Name: Um Ensaio Behavioral Barato, escalável para medição Ethanol Sedação sensibilidade e tolerância rápida em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a medir sensibilidade e tolerância rápida à sedação por etanol em Drosophila usando um ensaio comportamental acessível. Este método escalável auxilia pesquisadores em neurociência e biologia do comportamento.

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Esses estudos foram apoiados por doações do National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). Os autores agradecem a Jill Bettinger pelas discussões úteis e a Jacqueline DeLoyht pela assistência técnica.

1. Day Before Assay <ol><li> Recolha voa em frascos de alimentos frescos em grupos de 11 (do mesmo sexo), sob breve (1-5 min) CO 2. </li><li> Permitir moscas para recuperar S / N em frascos de alimentos num espaço de ambiente controlado (tipicamente 25 ° C, 60% de humidade relativa, 12 horas de luz / escuridão). </li><li> Preparar a solução de (s) diluindo etanol puro (100%) em etanol purificado (≥18 mohms) de água para a concentração (s) final adequada para a experiência planeada. Permitir que a solução (s) para voltar à TA O / N. Nota: Diluição de etanol é exotérmica. </li></ol> 2. Dia de Ensaio <ol><li> Para cada frasco de moscas para ser testado, preparar (i) um frasco vazio alimentos limpo; ou seja, testes de frasco, (ii) uma nova ficha de acetato de celulose, (iii) uma rolha de silicone e (iv) 1 ml de solução de etanol (ver Tabela 3). </li><li> Prepare a sala de ensaio, ajustando a temperatura de 20-25 ° C e humidade relativa de 55-65%. </li><li> Já um outro trabalhadoratribuir um código único para cada grupo de frascos e registrar o código para mais tarde. Coloque frascos codificados com moscas na sala de testes para se aclimatar para poucos min. </li><li> Rotular frascos vazios de teste para coincidir com códigos em frascos de voar a partir de 2.3. </li><li> Construir um log de ​​teste impressa, digitando os códigos em colunas (uma coluna / frasco) em uma planilha semelhante à Tabela 1. </li><li> Usando o log de teste como um guia, organizar frascos de alimentos codificados com moscas e frascos vazios de testes em matrizes correspondentes na sala de testes. Nota: Um número máximo razoável de frascos de testar é 24 (ou seja, 6 conjuntos de 4 frascos cada). </li><li> Transferência voa de frascos de alimentos em pareados / rotulados frascos de ensaio vazio e coloque imediatamente plugs de acetato de celulose em frascos de ensaio até plugs de acetato de celulose são 2 cm abaixo dos topos dos frascos. </li><li> A partir de agora, lidar com cada linha de quatro frascos como um conjunto em escalonados intervalos de 1 min. </li><li> Para a avaliação do tempo 0, segure cada frasco individualmente wom polegar eo indicador, bater suavemente sobre a mesa três vezes para bater as moscas para o fundo do frasco, esperar 30 segundos e depois contar o número de moscas que são imóveis / morto. Grave o número de moscas mortas / imóveis para cada frasco no tempo 0 min no log de teste impresso. </li><li> Comece contador de tempo de forma contínua no tempo 0 e começar imediatamente a adição de 1 ml de etanol para plugs de acetato de celulose nos frascos para a primeira linha / set de 4 frascos. Adicionar 1 ml de etanol para as velas de acetato de celulose nos frascos a intervalos de 5 seg na ordem em que irá ser testada. Adicionar etanol para os tampões de acetato de celulose em um movimento circular de modo que o etanol é absorvido uniformemente ao longo dos tampões de acetato de celulose. Quando o etanol foi adicionado a todos os 4 frascos de ensaio no conjunto, insira um plug silicone em cada frasco para selá-lo. </li><li> Às vezes 1, 2, 3, 4 e 5 min, adicionar 1 ml de etanol para o segundo, terceiro, quarto, conjuntos, quinto e sexto de 4 frascos, respectivamente. Continue inserir rolhas de silicone apósadição de etanol para cada conjunto de 4 frascos. </li><li> Em vez de 6 min, testar o primeiro conjunto de quatro frascos de agarrar cada frasco com o polegar eo dedo indicador, batendo suavemente na mesa três vezes para bater as moscas para o fundo do frasco, de espera de 30 segundos e, em seguida, a contagem e registo do número total de moscas que estão sedados. Score voa tão sedado se (i) estar no chão do frasco, mas não andam ou (ii) se situam em suas costas com ou sem bater as asas. </li><li> Lidar com cada frasco dentro do conjunto em intervalos de 5 seg usando o cronograma na Tabela 2. </li><li> Às vezes, 7, 8, 9, 10 e 11 min, testar as segunda, terceira, quarta, quinta e sexta séries de frascos, respectivamente, como é feito com o primeiro set. </li><li> Em tempo de 12 min, testar o primeiro conjunto de 4 frascos novamente como descrito em 2.12 e continuar testando o segundo terceiro, quarto sets, quinto e sexto de frascos em 13, 14, 15, 16 e 17 min, respectivamente. </li><li> Continuar ensaio moscas como descrito em 2,12 até que todas as moscas são sedated. </li><li> Digite o número total de moscas em cada frasco no log de testes cópia impressa. Censor moscas imóveis / mortas no tempo 0 a partir do número total de moscas. </li><li> Calcular a percentagem de moscas ativas em cada tempo de ponto de avaliação e dados de enredo como% moscas ativas (eixo y) em função do tempo (eixo-x). Quantificar sedação etanol interpolando Sedação Tempo 50 valores (ST50, tempo para 50% sedação) de terceira ordem curva polinomial ou sigmoidal encaixa ou área de cálculo sob a curva. </li><li> Compilar dados de frascos decodificados e realizar análises estatísticas (por exemplo, one-way ANOVA com Bonferroni teste de comparação múltipla) conforme apropriado para o projeto experimental. </li></ol>

<ol><li>Rehm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+disease+and+injury+and+economic+cost+attributable+to+alcohol+use+and+alcohol-use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders.</a> Lancet. 373, 2223-2233 (2009).</li>
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<li>Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hangover+gene+defines+a+stress+pathway+required+for+ethanol+tolerance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development.</a> Nature. 436, 845-847 (2005).</li>
<li>Riley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+dependence+is+associated+with+the+ZNF699+gene%2C+a+human+locus+related+to+Drosophila+hangover%2C+in+the+Irish+affected+sib+pair+study+of+alcohol+dependence+%28IASPSAD%29+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample.</a> Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).</li>
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<li>Schuckit, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+of+response+to+alcohol+as+a+predictor+of+future+alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism.</a> The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).</li>
<li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+8-year+follow-up+of+450+sons+of+alcoholic+and+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+general+psychiatry%22%5BJournal%5D)">An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects.</a> Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).</li>
<li>Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Alcohol tolerance.</a> Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).</li>
<li>Chan, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+Influences+of+Drosophila+white%2Fmini-white+on+Ethanol+Sensitivity+in+Two+Different+Behavioral+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays.</a> Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).</li>
<li>Eddison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((arouser+reveals+a+role+for+synapse+number+in+the+regulation+of+ethanol+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity.</a> Neuron. 70, 979-990 (2011).</li>
<li>Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuropeptide+F+and+its+receptor%2C+NPFR1%2C+define+a+signaling+pathway+that+acutely+modulates+alcohol+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).</li>
<li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).</li>
<li>Bhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channels+modulate+acute+ethanol+behaviors+in+Drosophila%2C+Caenorhabditis+elegans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+brain%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice.</a> Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Bacchus+reveal+a+tyramine-dependent+nuclear+regulator+for+acute+ethanol+sensitivity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila.</a> Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).</li>
<li>Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmo+genes+regulate+behavioral+responses+to+ethanol+in+Drosophila+melanogaster+and+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).</li>
<li>Maples, T., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+way+to+measure+ethanol+sensitivity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple way to measure ethanol sensitivity in flies.</a> J Vis Exp. , e2541(2011).</li>
<li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, 199-211 (2006).</li>
<li>Nohronha, A. Ch. 23. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRothenfluh%2C+A+%22Neurobiology+of+Alcohol+Dependence%22">Neurobiology of Alcohol Dependence</a>. 23, Elsevier. 467-495 (2014).</li>
<li>Jones, M. A., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+age-related+impairment+in+locomotor+and+other+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors.</a> Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).</li>
<li>Martin, I., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+and+age-related+functional+declines%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage and age-related functional declines.</a> Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ethanol+responses+in+Drosophila+are+sexually+dimorphic%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Ensaios simples que reproducibly quantificada fenótipos significativas são de grande valor para a análise do comportamento. O trabalho descrito aqui aborda vários aspectos práticos de um ensaio para medir a sensibilidade sedação etanol e tolerância rápida em Drosophila. Apesar de não ser um foco deste trabalho, análises de comportamento são facilitadas pela manutenção do ambiente e genético constante fundo para indivíduos de teste dentro de um estudo. Além disso, comparações devem tipicamente ser feita entre os...

Transtorno de uso de álcool (AUD) é um enorme problema de saúde mundial (revisto em 1). Embora os mecanismos que conduzem o desenvolvimento de R são complexas, estas perturbações têm um importante componente genético (por exemplo, 2). O grande herdabilidade de AUD e as respostas comportamentais conservados em etanol através de muitas espécies (revisto em 3,4) têm gerado grande interesse na utilização de organismos-modelo genéticos para investigar o envolvimento de genes específicos em comportamentos relacionados com o álcool para uma melhor compreensão das bases moleculares de AUD. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, surgiu como um organismo modelo de liderança para explorar mecanismos genético-moleculares de comportamentos relacionados com o etanol (revisto em 3,4). Estudos em moscas têm destacado papel para várias vias de sinalização em respostas comportamentais ao etanol (revisto em 5). Curiosamente, alguns dos genes e vias que influenciam respons comportamentaises para etanol em moscas também têm sido implicados em comportamentos relacionados com etanol roedores e / ou R humano (por exemplo, 6-14). A conservação dos mecanismos de condução comportamentos relacionados com o etanol em toda a espécie, juntamente com o conjunto de ferramentas genéticas disponíveis no sistema modelo de Drosophila, ressaltam a utilidade do modelo mosca da fruta para investigar a genética de respostas comportamentais ao etanol. Sensibilidade e tolerância 15,16 (revisto em 17) ao etanol em seres humanos está associada com o desenvolvimento de AUD. Ambas as respostas comportamentais ao etanol pode ser modelado em moscas através de uma variedade de ensaios laboratoriais (revisto em 3,4). Todos os ensaios de mosca conhecidos para os autores são baseados quer dependente do tempo induzida pelo etanol sedação / ou descoordenação recuperação dependente do tempo a partir de etanol sedação. Em um artigo anterior do nosso grupo sobre a genética da sensibilidade etanol e rtolerância APID em Drosophila, um ensaio comportamental, baseada em etanol sedação induzida por vapor de moscas foi utilizado 18. Testes neste ensaio foi iniciado através da transferência de adulto vivo voa sem anestesia para esvaziar frascos alimentares, aprisionando as moscas em frascos com um tampão de acetato de celulose, adição de etanol para a parte superior (ou seja, o lado não-fly) do tampão de acetato de celulose, e selando o frasco contendo moscas, plugue de acetato de celulose e de etanol com uma rolha de silicone (ver esquema na figura S3, Referência 18). Vários frascos que representam diferentes grupos de moscas foram avaliados em paralelo, aumenta o rendimento do presente ensaio. Os frascos foram dadas um código anônimo e experimentadores ficaram cegos para grupo de tratamento para evitar viés não intencional na avaliação da sedação. Numa experiência normal, moscas em frascos foram bate-se suavemente a intervalos de 6 min e, após uma recuperação de 30 seg, o número de moscas sedados em cada frasco foi contado e Converted para moscas por cento ativos. Moscas absorvida vapor de etanol a partir do tampão de acetato de celulose de uma maneira dependente do tempo, causando aumentos progressivos em etanol interna 18 e sedação (cf referência 18 e Figura 1A e 1B neste relatório). Sedação neste ensaio foi definida operacionalmente como moscas (i) que está na ausência de curta ou (ii) que encontra-se em suas costas com ou sem bater as asas. Aqui, este ensaio de sedação etanol é descrita em detalhe, uma maior optimização operacional relevante para usá-lo é fornecido, e o ensaio é utilizado para tratar a contribuição de opções de suplementação de alimentos sobre a sensibilidade mosca sedação.

<table><tbody><tr><td>frascos para alimentos</td><td>VWR</td><td>89092-772</td><td>estreito</td></tr><tr><td>Flugs</td><td>Genesee/flystuff.com</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>rolha estreita de silicone</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-704-1l</td><td>#4</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Pharmaco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 prova</td></tr></tbody></table>

um ensaio behavioral barato, escalável para medição ethanol sedação sensibilidade e tolerância rápida em<em&gt; drosophila</em

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Transtorno de uso de álcool (AUD) é um desafio de saúde grave. Apesar de uma grande componente hereditário para AUD, alguns genes têm sido implicados de forma inequívoca na sua etiologia. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é um modelo poderoso para explorar mecanismos genético-moleculares subjacentes comportamentos relacionados com o álcool e, portanto, é uma grande promessa para identificar e compreender a função dos genes que influenciam AUD. A utilização do modelo de Drosophila para estes tipos de estudos depende da disponibilidade de ensaios que medem a forma fiável respostas comportamentais ao etanol. Este relatório descreve um ensaio adequado para avaliar a sensibilidade de etanol e tolerância rápida em moscas. Sensibilidade etanol medido neste ensaio é influenciado pelo volume e concentração do etanol usado, uma variedade de manipulações genéticas previamente relatados, e também o período de tempo em que as moscas são alojados sem alimentos imediatamente antes do teste. Em contraste, s etanolensitivity medido neste ensaio não é afectado pela força de manipulação mosca, sexo das moscas, e a suplementação do meio de crescimento com antibióticos ou com levedura viva. Três métodos diferentes para quantificar a sensibilidade de etanol encontram-se descritos, todos levando a resultados essencialmente indistinguíveis sensibilidade etanol. A natureza escalável deste ensaio, combinada com a sua simplicidade global de set-up e custo relativamente baixo, tornam adequado para a análise genética de pequena escala e grande sensibilidade de etanol e tolerância rápida em Drosophila.

Os dados em bruto a partir de etanol neste ensaio de sedação são os números de moscas que são sedados como uma função do tempo de exposição ao vapor de etanol. Os dados em bruto são convertidos para as moscas por cento ativos como uma função do tempo (dados primários, as Figuras 1A, B, D - F). Sensibilidade para sedação de etanol a partir dos dados primários podem ser quantificados como sedação 50 Tempo (ST50), o tempo necessário para que 50% das moscas de se tornar sedado aea ou sob a ...

Ensaios simples para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em Drosophila facilitam o uso deste organismo modelo para investigar esses importantes comportamentos relacionados ao etanol. Aqui, um ensaio relativamente simples e escalável para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em moscas é descrito.

Um Ensaio Behavioral Barato, escalável para medição Ethanol Sedação sensibilidade e tolerância rápida em<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

O objetivo geral do seguinte experimento é avaliar a sensibilidade à sedação por etanol em moscas-das-frutas. Isso é realizado colocando as moscas em frascos e expondo-as ao vapor de etanol. O segundo passo consiste em determinar o número de moscas que estão sedadas em cada frasco em intervalos regulares de tempo, até que todas as moscas estejam sedadas.Em seguida, realiza-se a interpolação do ponto temporal. Quando 50% das moscas estão sedadas em cada frasco, os resultados mostram um índice do tempo necessário para sedar moscas-das-frutas com etanol, demonstrando que este procedimento hoje será conduzido por Simran Sindu, uma estudante do meu laboratório. Para iniciar o experimento, colete moscas em frascos com alimento fresco em grupos de 11 indivíduos de um mesmo sexo por até cinco minutos de CO2, permitindo que as moscas se recuperem durante a noite em frascos com alimento, em um ambiente com condições controladas.Prepare a solução de etanol diluindo etanol puro a 100% em água purificada até uma concentração final de 85%. Deixe a solução retornar à temperatura ambiente durante a noite antes do ensaio. Prepare um frasco de alimento limpo e vazio, que servirá como frasco de teste. Tenha um novo tampão de acetato de celulose, uma rolha de silicone e um mililitro da solução de etanol para cada frasco de moscas a ser testado. Ajuste a temperatura ambiente para 20 a 25 graus Celsius e a umidade relativa para 55 a 65%. Designe outro colaborador para atribuir um código único a cada grupo de frascos e registre o código para uso posterior. Coloque os frascos codificados com as moscas na sala de teste para aclimatação por alguns minutos. Em seguida, rotule os frascos de teste vazios para corresponder aos códigos nos frascos das moscas.Construa um registro físico de testes inserindo os códigos em colunas, com uma coluna para cada frasco, em uma planilha. Utilizando o registro de testes como guia, organize os frascos codificados com alimentos e moscas e os frascos de teste vazios em arranjos correspondentes na sala de testes; transfira as moscas dos frascos de alimento para os frascos de teste emparelhados e rotulados, um de cada vez.Em seguida, insira imediatamente tampões de acetato de celulose nos frascos de teste até que os tampões fiquem a dois centímetros abaixo das bordas dos frascos. Para a avaliação do tempo zero. Segure cada frasco individualmente entre o polegar e o indicador.Bata suavemente na mesa três vezes para derrubar as moscas para o fundo do frasco. Aguarde 30 segundos e conte o número de moscas imóveis e/ou mortas. Registre o número de moscas imóveis ou mortas para cada frasco no tempo determinado.Zero minutos no registro de teste em papel. Inicie o cronômetro no tempo zero e adicione imediatamente um mililitro de etanol ao acetato de celulose. Agite em movimento circular em intervalos de cinco segundos para o primeiro conjunto de quatro frascos, na ordem.Eles serão testados quando o etanol tiver sido adicionado aos quatro frascos de ensaio do conjunto. Insira uma tampa de silicone em cada frasco para selá-lo aos 1, 2, 3, 4 e cinco minutos. Adicione um mililitro de etanol ao segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto conjuntos de quatro frascos, respectivamente.Continue inserindo rolhas de silicone após adicionar etanol a cada conjunto de quatro frascos LS aos seis minutos. Teste o primeiro conjunto de quatro frascos segurando cada frasco com o polegar e o indicador e batendo suavemente na mesa três vezes para fazer as moscas descerem para o fundo do frasco. Aguarde 30 segundos, depois conte e registre o número total de moscas que estão sedadas.Classifique as moscas como sedadas se elas, primeiro, permanecerem em pé no fundo do frasco, mas não caminharem, ou segundo, deitarem de costas com ou sem agitar as asas. Manipule cada frasco do conjunto em intervalos de cinco segundos usando este cronograma nos tempos 7, 8, 9, 10 e 11 minutos.Teste o segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto conjuntos de frascos respectivamente da mesma forma que o primeiro conjunto aos 12 minutos. Teste novamente o primeiro conjunto de quatro frascos e continue testando o segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto conjuntos de frascos aos 13, 14, 15, 16 e 17 minutos, respectivamente. Continue testando as moscas até que todas estejam sedadas.Insira o número total de moscas em cada frasco no teste com anotação em papel. Registre as moscas imóveis ou mortas no sensor no tempo zero a partir do número total de moscas. Os dados brutos do ensaio de sedação com etanol foram convertidos para a porcentagem de moscas ativas em função do tempo.A sensibilidade à sedação por etanol a partir dos dados primários foi quantificada como tempo de sedação 50 ou ST 50. O tempo necessário para que 50% das moscas ficassem sedadas ou a área sob a curva ou a UC. O ensaio detecta os efeitos do RNAi contra calnexina 14 D no sistema nervoso, o que reduziu a sensibilidade ao etanol em relação aos controles, mutação de scab e rouser, sensibilidade aumentada à sedação por etanol e mutação de happy hour. Sensibilidade reduzida à sedação por etanol em comparação com os controles uma vez dominada.Essa técnica pode ser realizada em uma hora e meia se realizada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um ensaio simples para medir os efeitos sedativos do etanol...

Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Drosophila surgiu como um sistema modelo importante para dissecar as bases celulares e moleculares de respostas comportamentais ao álcool. Aqui é apresentado um protocolo para a recolha de dados de sensibilidade do álcool em um contexto circadiano que pode ser facilmente aplicado a outros ensaios e é bem adequada para a pesquisa de graduação.

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Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

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Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a evitação de indivíduos estressados. Este paradigma é poderoso, mas fácil de usar, e pode ser usado para avaliar a influência de genes e ambiente em um tipo de interação social em Drosophila melanogaster.

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C. elegans é um modelo útil para estudar os efeitos do etanol no comportamento. Apresentamos um ensaio comportamental que quantifica os efeitos do etanol na velocidade de locomoção de vermes rastejantes; tanto a sensibilidade inicial quanto o desenvolvimento de tolerância funcional aguda ao etanol podem ser medidos com este ensaio.

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Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

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Os métodos atuais para medir a sensibilidade ao álcool em Drosophila são projetados para testar grupos de moscas. Apresentamos um ensaio simples, de baixo custo e de alto custo para avaliar a sensibilidade à sedação de álcool em um grande número de moscas simples. O método não requer ferramentas especializadas e pode ser realizado em qualquer laboratório utilizando materiais comuns.

Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

O ensaio Flypub mede os comportamentos que a mosca da fruta Drosophila melanogaster exibe sob a influência do etanol. O ensaio pode ser facilmente dominado por experimentadores em todos os níveis e aplicado a vários estímulos vaporizados, facilitando o abuso de substâncias e estudos de dependência.

Flypub estuda desinibição comportamental induzida pelo etanol e sensibilização

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O procedimento descrito neste protocolo mostra que a administração de testosterona e crenças populares sobre a testosterona pode estar associada diretamente oposta comportamentos sociais.

Combinando Behavioral Endocrinologia e Economia Experimental: Decisão da testosterona e Social Fazendo

Aprenda a medir sensibilidade e tolerância rápida à sedação por etanol em Drosophila usando um ensaio comportamental acessível. Este método escalável auxilia pesquisadores em neurociência e biologia do comportamento.

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