Name: Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a criar um modelo de xenoenxerto de mieloma múltiplo humano em embriões de galinha para estudar crescimento tumoral, invasão e angiogênese. Este método permite triagem rápida de fármacos anticâncer em ambiente 3D.

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Os autores querem agradecer à Sra. Cornelia Heis por sua excelente assistência técnica em imuno-histoquímica e preparação de embriões de galinha. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Austríaco para a Ciência (FWF Grant No. P19552) e pela União Europeia (EU FP7 project Optatio No: 278570).

De acordo com o direito austríaco, e do Gabinete do Laboratório Animal Welfare dos EU Public Health Service embriões de aves não são considerados como animais vertebrados vivos até hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare providenciou orientações escritas neste domínio (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm e Publicação NIH Nº .: 06-4515). 1. celular Cultura e Lentivirus Transfection <ol><li> Cultura linhas celulares MM OPM-2, meio RPMI-8226 e as células estaminais mesenquimais humanas a partir de medula óssea em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal de vitelo e 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM na presença de 5% de CO2 a 37 ° C. </li><li> Transfectar 5 x 10 6 células HEK 293FT com mistura de ADN virai de embalagens (9 g) e 3 ug pLenti6 / V5 dest eGFP vector através da utilização de 30 ul de reagente de transfecção lipossómica e meio de transfecção (10 mL). Remover o meio de transfecção após 12 h eadicionam-se 10 ml de meio DMEM com 10% de soro de bezerro de bovino e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA). </li><li> Após 5 dias, recolher sobrenadantes de células HEK293FT após a centrifugação das células de natação (1000 xg, 5min). Determinar título viral por PCR em tempo real como descrito noutros locais 28. </li><li> Transfectar 1 x 10 6 culas de MM com partículas lentivirais eGFP (1 x 10 5) partículas em uma placa de 24 poços em meio de crescimento completo. Após 3 dias, iniciar o processo de selecção por adição de 2 ug / ml de blasticidina para o meio de cultura. Para o lentivírus eGFP disponível comercialmente, utilizar 500 ug / ml de neomicina. </li><li> Após 2 semanas de selecção, aglomerados de células que expressam eGFP MM irá aparecer; coletar células por centrifugação (1000 x g, 5 min) e expandi-los como OPM-2 eGFP e RPMI-8226 sublinhas eGFP para experimentos (seção 2 e 3). </li></ol> 2. 3D-Multiple Myeloma Modelo Esferóide <ol><li> Solução de colágeno tipo I Frio e 10 x DMEM oN gelo. </li><li> Misture 10/01 Volume de 10 x meio DMEM em matriz de colágeno; adicionar NaOH (0,2 N) para neutralizar a solução de colagénio ácida a um valor de pH de 7,4; loja de colágeno / solução médio no gelo. </li><li> Misture linhas celulares MM transgênicos (OPM-2 eGFP ou RPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferóide,) com células humanas mesenquimais (50.000 células / esferóide, ou seja, queda de 30 mL). </li><li> Centrifugar mistura de células em tubos de 15 ml (1.000 xg, 5min), adicione a mistura de colagénio preparado frio (1 mL) ao sedimento de células e misturar bem (1000 uL com ponta). </li><li> Imediatamente pipeta 30 ul da mistura de colagénio / célula (com ponta 100 ul) numa placa de 24 poços em filme de parafina estéril e permitir mistura célula / colagénio para polimerizar durante 30 minutos a 37 ° C (ver Figura 1A). </li><li> MM esferóides de sobreposição com meio de cultura contendo 1 mL de 1, 10 e 100 nM bortezomib (ver Figura 1B). </li><li> Após 72 horas de incubação a 37 ° C, esferóides de documentos porestereomicroscopia de fluorescência (ver Figura 1C). </li><li> Transferir cada esferóide pelo uso de fórceps com maxilas lisas de largura num tubo de reacção para a medição de GFP (ver Figura 1D). </li></ol> 3. 3D do mieloma múltiplo Xenoenxerto Modelo no CAM <ol><li> Incubar ovos de galinha em uma incubadora de ovos de aves especial a 37 ° C e 70% de humidade durante três dias. </li><li> Em seguida, abertas e ovos embriões de transferência para esterilizados com etanol, quadrada, de 10 cm de pesagem de plástico de cultura de células com barcos placa da tampa e incubar &quot;ex ovo&quot; para mais de seis dias, de modo que o CAM é capaz de desenvolver (ver Figura 2A). </li><li> Solução de colagénio de tipo I Frio e 10 x DMEM em gelo, mistura 1/10 de volume de 10 x em meio DMEM matriz de colagénio, adiciona-se NaOH (0,2 N) para neutralizar a solução de colagénio ácida a um valor de pH de 7,4; loja de colágeno / solução médio no gelo. </li><li> Misture linhas celulares de MM transgénico (OPM-eGFP ou 2RPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferóide,) com células mesenquimais humanas (50.000 células / esferóide). </li><li> Centrifugar as células em tubos de 15 ml (1.000 xg, 5 minutos, para cada composto de teste um frasco), adicionar 1 mL de mistura de colagénio preparada a frio com o fármaco (a concentração de trabalho pretendida) à pelete de células e misturar bem (1000 uL com ponta). </li><li> Coloque colagénio gotas (30 ul cada) em parafilme em um patê 6 bem durante 30 min para permitir que a polimerização da matriz extracelular, a 37 ° C. </li><li> Transferência &quot;onplants&quot; do passo 3.6 com a utilização de uma pinça para a superfície da CAM não tratada (2 cm de distância do embrião) de embriões de galinha de 9 dias de idade (4 onplants para cada embrião de frango, ver Figura 2B) </li><li> Após 5 dias de crescimento in vivo em uma incubadora de ovos a 37 ° C e 70% de humidade, xenoenxertos de documentos por estereomicroscopia de fluorescência (ver figura 2C). Euthanize embriões de galinha por hipotermia a 4 ° C no frigorífico durante 5 h. </li><li> Remover xenografts com tecido CAM subjacente por uma tesoura oftálmica e forceps com grandes mandíbulas planas. Use-os para a medição da GFP (seção 4, veja a Figura 2D) ou para análise imuno-histoquímica dos vasos sanguíneos e / ou invadindo células tumorais (Seção 5). </li></ol> 4. Quantificação de Proteína eGFP por ELISA <ol><li> Transferir cada esferóide MM ou xenoenxerto excisada em 0,5 ml de tampão RIPA contendo inibidores de protease / ml 200 ug. </li><li> Homogeneizar esferóide / xenoenxerto com um homogeneizador de tecidos em gelo. </li><li> Execute três congelamento / descongelamento ciclos em nitrogênio líquido e 37 ° C banho de água. </li><li> Centrifugar homogeneizado a 4 ° C durante 20 min (12.000 g) e os sobrenadantes da loja. </li><li> Diluir as amostras de 1:20 em tampão de ensaio (200 ul) de o kit de ELISA. Medir-níveis GFP GFP por um kit de ELISA comercial utilizando anticorpos anti-GFP biotinilados, de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol> 5. Immunohistochemical Análise de vasos sanguíneos e invadindo células tumorais <ol><li> Fix xenoenxertos excisado com área CAM em paraformaldeído a 4% O / N a 4 ° C. </li><li> Coloque xenoenxertos fixos em cassetes de embebimento e transferi-los para uma estação de incorporação de tecido com uma série crescente álcool graduado (50%, 70%, 80%, etanol a 95%, xileno e parafina; cada passo 60 min). </li><li> Xenoenxertos de secção (5 ^ m) através da utilização de um micrótomo rotativo de bancada. Coza secções de parafina em lâminas de vidro O / N a 56 ° C. </li><li> Desparafinar secções por uma série de álcoois graduados diminuindo a água duplamente destilada (xilol, 95%, 80%, 70%, etanol a 50%, água bidestilada; cada passo 10 min). </li><li> Executar a recuperação de antigénio em um banho de água (95 ° C, 20 min) com uma solução de recuperação de antigénio (citrate- tampão, pH 7,0, volume 100 ul). </li><li> Bloquear a actividade da peroxidase endógena com 100 ul de 3% de H 2 O 2 / metanol durante 30 min. </li><li> Seções bloco em PBS contendo10% de soro fetal de vitelo durante 45 min (volume 100 ul). </li><li> Mancha durante 1 h com 100 uL de anticorpo primário (1 ug / ml) diluído em PBS contendo 1% de soro de vitelo fetal, à TA. </li><li> Após lavagem três vezes em PBS, incubar durante 1 hora com o anticorpo secundário biotinilado (0,1? G / ml) em PBS contendo 1% de soro de vitelo fetal, à TA. </li><li> Após lavagem três vezes em PBS realizar a reacção de cor por a solução de avidina / (DAB) de substrato-biotina complexo (ABC) e o diaminobenzidina de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> 5.11. Parar a reacção por transferência de secções de água duplamente destilada, de contraste com hematoxilina e montar secções com um meio de montagem sintético. </li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes

O desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para refractário MM requer menos demorado e caro sistemas in-vivo para avaliar a sensibilidade de culas de MM humano para drogas. Até à data, poucos sistemas in vivo estão disponíveis para a avaliação pré-clínica de novas terapias anti-mieloma. Todos eles têm as suas limitações para o rastreio em larga escala de bibliotecas de compostos 29. Os melhores modelos atuais para células MM humanos são altamente ratos imunodeficientes 7,13,30 e e...

O mieloma múltiplo (MM) é caracterizado pela proliferação de plasmócitos malignos na medula óssea, lesões ósseas e imunodeficiência 1. Embora novas opções de tratamento, como inibidores de proteassoma (bortezomibe) e drogas imunomoduladoras (pomalidomida e lenalidomida), estejam disponíveis, o MM ainda permanece uma malignidade incurável com um prognóstico sombrio 2. O mau prognóstico pode ser explicado pela extraordinária heterogeneidade dos clones de células MM que contribui para respostas variáveis à terapia, em particular sob tratamento prolongado e pressão de seleção de clones MM 3.
O teste pré-clínico de novos medicamentos e suas combinações in vitro e in vivo é uma etapa crítica e demorada para o desenvolvimento futuro de medicamentos. Assim, modelos in vivo úteis de MM são necessários para obter uma melhor compreensão da biologia da doença e permitir a descoberta de novos medicamentos. Na verdade, os melhores modelos de xenotransplante para neoplasias hematológicas e terapêuticas são camundongos imunodeficientes, como os camundongos imunodeficientes combinados graves (SCID) 4-7, os camundongos diabéticos não obesos / SCID (NOD / SCID) 8,9 ou os camundongos NOD / SCID nocaute para β-microglobulina 10,11.
Embora os modelos murinos de MM humano em alguns aspectos possam se assemelhar ao fenótipo da doença humana, os camundongos imunodeficientes são endogâmicos, portanto, simulam apenas uma resposta individual a um medicamento e os custos são muito altos. Devido à imunossupressão, os animais requerem condições especiais de manutenção e o enxerto de MM humano em camundongos requer de 6 semanas a 2 meses 9,12, a menos que as células sejam enxertadas diretamente na medula óssea usando um procedimento tecnicamente exigente com menores taxas de sobrevivência animal 7,13. Portanto, novos métodos usando modelos organoides baseados em células-tronco 14, engenharia de tecidos 15 ou modelos sofisticados de cultura de células 3D 16 foram estabelecidos. Eles competirão em um futuro próximo com experimentos clássicos em animais para testes pré-clínicos de drogas, mas não podem substituir os testes de toxicidade sistêmica em organismos vivos.
O embrião de galinha já demonstrou ser um organismo adequado para xenotransplante de células e tecidos humanos devido à falta de resposta imune adaptativa até a eclosão 17-19. Além disso, cada embrião de galinha reflete uma reação individual a drogas aplicadas ou células tumorais devido à diversidade genética dentro da população de galinhas. A membrana corioalantóide (CAM) é um sistema bem estabelecido para estudar a angiogênese tumor-dependente 20-22. Quando os tumores sólidos são enxertados no CAM, eles exibem muitas características dos cânceres in vivo, incluindo proliferação, invasão, angiogênese e metástase 23-27. 
Com base na experiência anterior de nosso grupo com modelos de xenoenxerto CAM20,26,27, foi estabelecido um modelo MM humano que combina a vantagem de um sistema de cultura 3D humano com o modelo de embriões de galinha em desenvolvimento ex ovo. Este sistema modelo MM permite o monitoramento em tempo real da progressão do crescimento do MM, quantificação da massa celular e testes pré-clínicos de drogas.

<table><tbody><tr><td>Células RPMI-8226</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR perfiladas</td></tr><tr><td>OPM-2 células</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR perfiladas</td></tr><tr><td>Células-tronco mesenquimais humanas&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT células&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Sigma Médio</td><td>Soro Fetal Bovino Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- Pen- Solução Strep</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfection Medium/Opti-MEM&nbsp;</td>Partículas lentivirais <td>eGFP Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>Partículas virais prontas para uso</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 vetor eGFP</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>dos autores</td></tr><tr><td>Mix de embalagem ViralpowerTM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção/ Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Tipo de colágeno1&nbsp; Cauda de rato</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>pó DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsina</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-ovos de galinha brancos</td><td>Charles River</td><td></td><td>Fertilizados&nbsp; ovos de galinha Leghorn&nbsp; brancos</td></tr><tr><td>Barcos de pesagem de plástico</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>para cultura ex-ovo</td></tr><tr><td>Quadrado de Petridish (Tampas)</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>para cultura ex-ovo</td></tr><tr><td>Tampão RIPA (10x)</td><td>Sinalização Celular</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Protease Comprimidos Inibidores</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Mini GFP ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Absoluto</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio SuperFrost</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>Art.-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>Trabalho- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation Tampão de Lavagem 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Código-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de Recuperação de Alvo (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>Código DAKO-Nr.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu ASMA clone 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 clone MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Vimentin clone V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Desmin clone D33</td><td>DAKO&</td><td>nbsp; M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; clone MIB-1&nbsp; &nbsp;</td><td>DAKO&</td><td>nbsp; M7240</td><td></td></tr><tr><td>cabra biotinilada - anti-rato IgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td># PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Tablet FAST DAB.</td><td>Sigma Biochemicals</td><td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s solução de haemalaun</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo rotativo de bancada</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estação de incorporação de tecidos</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de Ovos</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência estéreo equipado com uma câmera digital conectada (Olympus E410) e luz fria flexível&nbsp;</td><td>Olympus, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&nbsp;</td><td>Homogeneizador</td> <td>IKA T10</td><td></td></tr></tbody></table>

criação de um modelo de xenoenxerto humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

O mieloma múltiplo (MM), uma doença maligna de células plasmáticas, permanece incurável e novas drogas são necessárias para melhorar o prognóstico dos pacientes. Devido à ausência do microambiente do osso e factores de crescimento auto / parácrina células MM humanos são difíceis de cultivar. Portanto, existe uma necessidade urgente de estabelecer adequada in vitro e em sistemas de cultura in vivo para estudar a acção de novas terapias em culas do MM humanos. Aqui é apresentado um modelo para crescer as células de mieloma múltiplo humano num ambiente 3D complexo in vitro e in vivo. Linhas celulares de MM OPM-2 e meio RPMI-8226 foram transfectadas para expressar o transgene GFP e foram cultivadas na presença de células mesenquimais humanas e de colagénio do tipo I como matriz esferóides tridimensionais. Além disso, os esferóides foram enxertados sobre a membrana corioalantóica (CAM) de embriões de galinha e o crescimento do tumor foi monitorizado por meio de microscopia de fluorescência estéreo. Ambos os modelos permitem o estudo do romance dru terapêuticogs em um ambiente 3D complexo e a quantificação da massa de células de tumor após a homogeneização dos enxertos em um GFP-ELISA específicos do transgene. Além disso, as respostas angiogénicas do hospedeiro e a invasão de células tumorais para o tecido hospedeiro subjacente pode ser monitorizado diariamente por um microscópio estéreo e analisadas por coloração imuno-histoquímica contra células humanas de tumor (Ki-67, CD138, vimentina) ou células hospedeiras murais cobrindo vasos sanguíneos (desmina / ASMA). Em conclusão, o sistema onplant permite estudar o crescimento de células MM e angiogénese num ambiente 3D complexo e permite o rastreio de novos compostos terapêuticos que visam a sobrevivência e proliferação das células do MM.

Na análise in vitro de compostos alvo em 3D mieloma múltiplo ensaios esferóides Devido à limitação da cultura de culas do MM in vitro humanos primários estabelecemos novos modelos in vitro de cultura 3D para linhas celulares MM humanos que utilizam uma matriz extracelular e crescimento de células mesenquimais humanas primárias de suporte a partir de medula óssea (Figura 1A, B). Linhas celulares MM transgênico EGFP permitir...

As células humanas mieloma múltiplo (MM) requerem o microambiente favorável de células mesenquimais e componentes da matriz extracelular para a sobrevivência e proliferação. Nós estabelecemos um modelo vivo de embriões em frango com células de mieloma e mesenquimais humanas enxertados para estudar os efeitos de medicamentos contra o câncer no crescimento do tumor, invasão e angiogênese.

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

O objetivo geral do seguinte experimento é estabelecer um modelo de embrião de galinha in vivo com células humanas de mieloma e mesenquimais enxertadas, a fim de estudar os efeitos de fármacos contra o câncer sobre o crescimento tumoral, invasão e angiogênese. Isso é alcançado por meio da geração de células humanas de mieloma múltiplo transgênicas para análise em modelos tridimensionais in vitro e in vivo. As células são transfectadas com lentivírus que fornece GFP para visualização e resistência ao blastina para seleção das células transfectadas.Como segundo passo, os víroides 3D. Com as células transfectadas, são geradas células mesenquimais e matriz extracelular, o que permite a triagem em larga escala de fármacos antineoplásicos em um ambiente in vitro 3D complexo. Em seguida, o tumor 3D.O EFP pode ser cultivado in vivo em embriões de galinha para testar os efeitos de novas drogas sobre o crescimento tumoral, invasão e angiogênese. Em última análise, o tamanho do tumor e as respostas angiogênicas podem ser documentados diariamente e após a eutanásia. Os tumores podem ser analisados por GFP, ELISA e imunohistoquímica.A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como modelos de xenoenxerto por espelhamento, é a ECX no manuseio e na obtenção de imagens de tumores humanos. Células tumorais humanas, juntamente com células estromais humanas de apoio e compostos da matriz extracelular, podem crescer in vivo em embriões de galinha que ainda carecem de respostas imunológicas adaptativas. Este método pode auxiliar no desenvolvimento de novas terapias e permite triagem pré-clínica rápida para o tratamento de pacientes que sofrem de mieloma múltiplo.A demonstração visual deste método é fundamental porque as células de mieloma múltiplo humano sofrem facilmente apoptose devido ao estresse, e os embriões de face podem morrer se forem manipulados incorretamente ou expostos a condições inadequadas de cultura ex vivo. A demonstração do procedimento e de todas as suas etapas críticas será realizada por Cornelia. Hes e uma técnica experiente do nosso laboratório. Para este protocolo, prepare culturas de linhagens celulares de mieloma múltiplo, OPM2, RPMI 8226 e células-tronco mesenquimais humanas da medula óssea; incube as células normalmente em meio suplementado, seguindo o protocolo descrito. Transfete um milhão de células de mieloma múltiplo com 100.000 partículas lentivirais.Em uma placa de 24 poços com meio de crescimento completo após três dias, inicie a seleção de células transfectadas adicionando dois microgramas de blastina por mililitro de meio de cultura ou use 500 microlitros de neomicina por mililitro. Após duas semanas de seleção, procure aglomerados de células expressando EGFP. Colete os aglomerados celulares, sejam flutuantes ou aderentes, ressuspendendo-os cuidadosamente em um tubo de centrífuga, pelletize as células D-E-G-F-P a 1000 ×g durante cinco minutos e expanda-os como sublinhagens. Após a seleção e propagação de células de mieloma múltiplo expressando GFP, verifique sempre sua capacidade antes de utilizá-las em experimentos posteriores.Para começar, resfrie uma solução de colágeno tipo I e 10 XDMM em gelo. Após o resfriamento, misture um volume de um décimo do meio 10 X-D-M-E-M na solução de colágeno. Em seguida, adicione hidróxido de sódio 0,2 normal gota a gota para neutralizar a solução até um pH de 7,4.Mantenha a solução no gelo e confirme o pH com uma tira reagente. Em seguida, misture as linhagens celulares transgênicas de mieloma múltiplo com as células mesenquimais humanas. Agora, centrifugue a mistura celular em tubos de 15 mililitros a 1000 G durante cinco minutos, descarte o sobrenadante e, usando uma pipeta P1000, re-suspenda o pellet em um mililitro da mistura fria de colágeno.Usando uma ponteira de P 100, transfira imediatamente alíquotas de 30 microlitros da mistura para parafina estéril. Em uma placa de cultura de 24 poços, deixe a mistura polimerizar por 30 minutos a 37 graus Celsius, formando assim os esteroides. Em seguida, recubra os esteroides com um mililitro de meio preparado contendo diferentes tratamentos.Por exemplo, uma droga pode ser aplicada em diferentes concentrações. Após 72 horas de incubação a 37 graus Celsius, documente o EFP por microscopia estéreo fluorescente. Em seguida, utilizando pinças largas de mandíbulas planas, transfira cada esteroide para um tubo de reação para medir a expressão de GFP.Em preparação para este procedimento, incubar ovos de galinha em uma incubadora de ovos a 37 graus Celsius e 70% de umidade por três dias. Em seguida, abrir os ovos e transferir os embriões para barcos plásticos quadrados esterilizados de 10 centímetros, com plaquetas de cultura celular, para obter maiores taxas de sobrevivência de embriões de galinha na cultura X OVO. Utilizar barcos plásticos de espera em vez de tecido de cultura de 10 centímetros.Além disso, esterilize e previna com barcos longos contendo PBS antes do uso. Continue incubando os ovos por mais seis dias, período durante o qual a membrana corioalantoide (CAM) se desenvolverá. Agora, prepare múltiplas células de mieloma e células estromais PHE conforme o procedimento anterior, mas em uma placa de seis poços; em seguida, utilizando pinças, transfira o esteroide, como em plantas, para a superfície não tratada da CAM, aproximadamente dois centímetros afastado do embrião de embriões de galinha com nove dias de idade.Posicione quatro plantas sobre cada embrião de galinha. Deixe os embriões ex ovo com as plantas sobre eles no incubador de ovos por cinco dias. Em seguida, documente os xenografes por microscopia estéreo fluorescente.Após a documentação, utilize tesoura e pinça oftálmicas para remover os xenografos com algum tecido conjuntivo adjacente. Para medir a expressão de GFP ou realizar análise imunohistoquímica, comece transferindo cada xenografo de mieloma múltiplo ou esteroide para 0,5 mililitros de RIPA com inibidores de protease. Em seguida, use um homogeneizador sobre gelo para homogeneizar os tecidos; após a homogeneização, congele e descongele os homogeneizados utilizando nitrogênio líquido e, depois, um banho de água a 37 graus Celsius.Repita este procedimento três vezes, em seguida, centrifugue os homogenatos a quatro graus Celsius por 20 minutos a 12.000 G e armazene os sobrenadantes. Em seguida, dilua um pouco do sobrenadante na proporção de 1 para 20 no tampão do ensaio do kit ELIZA. Então, meça os níveis de GFP utilizando anticorpos anti-GFP biotinilados com o auxílio de um kit.Inicie com uma fixação noturna dos xenoenxertos excisados em paraformaldeído. No dia seguinte, desidrate e inclua os xenoenxertos fixados. Primeiro, coloque-os em cassete.Em seguida, transfira as cassetes através de uma série gradativa de álcool. Deixe cada banho durar uma hora completa e finalize o processo com inclusão em parafina. A seguir, prepare seções de xenoenxertos de cinco mícrons utilizando um micrótomo rotativo de bancada e aqueça as seções de parafina coletadas em lâminas de vidro durante a noite a 56 graus Celsius.No dia seguinte, desparafine as seções usando uma série gradativa decrescente de álcool até água bidestilada. A lâmina deve permanecer em cada banho por apenas 10 minutos. Siga agora o protocolo descrito para incubação com os anticorpos primário e secundário respectivos e realize a detecção colorimétrica com enzima e substrato após a contracoloração com hematina e montagem dos fragmentos com meio de montagem sintético.Duas linhagens celulares de mieloma múltiplo expressando EGFP foram estabelecidas e cultivadas por três dias na presença do fármaco. As células tumorais tratadas com bortezomibe e esteroides foram então visualizadas pela expressão de GFP em um microscópio estereofluorescente.A massa de células tumorais após o tratamento com fármaco foi quantificada após a homogeneização dos EFP e a medição do conteúdo de EGFP por meio de ELISA para GFP. Em outro experimento, embriões de galinha de três dias foram cultivados *in ovo* por seis dias. No nono dia, os EFP de células de mieloma múltiplo foram enxertados.Quatro enxertos vegetais foram fixados em cada embrião. A substância alvo bortezomib foi aplicada topicamente em um mol após cinco dias, e as plantas desenvolveram tumores em comparação com os controles. O bortezomib inibiu o crescimento de células de mieloma múltiplo nos enxertos, com base na visualização da massa tumoral fluorescente.Um único enxerto de três animais diferentes foi então ressecado, homogeneizado e posteriormente medido por ELISA de GFP. Em comparação com os controles, o tecido tratado com bortezomibe apresentou significativamente menos massa de células de mieloma. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar experimentos com suas células de câncer de interesse expressas em ovos de galinha cultivados para analisar o crescimento tumoral, a gênese e a invasão no tecido hospedeiro após o seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área do mieloma múltiplo explorarem compostos ou fármacos nobres em um organismo modelo de fácil manipulação, o que é necessário para testes pré-clínicos de medicamentos.

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Medicina

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Injeção intravenosa de células cancerígenas na vasculatura da membrana corioalantóide de galinha: um procedimento para estabelecer o modelo de câncer de membrana corioalantóide para estudar a invasão e metástase do câncer

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o<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Corioalantóide membrana (CAM) como um Ensaio Xenoenxerto modelo eficiente de carcinoma hepatocelular

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Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese (Vídeo) | JoVE Journal

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

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