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O objetivo geral do experimento a seguir é aplicar este modelo de latência in vitro para estudar mecanismos moleculares e celulares e gerar hipóteses para teste em modelos in vivo mais biologicamente complexos. Isso é alcançado cultivando células de câncer de mama positivas para estrogênio em placas de cultura tecidual revestidas com fibrina em densidade congênica, onde suas interações são principalmente com o substrato e não umas com as outras. Como segundo passo, um estado de latência é ativado em algumas das células positivas para estrogênio, sustentado e mantido pelo FGF dois e pela fibronectina, representativo de células de câncer de mama na medula óssea.

Em seguida, o sistema é perturbado pela adição de anticorpos, inibidores, peptídeos ou ácidos nucleicos, a fim de interromper diversos aspectos fenotípicos e moleculares das células dormentes e determinar seu papel na manutenção do estado de dormência. Os resultados mostram o número e a aparência de colônias em crescimento e dormentes, que são resultado do tratamento de células incubadas com FGF dois em placas revestidas com fibronectina. Este método pode ajudar a identificar quais vias de sinalização, moléculas de adesão ou outros mecanismos moleculares específicos são responsáveis pelo desenvolvimento e manutenção da dormência em células de câncer de mama dependentes de estrogênio localizadas no microambiente da medula óssea.

Para iniciar, aspire o meio de cultura de placas com aproximadamente 50% de confluência de linhagens celulares CF sete e lave-as com PBS pré-aquecido. Em seguida, adicione um mililitro de solução de tripsina-EDTA a 0,25% dissolvida em DMEM, meio com alta concentração de glicose e sem soro fetal bovino. Incube as placas por um a quatro minutos a 37 graus Celsius enquanto as células começam a se destacar.

Uma vez que as células se desprendam da placa e comecem a formar uma suspensão unicelular, quebre quaisquer agregados celulares remanescentes pipetando para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de dois mililitros. Se ainda houver agregados celulares após quatro minutos de tripsina, descarte as células e prepare novas células em cultura, pois células que permanecem aderidas umas às outras após quatro minutos provavelmente introduzirão erros ao contar o número de colônias. Plaque as células tripsinizadas e re-suspenda-as a 1.500 células por mililitro. No meio de cultura, use uma pipeta de cinco mililitros para misturar a suspensão celular pipetando suavemente para cima e para baixo. Conte as células e verifique se a suspensão consiste principalmente em células isoladas, utilizando um contador automático de células.

Isso também pode ser feito manualmente usando uma câmara de contagem sob um microscópio de contraste de fase. Em seguida, aspire três mililitros da suspensão celular e distribua um mililitro em dois dos poços de uma placa de 24 poços revestida com fibronectina de cada vez. Para otimizar a distribuição espacial das células, certifique-se de pipetar a suspensão no centro do poço e não submeta a placa a movimentos adicionais antes que as células sedimentem e adiram.

Retorne a suspensão celular restante à mistura celular principal e, novamente, homogeneíze as células antes de aspirar outros três mililitros. Este procedimento reduzirá a variabilidade no número de células, pois as células sedimentam continuamente no tubo e a pipetagem atua rapidamente para distribuir os grandes volumes celulares, já que deixar as células em suspensão à temperatura ambiente e concentração de CO2 pode modular seu potencial congênico. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Este é considerado o dia menos um.

No cronograma do experimento. No dia zero do ensaio, substitua o meio por um mililitro de meio fresco ou de meio fresco contendo 10 nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos. O pequeno número de células em um poço após seis dias não afetará significativamente a composição de nutrientes ou citocinas nem o pH do meio original.

No terceiro dia, adicione 100 microlitros de uma solução contendo 10 x a concentração final pretendida de um agente perturbador, como um inibidor da PI3 quinase, LY 2 9 4 0 0 2, controle negativo LY 3 0 3 5 1 1 ou controle de meio, ao um mililitro de meio já presente nas cavidades e deixe as soluções se misturarem por difusão. Coloque novamente a placa no incubador por mais três dias. No sexto dia, dissolva 0,1% de violeta cristal em uma solução de dois por cento de etanol e borato de sódio 10 milimolar.

Em pH nove, aspire então o meio dos poços e adicione um mililitro da solução de violeta cristal a cada poço durante 20 minutos. Prepare a estação de lavagem colocando um balde de gelo na pia e mantendo a água correndo continuamente no balde; lave as placas imergindo-as na água com as aberturas dos poços voltadas para baixo, em um ângulo agudo, dentro do balde. Incline a placa até um ângulo horizontal uma vez submersa, de modo que as aberturas dos poços fiquem voltadas para baixo.

Em seguida, incline a placa de volta para um ângulo agudo e retire-a com um único movimento suave e contínuo. Repita a imersão duas ou três vezes até que a água no fundo dos poços não pareça mais azul. Em seguida, coloque as placas de cabeça para baixo sobre toalhas na bancada para secar durante a noite.

Uma vez seco, coloque a placa sob um microscópio invertido de contraste de fase e conte o número de colônias em crescimento e dormentes em cada poço. Com ampliação de 40 x, conte colônias com mais de 30 células como em crescimento e colônias com 12 ou menos células como dormentes. Abaixo, mostra-se a aparência típica de uma colônia em crescimento e de uma colônia dormente.

Colônias em crescimento contêm mais de 30 células e colônias dormentes contêm 12 ou menos células, que são muitas vezes maiores do que as células em crescimento, com grandes proporções de citoplasma em relação ao núcleo, sem a adição de FGF dois à cultura. As colônias são predominantemente representadas por clones em crescimento. Na presença de FGF dois, a grande maioria dos clones está dormente, e o efeito de agentes adicionais também pode ser avaliado utilizando o sistema. Aqui, dois agentes perturbadores, em concentrações previamente determinadas, foram adicionados aos poços no terceiro dia do ensaio Congênico.

A figura representa uma inibição preferencial de clones dormentes pelo inibidor da quinase PI3K LY294002, mas ausência de efeito pelo controle negativo LY303511. Esses experimentos podem ser utilizados para ajudar a compreender os elementos que regulam a dormência e a resistência à terapia. Aqui, as células dormentes sobreviventes tratadas com o inibidor da quinase PI3K perderam sua aparência achatada, tornaram-se pequenas e dendríticas e apresentaram-se em estado de estresse.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estabelecer este ensaio congênico para cultivar células em estado de dormência, como perturbar as células adicionando inibidores específicos ou agentes perturbadores após o estabelecimento da dormência e como quantificar o efeito desses agentes perturbadores. Este ensaio pode ser utilizado para avaliar tanto resultados quantitativos quanto qualitativos, contando colônias dormentes ou medindo qualquer número de eventos imunofenotípicos, ultraestruturais ou moleculares nas células dormentes e perturbadas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.