Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion Caenorhabditis elegans

O objetivo geral deste procedimento é quantificar o efeito do álcool nos órgãos de LC de diferentes genótipos de maneira consistente. Isso é feito criando primeiro uma placa de ágar contendo álcool com anéis de cobre embutidos na superfície para encurralar os animais. Em seguida, os diferentes genótipos são encurralados separadamente e expostos ao álcool Durante a exposição, os dados de vídeo são coletados em pontos de tempo definidos.

A etapa final é a medição da velocidade de cada genótipo usando um software de reconhecimento de objetos. Em última análise, uma comparação de velocidades em pontos de tempo iniciais e tardios é usada para descobrir o desenvolvimento anormal de sensibilidade ou tolerância ao álcool. Os genótipos específicos.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, que comparam genótipos em diferentes placas, é que a variação ambiental é reduzida. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em escolher minhocas usando uma picareta nua no dia anterior ao ensaio. Escolha L vermes de quatro estágios para placas NGM frescas Sentado com um gramado de cultura de OP 50 E coli, as placas a 20 graus Celsius durante a noite, o ensaio requer padrão não assentado 60 por 15 milímetros.

As placas NGM secam todas as placas a serem usadas a 37 graus Celsius por duas horas sem as tampas. Cada teste requer quatro placas. O uso de placas NGM é importante aqui.

Diferenças na composição das placas. Em particular, sua osmolaridade pode afetar fortemente o etanol responsivo à dose no comportamento. Isso se deve, pelo menos em parte, a mudanças na quantidade de etanol acumulada pelos animais Depois de secas, pesar cada uma das placas NGM não encaixadas.

Use esse peso para determinar o volume de mídia em cada placa, supondo que a mídia pese tanto quanto a água. Em seguida, planeje derreter quatro anéis de cobre com um diâmetro interno de 1,6 centímetros em cada placa, para que possam ser visualizados pela câmera simultaneamente. Usando fórceps.

Coma cada anel em fogo por cerca de três segundos e imediatamente coloque o anel no prato sem deixá-lo cair. Em seguida, pressione o anel suavemente em alguns lugares para prendê-lo ao longo da periferia. Rotule as placas com a tensão que estará em cada anel.

Agora, calcule a quantidade de etanol 100% necessária para obter uma concentração de peso para volume de 400 milimolares na placa. Em seguida, carregue metade das placas com etanol regando o etanol de uma pipeta. Deixe todas as placas preparadas equilibrarem por duas horas antes de iniciar o experimento.

Para começar, leve dois minutos ou menos para transferir 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre em uma placa de aclimatação. Esta é uma placa sem etanol. Evite transferir alimentos com as minhocas, pois isso reduzirá seu movimento.

Além disso, evite danificar a superfície do ágar porque os vermes se enterrarão. Registre o tempo de carregamento na placa e certifique-se de escalonar a transferência de minhocas para cada placa em mais de dois minutos, para que cada placa possa ser filmada individualmente no intervalo de tempo apropriado. Deixe cada placa de aclimatação incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, transfira os vermes para a placa de ensaio seguindo a ordem usada para colocar os vermes na placa de aclimatação usando um verme achatado de borda fina. Escolha sem bactérias. Colete as minhocas em cima da picareta achatada.

Usando um movimento de escavação, sele as placas com filme de laboratório para minimizar a perda de etanol por vaporização. A velocidade com que os animais são transferidos nesta etapa é muito importante porque a transferência para os animais ficará exposta ao etanol por mais tempo, por isso é uma boa ideia alternar quais cepas são colocadas na placa. Primeiro em réplicas experimentais.

Um microscópio com câmera de vídeo de alta resolução é necessário para filmar os vermes. Agora, até mesmo a iluminação, como a de uma luz de fundo quadrada de três polegadas, é vital para a análise. Em seguida, para manter o contraste da imagem com a mídia da placa voltada para cima, prepare o software de análise de imagem para capturar 120.

Fotografe filmes time-lapse em escala de cinza de 12 bits em um quadro por segundo. Para reduzir o tamanho do arquivo de saída enquanto ainda mantém a resolução de imagem suficiente, use um modo de dobra dois por dois. Agora, grave filmes de dois minutos de cada placa.

10 minutos depois que os últimos vermes foram colocados naquele prato. Em seguida, faça uma segunda gravação de dois minutos. 30 minutos depois que os vermes foram colocados na placa para esta imagem de demonstração.

O software Pro plus é usado, mas uma grande variedade de outros softwares pode ser adaptada à técnica. Analise os filmes como segmentos de dois minutos. Primeiro, aplique um filtro às imagens que nivele o fundo e melhore o contraste dos objetos de minhoca.

No menu, selecione o processo. Em seguida, filtra, depois aprimora e depois nivela. Defina o parâmetro para um plano de fundo escuro e uma largura de recurso de 20 escolhas.

Agora analise a locomoção dos animais em cada anel separadamente com uma região circular de interesse que se sobrepõe ao anel de cobre. Identifique e rastreie os worms com o comando rastrear objetos no submenu de medição. Na janela da tabela de dados de rastreamento, use o botão de opções de rastreamento para permitir que faixas específicas sejam excluídas e limitar quaisquer artefatos experimentais.

Na guia de rastreamento automático, defina os parâmetros de rastreamento para um limite de velocidade de 400 mícrons por quadro. Defina o limite de aceleração como automático, defina o comprimento total mínimo da pista para 400 mícrons e defina o tipo de movimento predominante como caótico. Em seguida, no parâmetro track, defina os objetos para permitir que as trilhas parciais tenham um comprimento mínimo de 21 quadros e tenham uma profundidade de previsão de rastreamento de um quadro.

Agora, para iniciar o processo de rastreamento primeiro, clique no botão de função localizar todas as faixas automaticamente. Isso abre a caixa de diálogo de opções de tamanho de contagem e a caixa de diálogo de rastreamento. Selecione a opção manual para a seleção da faixa de intensidade na caixa de diálogo do tamanho da contagem.

Isso fornece uma etapa de limite importante. Em seguida, ajuste os controles deslizantes de limite de intensidade para criar um intervalo inclusivo que destaque objetos escuros. Um bom ponto de partida em uma escala é entre zero e 1.500.

Agora aplique um filtro de tamanho para excluir objetos maiores ou menores que um único worm. Vá para o menu de medição e selecione o submenu de medição. Isso abre a caixa de diálogo de opções de tamanho de contagem lá.

Defina o intervalo de área para 28 a 120.000 mícrons quadrados e defina o intervalo de perímetro para seis a 2.500 mícrons. Faça ajustes nesses parâmetros ao usar vermes de tamanho anormal. Agora, conclua o processo de rastreamento clicando.

Continue na caixa de diálogo de rastreamento. Verifique se a saída acompanha a filmagem. Certifique-se de que todos estejam representados, a menos que haja um motivo claro para filtrá-lo.

Em seguida, exclua manualmente as faixas produzidas por objetos que não sejam worms. Em seguida, calcule a velocidade de cada verme calculando a média da distância percorrida entre cada quadro ou a cada segundo e crie uma velocidade média para as trilhas em cada população. Considere esta média final como um ponto de amostragem para análise estatística do experimento.

Vários genótipos com controles foram analisados usando o protocolo descrito. Após 10 minutos de exposição ao etanol, as cepas sensíveis diferiram na locomoção de seu controle. Isso é marcado pelo grau de efeito no eixo esquerdo do gráfico.

A visão simples é que as estranhas, que apresentaram uma velocidade relativa maior que a do controle, foram consideradas resistentes ao etanol, enquanto as cepas com uma velocidade relativa menor aos controles foram consideradas sensíveis ao etanol. A comparação dos dados de 30 minutos de exposição ao etanol com os de 10 minutos de exposição ao etanol forneceu um índice de tolerância funcional aguda ao etanol ou a um FT. Uma discussão estendida deste e de outros resultados é fornecida no protocolo de texto. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a transferência de alimentos para a placa de ensaio.

Após este procedimento, o impacto do genótipo nos efeitos comportamentais de outras drogas pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como quais são os mecanismos de ação compartilhados entre diferentes drogas.