Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay
1 de maio de 2015
A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.
O objetivo geral deste procedimento é fornecer um ensaio de microplaca tridimensional in vitro, semiautomatizado e de invasão de células tumorais. Isso é feito primeiro gerando esteróides tumorais de tamanho reproduzível em suspensão em ultrabaixa fixação em volta do fundo 96, placas de poço de uma só vez esteróides em cada poço. O segundo passo é remover partes do meio e adicionar membrana basal como matriz ou BMM diretamente a cada poço para fornecer uma matriz semi-sólida na qual as células tumorais invadem o corpo esteróide.
Em seguida, a invasão de esteróides tumorais é monitorada em intervalos durante um período de 72 a 96 horas, durante o qual a aquisição da imagem é realizada automaticamente em um citômetro ou manualmente em um microscópio. A etapa final é analisar a invasão de células tumorais por meio de um citômetro automatizado ou software de imagem. Em última análise, o ensaio de invasão de esteróides tumorais 3D é usado para modelar a invasão do câncer in vitro em um formato fisiologicamente mais relevante e passível de estudos de validação de alvos e triagem de medicamentos.
Acreditamos que esta técnica é complementar aos ensaios simples de proliferação celular bidimensional normalmente usados para validação de alvos e triagem de medicamentos na pesquisa do câncer, porque também nos permite investigar a invasão, que é um aspecto fundamental da progressão do câncer em um formato tridimensional fisiologicamente relevante. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando otimizei o tumor 3D phe, o crescimento em microplaca. Achei que seria bom usar a mesma configuração e olhar também para a invasão, e o resultado foi fácil apenas remover uma parte do meio de cada poço e substituí-lo pela matriz semelhante à membrana do embasamento.
A demonstração visual deste método é essencial, pois manter os esteróides em uma posição central de cada poço após a tradição do BMM pode ser difícil no início. Isso pode resultar em uma análise de imagem abaixo do ideal devido aos esteróides estarem em diferentes planos focais. Com experiência.
Isso raramente acontece, mas, se necessário, o processo pode ser facilitado pela centrifugação suave da placa. Para começar todo o BMM no ICE durante a noite, mantenha um conjunto de pontas de filtro estéreis para pipetas P 10 E 200 e P 1000 e tubos estéreis estão a menos 20 graus Celsius. Coloque também as placas de 96 poços de fixação ultrabaixa contendo esteróides de quatro dias no gelo.
Usando uma pipeta multicanal, remova suavemente 100 microlitros por poço de meio de crescimento das placas do pardal. Para este degrau, incline a ponta em direção à parede interna da parte inferior em U. Bem evitando o contato com o fundo do poço e a localização do sphe.
A fim de minimizar a perturbação dos esteróides usando pontas geladas, transfira o BMM para tubos gelados. Para invasão induzida por citocinas ou para estudos de avaliação de drogas, adicione reagentes ao BMM usando pontas geladas. Por exemplo, use o fator de crescimento epidérmico ou EGF para estimular a invasão de células de carcinoma escamoso Cal S e cal r.
Em seguida, dispense suavemente 100 microlitros do BMM no ubo. Bem apontando a ponta para a parede interna do poço. Esta etapa é a mais crítica.
Quanto à análise óptica de imagem, os esteróides devem permanecer no centro do, bem. Repita esta etapa para todos os poços necessários, permitindo de cinco a seis réplicas por condição. Se necessário, mude para uma ponta recém-resfriada usando uma agulha estéril.
Remova as bolhas, se houver. Use um microscópio para verificar visualmente se os esteróides estão em uma posição central se não centrifugarem a placa a 300 vezes G por três minutos de quatro graus Celsius. Isso garantirá que os esteróides estejam localizados centralmente em cada poço.
Em seguida, transfira a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius e deixe o BMM solidificar uma hora depois. Use uma pipeta multicanal para adicionar suavemente 100 microlitros por poço de crescimento completo. Estudos de invasão ou avaliação de medicamentos induzidos por meio ou citocinas.
Inclua citocinas ou inibidores no meio para aquisição automatizada de imagens. Escaneie as placas no citômetro em intervalos. A partir do tempo zero, selecione o aplicativo de confluência.
Em seguida, verifique se o esteróide está em foco. Se necessário, ajuste o foco manualmente e corrija o deslocamento do foco. Em configurações de amostragem.
O seletor varre um campo de visão central. Após a adição de BMM, os esteróides tumorais deveriam ter permanecido em uma posição central. Assim, não há necessidade de escanear todo o poço no software.
Defina os poços a serem escaneados destacando-os no mapa de placas. Em seguida, clique em iniciar digitalização. Para análise automatizada de imagens, selecione o aplicativo de confluência.
Na guia de análise, ajuste as configurações do aplicativo para produzir uma segmentação precisa em torno do esteróide, incluindo processos celulares e invasores que se estendem para o BMM. Ajuste as configurações para cada linha de células tumorais e/ou em vários pontos de tempo. Verifique se as configurações de análise são apropriadas para outros esteróides na placa clicando em alguns poços diferentes.
Se a segmentação não delinear com precisão um esteróide, ajuste ainda mais as configurações do aplicativo. Clique em iniciar análise na guia de resultados. Verifique vários poços para verificar a qualidade da análise antes de exportar os dados de nível de poço para um programa de planilha.
Repita a análise para todos os pontos de tempo e, em seguida, calcule a porcentagem média de confluência para poços replicados e mais invasão em relação ao tempo em um gráfico de barras. Usando gráficos científicos e software estatístico de escolha para aquisição manual de imagens, use um microscópio invertido equipado com a objetiva de 10 x para registrar uma imagem para cada esteróide tumoral em intervalos. Começar de T é igual a zero depois de T é igual a entre 72 e 96 horas.
Dependendo da velocidade de invasão do revestimento celular em questão, use um objetivo Forex quando uma área invadida for muito grande para ser completamente capturada dentro do campo de visão de 10x. Salve cada imagem individual adquirida para análise manual de imagens. Abra as imagens gráficas do estágio na análise de imagem.
O software de escolha para calibração são imagens de um gráfico de palco. Usando objetivas de 10 x e quatro x. Insira as medidas gráficas, as unidades e as objetivas usadas e execute a calibração.
Esta etapa é necessária apenas uma vez para a análise de imagem subsequente. Basta recarregar as configurações de calibração necessárias. Em seguida, abra as imagens do ensaio de invasão e selecione as configurações de calibração dependendo da objetiva do microscópio usada para obter as imagens.
Meça a área coberta pelos esteróides no software usado aqui. Vá para medir e selecione o tamanho da contagem. Escolha enquanto carrega as configurações e selecione as configurações de ensaio predeterminadas.
Em seguida, escolha contar. O esteróide deve então ser segmentado com precisão. As medições de exportação são parâmetros diferentes para uma planilha e registram as informações relevantes da imagem na planilha.
Finalmente, plote a área média de esteróides replicados ou invasão versus tempo usando gráficos científicos e software estatístico. Mostrado aqui como um exemplo de invasão de células cancerígenas observada na linha celular de glioblastoma U 87 MG, que pode ser usada para exemplificar a invasão de tumores cerebrais. Uma vez incorporado em células BMM espalhadas com um padrão típico de invasão de explosão de estrelas, o processo é seguido por um período de 72 horas.
Análise de imagem totalmente automatizada. O uso de um citômetro de imagem produz uma segmentação em torno das saliências celulares e permite a quantificação precisa da invasão de células tumorais. Observe que, para esta linhagem celular, o corpo esteróide é excluído da medição da área invadida.
A análise de imagem totalmente automatizada é facilmente realizada e fornece quantificação da invasão de células tumorais ao longo do tempo. Um padrão diferente de invasão celular é exibido por isogênicos escamosos, de cabeça e pescoço humanos. As linhas de células cancerígenas Cal S são sensíveis e CAL R é resistente aos inibidores de tirosina quinase EG FFR.
Na ausência de EGF, nenhuma das linhagens celulares invadiu o BMM na presença de saliências semelhantes a dedos de EGF, extrudadas do corpo principal de esteróides Calars. Embora as células de Cal fossem menos invasivas após 72 horas, as imagens neste caso foram adquiridas rapidamente usando um citômetro de imagem e, para exemplificar um método alternativo, o grau de invasão foi quantificado manualmente usando um software de análise de imagem autônomo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada linha celular precisa ser otimizada para sua capacidade de formar esteróides, a densidade de semeadura celular, a composição da matriz e as configurações de imagem e análise Siga este procedimento. O mesmo método que também pode ser adaptado para avaliar uma invasão de tecido 3D usando, por exemplo, os tumores em co-cultura com corpos embrionários para se assemelhar a um tecido complexo ou outros organoides como astrócitos para glioma ou culturas de criptas para cânceres gastrointestinais, ou fígado para carcinoma hepatocelular e metástase de câncer de cólon.
Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio em microplaca semi-automatizado projetado para estudar a invasão de células tumorais em uma biomatriz 3D. O método permite o monitoramento do comportamento de células cancerígenas em um ambiente fisiologicamente mais relevante em comparação com ensaios tradicionais em 2D.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- A invasão de tecidos normais é uma característica marcante de tumores malignos.
- Os métodos atuais frequentemente dependem de ensaios em 2D, que podem não refletir com precisão as condições in vivo.
- Modelos 3D oferecem um ambiente mais realista para o estudo do comportamento tumoral.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar a compreensão da progressão do câncer por meio de técnicas de ensaio aperfeiçoadas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio in vitro reprodutível para invasão de células tumorais.
- Utilizar uma biomatriz 3D que imita o ambiente extracelular.
- Facilitar a triagem de fármacos e a validação de alvos na pesquisa do câncer.
Métodos Utilizados
- Criação de esferoides tumorais em placas com aderência ultrabaixa.
- Aplicação de uma matriz semelhante à membrana basal para estudos de invasão.
- Monitoramento da invasão por meio de imagem automatizada ou microscopia manual.
- Análise dos dados de invasão utilizando software especializado.
Resultados Principais
- O ensaio modela com sucesso a invasão de células tumorais em um contexto tridimensional.
- A análise de imagens permite a quantificação da invasão ao longo do tempo.
- O método demonstra reprodutibilidade e confiabilidade para diversos modelos de câncer.
- Ele fornece insights sobre a dinâmica da progressão do câncer.
Conclusões
- Este ensaio de invasão 3D é uma ferramenta valiosa para a pesquisa do câncer.
- Complementa os ensaios tradicionais em 2D ao incorporar a dinâmica de invasão.
- O método pode auxiliar no desenvolvimento de terapias direcionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio de invasão de esferoides tumorais tridimensionais preenche uma lacuna crítica na descoberta de fármacos contra o câncer, permitindo a modelagem fisiologicamente relevante da invasão tecidual, um fenótipo maligno fundamental frequentemente ignorado em ensaios de proliferação bidimensionais. O método auxilia na validação de alvos e na identificação de compostos promissores ao quantificar a dinâmica de invasão em formatos reprodutíveis e de alto conteúdo, adequados para triagem. Ele aumenta a confiança preditiva na desmistificação pré-clínica ao associar mecanismos moleculares a resultados funcionais de invasão em sistemas relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição do potencial invasivo da matriz como parâmetro funcional de malignidade.
- Valor Operacional: Permite a elucidação de vias por meio da modulação da sinalização EGFR e da invasão induzida por citocinas em modelos isogênicos.
- Impacto no Portfólio: Reforça a confiança no alvo ao distinguir fenótipos proliferativos de fenótipos invasivos em linhagens celulares tumorais resistentes e sensíveis.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece medições quantitativas de variáveis dependentes (porcentagem de confluência, área invadida) para perfis de dose-resposta e cinéticos.
- Valor Operacional: Oferece fluxos de trabalho semi-automatizados compatíveis com citômetros de imagem ou microscopia padrão com análise de imagem, garantindo escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite avaliação confiável de compostos ao padronizar leituras de invasão entre réplicas e pontos temporais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela sistemas relevantes para doenças utilizando linhagens de glioblastoma e carcinoma de cabeça e pescoço derivadas de pacientes com mecanismos de resistência conhecidos.
- Valor Operacional: Garante a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, mantendo protocolos consistentes de cultura tridimensional e quantificação.
- Impacto no Portfólio: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao identificar compostos que suprimem a invasão sem afetar a proliferação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líder e a avaliação pré-clínica, especialmente para programas de oncologia focados em mecanismos de metástase e resistência.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a modulação da invasão por meio de inibidores do EGFR, citocinas ou agentes citotóxicos em um contexto tridimensional.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da formação reprodutível de esferoides e sobreposição de matriz, gerando métricas padronizadas de invasão ao longo de 72–96 horas.
- Análises: Gera resultados quantitativos (confluência, área, métricas de protrusão) que permitem comparações entre condições e pontos temporais utilizando softwares científicos de criação de gráficos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a invasão em linhagens humanas de câncer com relevância clínica para a progressão de glioma e SCCHN.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável adaptável a múltiplos tipos de câncer, composições de matriz e modalidades de leitura (automatizadas ou manuais).
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva ao capturar a invasão, uma característica fundamental da malignidade, complementando ensaios baseados apenas na proliferação.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de tamanho definido de esferoides, aplicação de matriz e protocolos de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao identificar compostos anti-invasivos precocemente, reduzindo falhas em estágios avançados devido ao potencial metastático.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao separar efeitos citostáticos de efeitos anti-invasivos na otimização de compostos líderes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular tridimensional, técnica estéril e otimização da formação de esferoides por linhagem celular.
- Depende de placas com aderência ultrabaixa, matriz semelhante à membrana basal e sistemas de imagem (citômetro ou microscópio com software de análise).
- Necessita padronização entre equipes quanto à densidade de semeadura, volume da matriz e cronograma de pontos temporais para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos de tumores, incluindo modelos de co-cultivo com componentes estromais ou organoides.
- Limitado pela necessidade de centralização cuidadosa dos esferoides para evitar discrepâncias no plano focal durante a análise de imagem, o que pode ser atenuado por breve centrifugação, se necessário.
