td><td>vários</td><td>Para fixar malha de cobre à estrutura da gaiola de Faraday</td></tr><tr><td>Filtros Steriflip 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Soluções de filtragem para evitar que pequenas articulações bloqueiem micropipetas</td></tr><tr><td>Adaptador BNC</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Conectando câmera ao cabo BNC</td></tr><tr><td>Cabo BNC</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Conectando a câmera ao adaptador de vídeo Lente</td></tr> da <tr><td>câmera</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizando o posicionamento do microeletrodo de gravação na córnea larval</td></tr><tr><td>Acoplador da câmera</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizando o posicionamento do microeletrodo de gravação na córnea larval</td></tr><tr><td>Luna Conversor BNC para VGA + HDMI</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>Adaptador BNC para VGA que permite que a imagem da câmera seja projetada no monitor do computador</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>agonista mGluR6, bloqueia a onda b permitindo a análise do potencial receptor de massa do cone isolado</td></tr><tr><td>Vidro borossilicato</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Vidro borossilicato polido a fogo (temperatura de medição = 821&deg; C) com filamento e dimensões de 1,5mm x 0,86 mm (diâmetro externo por diâmetro interno)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Extrator flamejante/marrom</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Para puxar micropipetas de vidro</td></tr><tr><td>Folha de Sorbothane</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Polímero de uretano viscoelástico sintético, colocado sob Montagens de Isolamento Passivo e plataforma ERG para absorver choques e evitar escorregamentos, pode ser cortado à medida</td></tr><tr><td>Placa de ensaio</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Plataforma de isolamento de vibração para estimulador ERG e espécime</td></tr> <tr><td>de peixe-zebraMontagens de isolamento passivo</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Fornece isolamento de vibração para placa de ensaio</td></tr><tr><td>Malha de cobre</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td> Para revestir a bomba de pipeta <td>de gaiola de Faraday</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Usado com pipetas Pasteur para transferir cuidadosamente larvas de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Usado com bomba de pipeta para transferir cuidadosamente larvas de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizando o posicionamento do microeletrodo de gravação na córnea larval</td></tr><tr><td>Tricaína (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Anestésico de grau farmacêutico,Micro-fil</td></tr> <tr><td></td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Suporte de microeletrodo de enchimento e vidro de microeletrodo</td></tr><tr><td>Suporte de microeletrodo</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Segura microeletrodo de vidro, conecta-se ao equipamento ERG</td></tr><tr><td>Eletrodo de referência</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Quebre cuidadosamente o último centímetro do invólucro para drenar o eletrólito e exponha o eletrodo de pellets Ag/AgCl sinterizado</td></tr><tr><td>Eletrodo de referência (alternativa)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternativa ao DRIREF-5SH. Eletrodo Ag/AgCl que deve ser conectado/soldado ao cabo de conexão</td></tr><tr><td>Cabo de baixo ruído para suporte de microeletrodo</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Conectando o suporte de microeletrodo de gravação ao adaptador/cabeceira</td></tr></tbody></table>

eletrorretinograma análise da visual response no peixe-zebra larvas

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo para a determinação electrofisiológico da função retiniana. Através da colocação de um eléctrodo sobre a superfície da córnea, a actividade eléctrica gerada em resposta à luz pode ser medido e utilizado para avaliar a actividade das células da retina in vivo. Este manuscrito descreve o uso do ERG para medir a função visual em peixe-zebra. Zebrafish têm sido utilizada como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à facilidade de supressão do gene por oligonucleótidos morfolino e manipulação farmacológica. Em 5-10 dpf, apenas cones são funcionais na retina das larvas. Por isso, o peixe-zebra, ao contrário de outros animais, é um sistema poderoso modelo para o estudo da função visual cone in vivo. Este protocolo utiliza anestesia standard, micromanipulação e protocolos lupa estereoscópica que são comuns em laboratórios que realizam pesquisa de peixe zebra. Os métodos descritos fazer uso de eq eletrofisiologia padrãouipment e uma câmera de luz baixa para orientar o posicionamento da microeletrodos gravação sobre a córnea larval. Finalmente, é mostrado como um ERG estimulador / gravador comercialmente disponível originalmente concebido para ser utilizado com os ratos podem ser facilmente adaptados para uso com o peixe-zebra. ERG de peixe-zebra larval proporciona um excelente método de ensaio de função visual cone em animais que tenham sido modificadas por morfolino injecção de oligonucleótidos, bem como mais recentes técnicas de engenharia do genoma, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), activador de transcrição-Como efector As nucleases (TALENS), e Agrupamentos regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete (CRISPR) / Cas9, todos os quais têm aumentado consideravelmente a eficiência e eficácia do gene alvo em peixes-zebra. Além disso, tirar vantagem de a capacidade de agentes farmacológicos para penetrar larvas de peixes-zebra para avaliar os componentes moleculares que contribuem para o foto-resposta. Este protocolo descreve uma instalação que pode ser modificado e utilizado pelos investigadorescom vários objetivos experimentais.

Normalmente, ERGs são registrados a partir de larvas do peixe em 5 dpf, uma vez que uma série de estudos publicados gravações ERG, nesta fase, 9, 16,20. Respostas larval foram medidos em condições de adaptação ao escuro, sem iluminação de fundo usando a 20 ms estímulo de luz LED branco. Utilizamos um sistema ERG comercialmente disponível consiste em um estimulador luz Ganzfeld e computador controller / gravador. O estimulador utiliza um sistema de modulação de largura de pulso rigidamente controlado proprietá...

Apresentamos um método para a análise eletrorretinográfica (ERG) de larvas de peixe-zebra utilizando técnicas de micromanipulação e eletrorretinografia. Este é um método simples e direto para testar a função visual de larvas de peixe-zebra in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

O objetivo geral deste procedimento é ilustrar os passos necessários para realizar análise eletrográfica em peixes-zebra larvais. Isso é realizado primeiramente gerando micro pipetas de vidro com a forma e o tamanho apropriados. O segundo passo é configurar cuidadosamente os equipamentos essenciais ao experimento, como os eletrodos de referência e de registro.Em seguida, a larva de peixe-zebra é anestesiada e corretamente orientada em relação ao equipamento de estimulação e registro. O passo final é o posicionamento adequado do microeletrodo de vidro sobre a córnea da larva de peixe-zebra. Em última análise, larva de peixe-zebra.A análise de ERG é útil para investigar a função visual dos cones na retina de vertebrados exclusivamente cones in vivo. Este método é muito útil para responder perguntas fundamentais na área da ciência da visão, como a identificação de vias de sinalização que contribuem para a sensibilidade visual e a adaptação à luz nos cones. A demonstração visual deste método é essencial, pois o posicionamento adequado do microeletrodo de gravação sobre o espécime é difícil de aprender devido ao pequeno tamanho do olho de peixe-zebra larval.Para iniciar este procedimento, puxe várias micropipetas utilizando capilares de vidro borossilicato com filamento, polidos com chama. Verifique cada micropipeta ao microscópio com uma régua graduada apropriada para garantir que o diâmetro da ponta esteja entre 10 e 15 micrômetros e apresente aspecto uniforme. Prepare uma solução de trabalho no dia do experimento diluindo a solução de Ringer 10x até 1x.Com filtro de água destilada desionizada, esterilize a solução para garantir que partículas não obstruam a ponta da micropipeta. Em seguida, oxigene com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos. Tampe a solução firmemente em seguida para garantir que ela permaneça oxigenada.Agora, coloque uma plataforma plástica móvel com uma base amortecedora de choque de polímero uretânico viscoelástico sobre a mesa antivibratória, posicionada abaixo da fonte de luz. Em seguida, posicione a câmera com um suporte magnetizado e direcione-a para a plataforma plástica móvel. Depois, posicione o micromanipulador do microeletrodo de gravação sobre um segundo suporte magnetizado.Certifique-se de que a câmera e o micromanipulador não sejam perturbados pelo movimento de outros equipamentos e não obstruam a iluminação da fonte de luz. Em seguida, conecte a câmera a um monitor de vídeo e posicione-a em direção à plataforma. Certifique-se de que a montagem esteja corretamente aterrada com fio de cobre.Nesta etapa, corte um pequeno retângulo de esponja de PVA seca que se encaixe firmemente em uma placa de Petri de 35 milímetros usando uma lâmina de barbear limpa. Faça um corte adicional na esponja para acomodar o eletrodo de referência. Em seguida, use uma caneta resistente a produtos químicos para marcar um pequeno ponto na esponja no local onde a larva será colocada.Em seguida, mergulhe a esponja de PVA na solução de Ringer até ficar saturada. Retire-a e seque-a rapidamente em uma toalha de papel duas a três vezes antes de colocá-la em uma placa de Petri limpa de 35 milímetros. Posteriormente, posicione a placa de Petri contendo a esponja sobre uma plataforma de plástico de modo que a marcação possa ser visualizada pela câmera.Em seguida, clorifique os eletrodos mergulhando-os em uma solução de 6 a 9% de cloreto de sódio. Depois, seque-os ao ar sobre uma toalha de papel Kim por cinco minutos. Coloque o pellet de prata/cloreto de prata do eletrodo de referência dentro ou sob a esponja, dependendo do tipo de corte feito, e conecte o cabo do eletrodo de referência ao sistema de gravação.Em seguida, acople aproximadamente 40 centímetros de tubo a uma seringa de cinco mililitros com fechamento por encaixe e encha a seringa com solução de Ringer. Depois, encha uma seringa de um mililitro com fechamento por encaixe com solução de Ringer. Usando um microfill, encha cuidadosamente o suporte do microeletrodo e evite a formação de bolhas.Em seguida, conecte a seringa de cinco mililitros ao orifício de pressão do suporte do microeletrodo com tubo utilizando o microfill e uma seringa de um mililitro cheia com solução de Ringer. Encha a micropipeta de vidro a partir da ponta e certifique-se de que não haja bolhas presentes. A seguir, conecte a micropipeta de vidro ao suporte do microeletrodo e tenha cuidado para manter o fio do eletrodo reto.Uma vez fixado, utilize a seringa de cinco mililitros para forçar cuidadosamente a solução de Ringer através do microeletrodo até que uma pequena quantidade da solução seja visível na ponta. Agora, coloque cuidadosamente o microeletrodo de gravação no micromanipulador e conecte o cabo ao sistema de gravação para verificar a presença de ruídos no sistema. Coloque o eletrodo de referência e a ponta do microeletrodo de gravação em uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de solução de Ringer.Verifique os níveis de ruído elétrico da configuração com um osciloscópio ou com uma função embutida do aparelho de ERG. Os níveis de ruído não devem ultrapassar mais ou menos 10 microvolts em relação à linha de base. Neste procedimento, corte vários quadrados de papel-toalha de um centímetro quadrado, anestesie três a cinco larvas em uma placa de Petri de 35 milímetros adicionando trica até uma concentração final de 0,02% e aguarde um a dois minutos.Em seguida, transfira cuidadosamente uma larva individual para um quadrado de papel toalha sob um estereoscópio de dissecação com iluminação mínima. Verifique a posição das larvas, escolhendo uma larva com o lado dorsal voltado para cima e com o olho ocluído para sessões de gravação que durem mais de 30 minutos. Mantenha a larva úmida, aplicando 3% de metilcelulose sobre o corpo com um pincel de pêlo de camelo fino.Em seguida, transfira o quadrado de papel-toalha com a larva para a esponja de PVA úmida. A seguir, aplique um fluxo contínuo de água saturada com oxigênio a 100% sobre as larvas, borbulhando o gás através de uma pedra difusora em um frasco de braço lateral contendo água destilada. Posicione o oxigênio umidificado proveniente do braço lateral do frasco próximo à cabeça da larva, utilizando tubos, sob iluminação mínima.Use o micro manipulador e a câmera para posicionar a ponta do microeletrodo no ponto médio entre as extremidades nasal e caudal do olho e pressione suavemente sobre o limite dorsal da córnea. Deixe as larvas se adaptarem ao escuro por cinco a dez minutos. Em seguida, registre as respostas ao estímulo luminoso fornecido por uma fonte de luz LED ou estimulador óptico.Esta figura mostra um registro típico de ERG em larvas de peixe-zebra com cinco dias pós-fertilização. Os peixes adaptados ao escuro foram expostos à luz branca de LED por 20 milissegundos, com intensidades variando de um a 5.000 canula por metro quadrado, sendo o início do estímulo luminoso no zero segundo. O potencial negativo da onda a é difícil de distinguir, enquanto o potencial positivo da onda b é o pico dominante da forma de onda.Este quadro mostra as amplitudes médias das respostas da onda B ajustadas utilizando a equação de NACA. Esta figura apresenta um registro típico de ERG em um peixe-zebra larval de cinco dias pós-fertilização (DPF), escurecido e tratado com PB. Os peixes foram expostos à luz branca de LED durante 20 milissegundos, com intensidades variando de 1 a 5.000 canela por metro quadrado, e o potencial receptor de cones isolado é o elemento dominante da forma de onda. Este quadro mostra as amplitudes médias de resposta de um peixe-zebra larval tratado com PB, ajustadas utilizando a equação de NACA.Esta figura mostra um registro típico de ERG em uma larva de peixe-zebra tratada com cinco D-P-F-A-P-B. Utilizando um paradigma de duplo flash. Os peixes adaptados à escuridão são expostos a luz branca sucessiva de 20 milissegundos.Os flashes de LED possuem uma intensidade de 1000 canula por metro quadrado, e o ISI entre os flashes é de dois segundos. O início de cada estímulo luminoso é indicado aqui. Esta figura mostra a razão entre a resposta máxima do potencial do receptor de massa do cone isolado do segundo estímulo e a do estímulo inicial com o aumento do ISI, o que indica a recuperação progressiva da sensibilidade dos fotorreceptores.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade das gravações é determinada pela integridade da conexão entre o eletrodo e a córnea e pela saúde das larvas. O desenvolvimento desta técnica aumentou significativamente a capacidade dos pesquisadores nas ciências da visão de explorar a adaptação e recuperação dos cones na retina de vertebrados in vivo.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós desenvolvemos o Response Visual-Motor para quantificar a saída do motor de zebrafish larval em resposta aos aumentos de luz e diminui. Também examinamos os mutantes visão zebrafish, incluindo a resposta não optocinético (NRC) mutantes, que foram pensados ​​para serem completamente cego quando testado por um outro ensaio de visão, o reflexo optocinético.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

Optocinético resposta tem sido amplamente utilizada para avaliar as funções visuais de zebrafish larval. No entanto, o protocolo padrão para larvas de peixes ainda não é facilmente aplicável em...

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

O VisioTracker é um sistema automatizado para a análise quantitativa do desempenho visual de peixes adultos e larvas pequeno baseado no registro dos movimentos oculares. Ele possui total controle sobre propriedades de estímulo visual e análise em tempo real, permitindo alto rendimento de pesquisa em campos como o desenvolvimento do sistema visual e função, farmacologia, estudos de circuitos neurais e integração sensório-motora.

VisioTracker, uma abordagem inovadora Automatizada de Análise Oculomotor

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Ensaio de resposta optocinética: um método para medir a acuidade visual em peixe-zebra

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Aqui, apresentamos um protocolo que simplifica a medição de luz electroretinogram evocado respostas de zebrafish larval. Um eletrodo de esponja-ponta cónica romance pode ajudar a tornar o estudo de desenvolvimento visual no zebrafish larval usando o electroretinogram ERG mais fácil de conseguir com resultados confiáveis e menor custo.

Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

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Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

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