Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a neuroproteção após o condicionamento hipóxico repetitivo ou RHP, medindo simultaneamente o volume do infarto e a integridade da barreira hematoencefálica. Isso é alcançado submetendo camundongos a nove exposições estocásticas à hipóxia, que variam em duração e intensidade, a fim de proporcionar proteção neurovascular contra o acidente vascular cerebral. Em seguida, o acidente vascular cerebral é induzido no camundongo, seguido pela injeção de azul de Evans.

O azul de Evans liga-se seletivamente à albumina e permite a quantificação da ruptura da barreira hematoencefálica após o sacrifício do animal, subsequente à injeção. O cérebro é removido e corado com TTC para quantificar o volume do infarto. Os resultados demonstram os benefícios neuroprotetores do condicionamento prévio repetitivo à hipóxia em camundongos após acidente vascular encefálico isquêmico.

A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o condicionamento hipóxico com exposição única, é que o RHP produz neuroproteção por pelo menos oito semanas em camundongos. Esse método de dupla quantificação pode responder perguntas fundamentais na pesquisa de acidente vascular cerebral, como a forma de medir simultaneamente os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica, embora este método possa ser usado para obter informações sobre acidente vascular cerebral isquêmico, o RHP também pode ser aplicado a outros estados de doenças sistêmicas e do SNC baseados em inflamação. Para começar, divida os camundongos em dois grupos.

O grupo RHP, que recebe exposições de 8% e 11% de oxigênio, e o grupo controle, que recebe exposições de 21% de oxigênio simultaneamente, removem a tampa superior do filtro de cada gaiola e colocam a gaiola, com garrafas de alimento e água intactas, nas câmaras conectadas aos respectivos tanques de oxigênio. Feche e fixe bem a tampa da câmara. Abra a válvula principal dos tanques e ajuste o fluxo inicial para cada câmara de indução em dois litros por minuto ou LPM.

Após cinco minutos de exposição, reduza a taxa de fluxo para um LPM pelo restante da exposição. Ao final da exposição, reduza o fluxo para zero LPM e feche a válvula de gás. Para os tanques.

Abra as tampas das câmaras e substitua a tampa superior com filtro em cada gaiola. Coloque as gaiolas em alojamento padrão até a próxima exposição hipóxica. Pulverize cada câmara de indução com um desinfetante e desodorizante após cada uso.

Exponha simultaneamente os camundongos RHP e os controles no mesmo horário ao longo das duas semanas do protocolo. Em seguida, realize uma oclusão transitória da artéria cerebral média ou A-T-M-C-A-O conforme descrito no texto. A injeção de EB deve ser realizada 22 horas após a reperfusão e deve circular na corrente sanguínea por duas horas antes da eutanásia e coloração NTTC.

Prepare a quantidade de EB necessária para a injeção. Em seguida, aspire a quantidade desejada de temperatura ambiente em uma seringa de insulina de 0,3 cc. Com uma agulha de 29 graus, imobilize o camundongo utilizando um restritor de fundo plano.

Segure a cauda de modo que a veia lateral fique na posição superior. As veias laterais estão localizadas em ambos os lados da linha central da cauda. Segure a ponta da cauda para manter o camundongo estável durante a injeção.

Insira a agulha na veia aproximadamente três a cinco milímetros. Tendo cuidado para não perfurar a veia, injete todo o corante ao longo de um minuto. Se a solução estiver entrando na veia, deve haver resistência mínima ao aplicar pressão na seringa.

Confirme a administração venosa sistêmica bem-sucedida de EB pela mudança imediata de cor nas patas caudais e olhos do camundongo. Remova a agulha da cauda e aplique suavemente pressão usando gaze limpa para interromper o sangramento. Inicie a contagem do tempo.

Quando a pele do camundongo ficar azul, deixe o EB circular por duas horas para penetrar na barreira hematoencefálica enfraquecida. A perfusão e a coloração com TTC devem ocorrer 24 horas após a reperfusão, 24 horas após a T-M-C-A-O, e duas horas após a administração do EB, sacrifique o animal com overdose de isoflurano em uma câmara de indução pequena. A perfusão deve começar imediatamente após o sacrifício para minimizar a autólise, que se inicia na ausência de oxigênio após a morte.

Fixe rapidamente o animal em uma plataforma de isopor com os antebraços presos através das patas. Faça uma incisão lateral na parede abdominal a partir da linha média, logo abaixo da caixa torácica. Corte cuidadosamente o diafragma para expor o coração.

Inicie a bomba de perfusão com uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto, utilizando uma seringa de 60 cc preenchida com solução salina tamponada com fosfato 0,01 molar gelada ou PBS, conectada a uma agulha de infusão alada de 27 gauge. Coloque a ponta da agulha cerca de 0,5 centímetros dentro do ventrículo esquerdo do coração e corte o átrio direito. Sangue venoso progressivamente diluído deve fluir para fora do átrio durante a perfusão até que o sangue venoso apareça. Passe 30 mililitros de PBS 0,01 molar incolor através do coração para realizar a perfusão transcardíaca.

Em seguida, adicione cinco mililitros de solução de TTC em 20 frascos de cintilação transparentes. Imediatamente após a perfusão, decapite os animais e retire os cérebros utilizando pequenas tesouras e uma espátula, se necessário. Verifique se o hemisfério contralateral à artéria cerebral média ocluída apresenta coloração pálida, sem vazamento aparente de EB ou edema.

A seguir, adicione PBS insuficiente em uma matriz acrílica para cérebro projetada para produzir cortes coronais de 1,0 milímetro de espessura de um cérebro de camundongo. Coloque o cérebro com a face dorsal voltada para cima na matriz e imediatamente despeje PBS sobre o cérebro. Mantenha o cérebro úmido.

Remova os bulbos olfativos inserindo uma lâmina de aço inoxidável com espessura de 0,21 milímetro na segunda ranhura a partir do lado rostral da matriz. Em seguida, remova o cerebelo inserindo uma lâmina na quarta ranhura a partir do lado caudal da matriz. Insira uma lâmina na ranhura central dentre as ranhuras restantes na matriz.

Em seguida, insira as lâminas restantes dividindo uniformemente o tecido remanescente para garantir a distribuição mais homogênea possível do tecido durante o corte. Depois que todas as lâminas tiverem sido inseridas, adicione uma a duas gotas de PBS ao cérebro para umedecê-lo. Em seguida, remova as lâminas uma a uma da matriz, começando pela região rostral.

Reserve as sete primeiras fatias para análise com TTC. Após T-M-C-A-O, use uma espátula pequena para transferir cuidadosamente as fatias da lâmina para o tubo contendo TTC. Depois que todas as seções estiverem no tubo, feche-o e coloque-o em banho-maria aquecido até que as seções fiquem rosadas.

Gire suavemente o frasco no banho, se necessário, para evitar sobreposição de seções, o que poderia levar a uma coloração irregular. Em seguida, descarte o TTC e despeje uma solução de paraformaldeído a 4% no frasco para cobrir as seções cerebrais. Isso interrompe a reação química do TTC.

Organize imediatamente os cortes em uma lâmina de vidro limpa de uma por três polegadas e oriente os cortes de rostral para caudal quando forem dispostos na lâmina. Digitalize a lâmina. Utilizando um scanner comum, configure a resolução em um mínimo de 600 DPI para análise de imagem.

Certifique-se de incluir o nome do animal e uma régua métrica na imagem digitalizada. Por fim, vire o lâmina e digitalize o verso para garantir que todos os dados sejam coletados. O PRC reduz os volumes de infarto em 46% em comparação com os camundongos controle, mas não tem efeito sobre o inchaço hemisférico derivado dos dados de TTC nos mesmos animais.

O RHP reduz a ruptura da barreira hematoencefálica, definida pelo vazamento de azul de Evans normalizado para o hemisfério contralateral, com colorações representativas de TTC de animais tratados com RHP e controles expostos a 21% de oxigênio. Os camundongos são mostrados com os volumes de infarto correspondentes e o vazamento de azul de Evans listados abaixo de cada amostra. O ipsilateral é o hemisfério cerebral isquêmico e o contralateral é o lado não afetado do cérebro.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de injetar o azul de Evans 22 horas após a fusão e permitir sua circulação por duas horas antes da eutanásia do animal após o seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de pesquisa pré-clínica de acidente vascular cerebral explorassem mecanismos de proteção endógena contra o acidente vascular cerebral em camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão clara de como mensurar o efeito neuroprotetor do RHP por meio da dupla quantificação da integridade da barreira hematoencefálica e dos volumes de infarto.