Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Este vídeo demonstra o uso de um instrumento automatizado de seleção por tamanho em gel para obter leituras aprimoradas em plataformas de sequenciamento de nova geração. Primeiro, amostras de água ambiental são coletadas e passadas por uma série de filtros para separar sistematicamente partículas de tamanho eucariótico, bacteriano e viral. As bactérias retidas são posteriormente concentradas por centrifugação.

Em seguida, o DNA bacteriano é extraído. O DNA extraído é utilizado para preparar bibliotecas nas quais adaptadores e índices são incorporados ao DNA fragmentado. O DNA é então amplificado por PCR, e as amostras são carregadas na estação de eletroforese.

Fragmentos de DNA dentro de uma faixa específica são então selecionados automaticamente. A análise de traços provenientes da eletroforese capilar baseada em chip e a bioinformática adicional demonstram que este método produz quantidades adequadas de fragmentos de DNA para análises posteriores, com agrupamento mínimo de fragmentos indesejados com menos de 200 pares de bases. A principal vantagem da estação quadrada de eletroforese automatizada ou de esferas paramagnéticas e outros sistemas comerciais é que ela permite uma faixa de seleção mais precisa e estreita, na qual até 96 amostras podem ser processadas em um único ensaio.

Embora este método possa fornecer informações sobre comunidades microbianas em amostras de água doce, ele pode ser aplicado a outros sistemas, como água do mar, tratamento de águas residuais, amostras vegetais, solo sedimentar ou tapetes microbianos, essencialmente qualquer amostra de DNA para a qual desejamos uma seleção estreita de tamanhos. Tivemos a ideia inicial para este método ao observar fragmentos curtos em sequências da plataforma MySEQ. Testamos várias abordagens de seleção de tamanho, incluindo diferentes tipos de para-bolas e proporções, bem como a abordagem manual de seleção por eletroforese em gel.

Então começamos a colaborar com a Coastal Genomics, uma empresa privada da Colúmbia Britânica que oferece a tecnologia Ranger, demonstrando o procedimento. Hoje estarão presentes Michael Chan, técnico de pesquisa do meu laboratório, Miguel Yi, pesquisador pós-doutorando do meu laboratório, e Jared Sloan, engenheiro da Coastal Genomics. Neste vídeo, descreveremos apenas a purificação e análise do material recuperado nos filtros de 0,2 mícrons, principalmente bactérias de vida livre, mas tenha em mente que abordagens semelhantes podem ser utilizadas para as outras partículas recuperadas dos filtros.

Inicie este procedimento coletando 40 litros de amostras de água doce de diversos locais ambientais em garrafões sanitizados de 20 litros. Pré-filtre as amostras in situ utilizando um filtro de polipropileno com malha de 105 micrômetros. Aqui, as amostras são coletadas de bacias hidrográficas influenciadas por áreas urbanas e agrícolas.

Após a coleta, coloque as amostras em caixas de isopor e transporte-as de volta para o laboratório. Armazene as amostras a quatro graus Celsius. No dia seguinte.

Monte um sistema de filtração que consista em um balde coletor de amostras conectado, por meio de uma bomba peristáltica, a uma cápsula de amostragem de um mícron tipo enviro check. Conecte a cápsula de amostragem a um filtro em disco de 0,2 mícron e este a um filtro tangencial de fluxo de 30 kilodaltons por meio de uma segunda bomba peristáltica. Ligue as bombas peristálticas para fazer as amostras passarem por uma série de filtros; as células eucarióticas serão isoladas à medida que passam pela cápsula de amostragem.

A fração bacteriana será isolada no filtro de disco de membrana, e as partículas virais serão isoladas no filtro de fluxo tangencial. Remova o filtro de membrana de 0,2 micrômetro ou os filtros do sistema de filtração de água. Em seguida, dobre o filtro ao meio e coloque-o em um tubo de 50 mililitros.

Com o lado aberto voltado para cima. Adicione cinco mililitros de PBS com tween ao tubo. Se mais de um filtro foi usado durante a filtração, utilize um tubo diferente para cada filtro.

Os filtros podem então ser armazenados a quatro graus Celsius ou processados imediatamente da seguinte forma. Em seguida, utilizando pinças estéreis, remova o filtro de membrana do tubo de 50 mililitros e coloque-o em uma placa de Petri com pinças estéreis e tesoura estéril. Corte o filtro em pedaços de um centímetro por um centímetro entre as amostras.

Desinfete os instrumentos mergulhando-os em isopropanol 70%, limpando-os com um descontaminante de superfície para DNA e, em seguida, enxaguando-os com água ultrapura tipo um. Coloque os pedaços do filtro de volta no mesmo tubo de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de PBS com tween para atingir um volume total de tampão de 15 mililitros, utilizando pinças estéreis.

Adicione seis esferas limpas de tungstênio, com três milímetros de diâmetro, a cada tubo de 50 mililitros. Tampe o tubo com parafilm e vortexe vigorosamente por 20 minutos.

Após vórtex, reunir todas as suspensões em um único tubo limpo de 50 mililitros para cada amostra. Centrifugar os tubos a 3.300 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet.

Em cinco mililitros de solução de PBS, distribua as células bacterianas em alíquotas de um mililitro em tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro e gire em uma microcentrífuga a 10.000 ×g por 10 minutos. Após a centrifugação, use uma pipeta para remover todo o sobrenadante, exceto 200 microlitros. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius ou prossiga para extrair o DNA bacteriano utilizando um kit comercialmente disponível de isolamento de DNA.

Durante a extração de DNA bacteriano, utilize PBS ou água como controle negativo de extração e *E. coli* como controle positivo de extração. Após o procedimento de extração de DNA, reúna as alíquotas da mesma amostra em um único tubo de dois mililitros com tampão tris 10 milimolar. Em seguida, realize uma precipitação noturna adicionando uma solução composta por 10% de acetato de sódio três molar, duas volumes de etanol 100% e cinco microlitros de acrilamida linear. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius.

No dia seguinte, centrifugue as amostras a 17.000 ×g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, lave o precipitado com um mililitro de etanol a 70% gelado e deixe o precipitado secar ao ar em uma cabine de segurança biológica por não mais de cinco minutos.

Em seguida, ressuspenda o pellet de DNA em tris 10 milimolar. Por fim, determine a quantidade e qualidade do DNA realizando um ensaio de quantificação de ácidos nucleicos fluorescente de alta sensibilidade, seguido por espectrometria em volume micro. Após determinar a quantidade de DNA em cada amostra, adicione a quantidade apropriada de água a cada tubo para ajustar a concentração a cerca de 0,2 nanogramas por microlitro.

Utilizando um kit comercialmente disponível, prepare uma biblioteca de DNA com fragmentos indexados a partir de um nanograma de DNA bacteriano. Aqui, aplica-se um método baseado em transposição, conhecido como mentação, para fragmentar simultaneamente e incorporar sequências adaptadoras ao DNA. Em seguida, realiza-se PCR para amplificar e indexar simultaneamente as amostras de ED, fornecendo assim códigos de barras específicos em cada fragmento e as sequências necessárias para a formação de clusters, que podem ser lidas pela plataforma de sequenciamento.

Após a conclusão da PCR, ignore o passo padrão de purificação pós-PCR e adicione 3,5 µL de tampão de carga a cada amostra, obtendo um volume total de 28,5 µL. Em seguida, transfira as amostras para uma placa de 96 poços. Coloque a placa de 96 poços em uma estação de eletroforese com uma cassete de agarose pré-moldada a 1,5% na interface do usuário do software Ranger.

Especifique uma faixa de seleção de tamanho entre 500 e 800 pares de bases. Defina o volume de extração como 300 microlitros. Inicie a corrida.

A estação de eletroforese carregará automaticamente as amostras nos cassetes aros. Em seguida, uma tensão é aplicada aos cassetes, e um sistema de imagem montado em um braço móvel é utilizado para identificar a localização do DNA da amostra nos aros durante toda a corrida.

O software Ranger captura imagens e, utilizando padrões internos, estima a posição do alvo de tamanho selecionado em cada amostra. Após os alvos serem identificados, o software Ranger varia. A tensão aplicada a cada amostra para sincronizar a chegada dos alvos nos poços de extração da fita.

Por fim, a estação de eletroforese aspira os alvos em TBE a partir dos poços de extração e os dispensa em uma nova placa de 96 poços para concentrar o material bruto obtido, precipitando o volume bruto do eluato usando acetato de sódio e etanol com acrilamida linear durante a noite a 80 graus Celsius negativos. Centrifugue as amostras novamente a 17.000 ×g por 30 minutos. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes e prossiga para lavar o pellet de DNA com um mililitro de etanol a 70%, gelado, centrifugando.

Centrifugue as amostras a 17.000 ×g por 30 minutos, descarte o sobrenadante, seque-as e, finalmente, reconstitua o pellet de DNA em tris-CL 10 milimolar. Prossiga com a normalização das amostras utilizando esferas de normalização de biblioteca, que estão incluídas no kit de preparação de biblioteca transpose on base. Finalmente, realize o sequenciamento de DNA utilizando uma plataforma de sequenciamento de nova geração para obter leituras mais informativas em plataformas de sequenciamento de nova geração, melhorando a qualidade das bibliotecas de sequenciamento.

Foram coletadas amostras de água em oito locais diferentes da bacia hidrográfica e foram preparadas bibliotecas de DNA índice a partir da fração bacteriana isolada, conforme mostrado neste eletroferograma. As bibliotecas de DNA geradas a partir de amostras de água doce após PCR, mas antes da seleção automatizada de tamanho, eram compostas por fragmentos com tamanhos variando de 50 pares de bases até 3000 pares de bases. Após a seleção de tamanho utilizando a plataforma automatizada de alto rendimento, as amostras apresentaram uma faixa estreita de fragmentos de DNA entre 500 e 800 pares de bases. Assim, o uso dessa plataforma automatizada de seleção de tamanho em gel resultou em rendimentos adequados e minimizou o agrupamento de fragmentos indesejados com menos de 200 pares de bases.

O sequenciamento de DNA desta biblioteca no MiSeq de alumínio gerou uma densidade de agrupamento de 1198 K por milímetro quadrado. A porcentagem de agrupamentos que passaram nos filtros foi de 84,2%, com um rendimento estimado de 9,2 gigabytes. Além disso, 7,4 gigabytes, ou 82,8%, das leituras apresentaram pontuação de qualidade maior ou igual a 30.

Isso significa que aproximadamente 83% da base sequenciada com este protocolo modificado e aplicado a amostras de água ambiental teve uma precisão de chamada de base de pelo menos 99,9%. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar dados mais informativos a partir de bibliotecas de sequenciamento. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar a fração microbiana que você está visando, a escolha da preparação da biblioteca, o comprimento do fragmento alvo e as plataformas de sequenciamento.