Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um ensaio de microplaca tridimensional in vitro, semiautomatizado e de invasão de células tumorais. Isso é feito primeiro gerando esteróides tumorais de tamanho reproduzível em suspensão em ultrabaixa fixação em volta do fundo 96, placas de poço de uma só vez esteróides em cada poço. O segundo passo é remover partes do meio e adicionar membrana basal como matriz ou BMM diretamente a cada poço para fornecer uma matriz semi-sólida na qual as células tumorais invadem o corpo esteróide.

Em seguida, a invasão de esteróides tumorais é monitorada em intervalos durante um período de 72 a 96 horas, durante o qual a aquisição da imagem é realizada automaticamente em um citômetro ou manualmente em um microscópio. A etapa final é analisar a invasão de células tumorais por meio de um citômetro automatizado ou software de imagem. Em última análise, o ensaio de invasão de esteróides tumorais 3D é usado para modelar a invasão do câncer in vitro em um formato fisiologicamente mais relevante e passível de estudos de validação de alvos e triagem de medicamentos.

Acreditamos que esta técnica é complementar aos ensaios simples de proliferação celular bidimensional normalmente usados para validação de alvos e triagem de medicamentos na pesquisa do câncer, porque também nos permite investigar a invasão, que é um aspecto fundamental da progressão do câncer em um formato tridimensional fisiologicamente relevante. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando otimizei o tumor 3D phe, o crescimento em microplaca. Achei que seria bom usar a mesma configuração e olhar também para a invasão, e o resultado foi fácil apenas remover uma parte do meio de cada poço e substituí-lo pela matriz semelhante à membrana do embasamento.

A demonstração visual deste método é essencial, pois manter os esteróides em uma posição central de cada poço após a tradição do BMM pode ser difícil no início. Isso pode resultar em uma análise de imagem abaixo do ideal devido aos esteróides estarem em diferentes planos focais. Com experiência.

Isso raramente acontece, mas, se necessário, o processo pode ser facilitado pela centrifugação suave da placa. Para começar todo o BMM no ICE durante a noite, mantenha um conjunto de pontas de filtro estéreis para pipetas P 10 E 200 e P 1000 e tubos estéreis estão a menos 20 graus Celsius. Coloque também as placas de 96 poços de fixação ultrabaixa contendo esteróides de quatro dias no gelo.

Usando uma pipeta multicanal, remova suavemente 100 microlitros por poço de meio de crescimento das placas do pardal. Para este degrau, incline a ponta em direção à parede interna da parte inferior em U. Bem evitando o contato com o fundo do poço e a localização do sphe.

A fim de minimizar a perturbação dos esteróides usando pontas geladas, transfira o BMM para tubos gelados. Para invasão induzida por citocinas ou para estudos de avaliação de drogas, adicione reagentes ao BMM usando pontas geladas. Por exemplo, use o fator de crescimento epidérmico ou EGF para estimular a invasão de células de carcinoma escamoso Cal S e cal r.

Em seguida, dispense suavemente 100 microlitros do BMM no ubo. Bem apontando a ponta para a parede interna do poço. Esta etapa é a mais crítica.

Quanto à análise óptica de imagem, os esteróides devem permanecer no centro do, bem. Repita esta etapa para todos os poços necessários, permitindo de cinco a seis réplicas por condição. Se necessário, mude para uma ponta recém-resfriada usando uma agulha estéril.

Remova as bolhas, se houver. Use um microscópio para verificar visualmente se os esteróides estão em uma posição central se não centrifugarem a placa a 300 vezes G por três minutos de quatro graus Celsius. Isso garantirá que os esteróides estejam localizados centralmente em cada poço.

Em seguida, transfira a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius e deixe o BMM solidificar uma hora depois. Use uma pipeta multicanal para adicionar suavemente 100 microlitros por poço de crescimento completo. Estudos de invasão ou avaliação de medicamentos induzidos por meio ou citocinas.

Inclua citocinas ou inibidores no meio para aquisição automatizada de imagens. Escaneie as placas no citômetro em intervalos. A partir do tempo zero, selecione o aplicativo de confluência.

Em seguida, verifique se o esteróide está em foco. Se necessário, ajuste o foco manualmente e corrija o deslocamento do foco. Em configurações de amostragem.

O seletor varre um campo de visão central. Após a adição de BMM, os esteróides tumorais deveriam ter permanecido em uma posição central. Assim, não há necessidade de escanear todo o poço no software.

Defina os poços a serem escaneados destacando-os no mapa de placas. Em seguida, clique em iniciar digitalização. Para análise automatizada de imagens, selecione o aplicativo de confluência.

Na guia de análise, ajuste as configurações do aplicativo para produzir uma segmentação precisa em torno do esteróide, incluindo processos celulares e invasores que se estendem para o BMM. Ajuste as configurações para cada linha de células tumorais e/ou em vários pontos de tempo. Verifique se as configurações de análise são apropriadas para outros esteróides na placa clicando em alguns poços diferentes.

Se a segmentação não delinear com precisão um esteróide, ajuste ainda mais as configurações do aplicativo. Clique em iniciar análise na guia de resultados. Verifique vários poços para verificar a qualidade da análise antes de exportar os dados de nível de poço para um programa de planilha.

Repita a análise para todos os pontos de tempo e, em seguida, calcule a porcentagem média de confluência para poços replicados e mais invasão em relação ao tempo em um gráfico de barras. Usando gráficos científicos e software estatístico de escolha para aquisição manual de imagens, use um microscópio invertido equipado com a objetiva de 10 x para registrar uma imagem para cada esteróide tumoral em intervalos. Começar de T é igual a zero depois de T é igual a entre 72 e 96 horas.

Dependendo da velocidade de invasão do revestimento celular em questão, use um objetivo Forex quando uma área invadida for muito grande para ser completamente capturada dentro do campo de visão de 10x. Salve cada imagem individual adquirida para análise manual de imagens. Abra as imagens gráficas do estágio na análise de imagem.

O software de escolha para calibração são imagens de um gráfico de palco. Usando objetivas de 10 x e quatro x. Insira as medidas gráficas, as unidades e as objetivas usadas e execute a calibração.

Esta etapa é necessária apenas uma vez para a análise de imagem subsequente. Basta recarregar as configurações de calibração necessárias. Em seguida, abra as imagens do ensaio de invasão e selecione as configurações de calibração dependendo da objetiva do microscópio usada para obter as imagens.

Meça a área coberta pelos esteróides no software usado aqui. Vá para medir e selecione o tamanho da contagem. Escolha enquanto carrega as configurações e selecione as configurações de ensaio predeterminadas.

Em seguida, escolha contar. O esteróide deve então ser segmentado com precisão. As medições de exportação são parâmetros diferentes para uma planilha e registram as informações relevantes da imagem na planilha.

Finalmente, plote a área média de esteróides replicados ou invasão versus tempo usando gráficos científicos e software estatístico. Mostrado aqui como um exemplo de invasão de células cancerígenas observada na linha celular de glioblastoma U 87 MG, que pode ser usada para exemplificar a invasão de tumores cerebrais. Uma vez incorporado em células BMM espalhadas com um padrão típico de invasão de explosão de estrelas, o processo é seguido por um período de 72 horas.

Análise de imagem totalmente automatizada. O uso de um citômetro de imagem produz uma segmentação em torno das saliências celulares e permite a quantificação precisa da invasão de células tumorais. Observe que, para esta linhagem celular, o corpo esteróide é excluído da medição da área invadida.

A análise de imagem totalmente automatizada é facilmente realizada e fornece quantificação da invasão de células tumorais ao longo do tempo. Um padrão diferente de invasão celular é exibido por isogênicos escamosos, de cabeça e pescoço humanos. As linhas de células cancerígenas Cal S são sensíveis e CAL R é resistente aos inibidores de tirosina quinase EG FFR.

Na ausência de EGF, nenhuma das linhagens celulares invadiu o BMM na presença de saliências semelhantes a dedos de EGF, extrudadas do corpo principal de esteróides Calars. Embora as células de Cal fossem menos invasivas após 72 horas, as imagens neste caso foram adquiridas rapidamente usando um citômetro de imagem e, para exemplificar um método alternativo, o grau de invasão foi quantificado manualmente usando um software de análise de imagem autônomo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada linha celular precisa ser otimizada para sua capacidade de formar esteróides, a densidade de semeadura celular, a composição da matriz e as configurações de imagem e análise Siga este procedimento. O mesmo método que também pode ser adaptado para avaliar uma invasão de tecido 3D usando, por exemplo, os tumores em co-cultura com corpos embrionários para se assemelhar a um tecido complexo ou outros organoides como astrócitos para glioma ou culturas de criptas para cânceres gastrointestinais, ou fígado para carcinoma hepatocelular e metástase de câncer de cólon.