Name: Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) de sangue humano usando centrifugação diferencial e PMA. Este método demonstra como os NETs afetam a adesão de células cancerígenas em ensaios in vitro.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Paul Kubes por sua orientação e orientação que foram fundamentais na construção deste trabalho.

NOTA: Todas as experiências foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas institucionais locais. Desenho 1. Sangue <ol><li> Através venipucture antecubital, coletar 14 tubos de sangue de voluntários saudáveis ​​em top verde tubos (heparina) e inverta cada tubo antes de se estabelecer em gelo. Recolha de sangue dentro de 10-15 min de experiência para garantir um rendimento óptimo de neutrófilos. </li></ol> 2. Neutrophil Isolamento de Sangue Total <ol><li> Lave cada tubo superior verde do sangue com 5 ml de PBS sem Ca e Mg para diluir o sangue. Em cada uma de 4 x 50 ml tubos cónicos, adicionar 15 ml de Meios de Separação de Linfócitos (LSM) à TA. Usando uma agulha de 18 G, montado em uma seringa de 60 ml, a camada cuidadosamente o sangue diluído para o LSM, criando uma interface de LSM-sangue afiado. NOTA: Evitar a mistura das camadas, tanto quanto possível. </li><li> Centrifuga-se a 800 xg durante 30 min a 21 ° C, sem ruptura. NOTA: Sudden pausas podemprovocar a mistura das diferentes camadas. </li><li> Observe a eritrócitos e neutrófilos sedimento no fundo. Aspirar e descartar o top 2 camadas (plasma e LSM) certificando-se para se livrar da interface entre essas camadas que contém linfócitos e células mononucleares, deixando apenas a camada vermelha de fundo. </li><li> Para cada tubo, adicionar 20 ml de Tampão de fosfato salino (PBS) e Dextran 20 ml de 6%. Inverter cuidadosamente cada tubo para misturar com a camada de eritrócitos e neutrófilos e permitir a sentar-se à TA durante 30 min. NOTA: Este irá permitir que as células vermelhas do sangue (RBC) para sedimentar no fundo. </li><li> Depois de 30 minutos, transferir o sobrenadante rico neutrófilos para tubos frescos e descartar as pelotas de RBC. Sobrenadantes de centrifugação a 450 xg, a 4 ° C durante 5 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante descartar. O sedimento conterá principalmente neutrófilos e poucos glóbulos vermelhos. </li><li> Prepara-se uma solução de lise pela adição de 0,5 ml de tampão de lise de 4.5 ml de água estéril. Lyse restante RBC com tele preparou 5 ml de solução de lise, transferindo todos os sedimentos ressuspensos em um tubo. Permita que a lise à temperatura ambiente, no escuro, durante 10 min. </li><li> Centrifuga-se a 450 xg a 4 ° C durante 5 min. Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 5 ml PBS sem Ca e Mg e centrifugar novamente a 450 xg a 4 ° C para se livrar de qualquer solução de lise restante. O sedimento obtido neste ponto contém os neutrófilos. Ressuspender o sedimento em 30 ml de RPMI frio 3% e colocado em gelo. NOTA: 3% de RPMI é feita suplementando meio RPMI com 3% de Soro Fetal Bovino (FBS) </li><li> Verifique a pureza da amostra, utilizando coloração com azul de metileno. &gt; 95% das células devem ser granulócitos com núcleos múltiplos lobares. Use coloração com azul de Trypan para verificar&gt; 95% de viabilidade de células e contar o rendimento final de neutrófilos. Dilui-se neutrófilos de gelo frio de 3% de RPMI para se obter uma concentração final de 5 x 10 6 / ml neutrófilos. </li></ol> 3. NETs Generation <ol><li> Estimular neutrófilos com 500 nM de PMA (30 por ml de solução de neutrófilos) e incuba-se em um prato de cultura de tecido plana 150 mm x 25 mm com grelha de 20 mm para 4 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Isto irá permitir que NETosis. </li><li> Depois de 4 horas de estimulação, aspirar cuidadosamente e descartar a mídia, deixando a camada de redes e neutrófilos aderidos na parte inferior. Não perturbar essa camada. </li><li> Usando um total de 15 ml de PBS frio, sem Ca e Mg por placa, lava-se a parte inferior de cada prato por pipetagem de 15 ml de PBS no fundo do prato de forma a levantar todo o material aderente da parte inferior. </li><li> Recolhe solução obtida a partir de lavar cada prato (passo 3.3) em um tubo de 15 ml e centrifugar durante 10 minutos a 450 xg, a 4 ° C. Os neutrófilos e as células restantes irá sedimentar no fundo, deixando uma rica em NET sobrenadante livre de células. </li><li> Dividir o sobrenadante para tubos de 1,5 ml de micro-centrifugação e centrifugação durante 10 min a 18.000 xg, a 4 ° C. Isso permitirá que todo o ADN para sedimentar. NOTA: A centrifugação em maior tubes tempo é mais fácil e menos demorado se velocidades tão altas são atingíveis na centrífuga normal, caso contrário, será necessário dividir os sobrenadantes em tubos de menor diâmetro, a fim de utilizar micro-centrífuga de alta velocidade. </li><li> Rejeitar sobrenadante e ressuspender todas granulados obtidos em conjunto em PBS gelado a uma concentração correspondente a 2 x 10 7 neutrófilos por 100 ul de PBS. Isto vai dar origem ao estoque NET isento de células que podem ser utilizadas para as experiências subsequentes. </li><li> Medir a concentração de ADN na amostra obtida utilizando espectrofotometria ou ferramenta de quantificação do ADN alternativo. Uma concentração adequada na amostra deve variar entre 140-180 ng / ul. </li></ol> 4. NET-celular do cancro Ensaio de Adesão estática <ol><li> Adicionar 100 ul de estoque líquido obtido anteriormente por poço numa placa de fundo plano 96 e assim permitir a revestir poços de O / N a 4 ° C no escuro. </li><li> Entre 12 e 20 h mais tarde, verificar a formação de uma monocamada uniforme de célulasNET livres no fundo dos poços, sob o microscópio (Figura 1). Neste ponto, aspirar delicadamente todo o material não aderente dos poços, tomando cuidado para não perturbar a monocamada NET na parte inferior. </li><li> Adicionar 100 uL de 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) a solução de bloqueio a cada poço e deixar durante 1 hora à TA. </li><li> Separar as células cancerosas A549 a partir de um frasco T-75 utilizando 2 ml de solução de tripsina a 0,25%. Uma vez separado, adicionar 10 ml de meio de células A549 tratadas com tripsina e centrifugar a 450 xg, a 4 ° C durante 5 min. Rejeitar sobrenadante e ressuspender as células em meio para se obter uma concentração de 2 x 10 4 células cancerosas por 100 ul meios. NOTA: As células A549 foram cultivadas em separado. Resumidamente, as células foram cultivadas e mantidas em meio DMEM F12, contendo 10% de FBS e 1% de penicilina estreptomicina e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO 2. Uma vez que 70-80% de confluência de células foi alcançado, eles foram destacadas usando 0,25% de tripsina-EDTA e ressuspensas no mesmo meiodescrito acima. </li><li> Células de cancro da mancha usando CFSE por adição de 1 ul de CFSE por ml de meio e deixar a manchar a TA durante 10 min. Após a coloração, centrifugar a 450 xg para baixo a 4 ° C durante 5 min e depois descartar sobrenadante e ressuspender as células em volume inicial de meio para se obter uma concentração de 2 x 10 4 células cancerosas por 100 ul meios. </li><li> Após 1 hr de NET bloqueio, suavemente aspirado solução de bloqueio e adicionar 2 x10 4 células cancerosas em meio, o que é equivalente a 100 ul, por poço através da monocamada NET e permitir a aderir durante 90 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Suavemente aspirar as células e adicionar 100 ul de PBS a cada poço para lavar quaisquer células não aderentes. </li><li> Em alguns poços, adicionar 1000U de DNAse1 por poço durante 10 minutos antes da lavagem para degradar NET. Isso servirá como controle negativo. Em outras cavidades, adicionar 100 uL de água estéril por poço durante 10 min, o que vai servir como o controlo de veículo (VC). NOTA: 3 replicados por condition são geralmente realizadas para aumentar o tamanho da amostra. </li><li> Aspirar e descartar todos solução nas cavidades, deixando apenas NET e células cancerosas aderentes ao fundo. Adicionar 100 ul de solução de formaldeído a 4% por poço para fixar as células cancerosas aderentes para NETS e ler ensaio sob o microscópio de fluorescência (Figura 1). Plot e analisar os resultados (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li>
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<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes%2C+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li>
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<li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li>
<li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides%2Fprotamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li>
<li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death%3A+a+predominant+role+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366(2012).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar

O protocolo de isolamento Armadilha de Neutrófilos Extracelular demonstrado neste vídeo combina diferentes técnicas utilizadas na literatura para o isolamento dos neutrófilos e de formação NET. Ele simplifica um processo bastante complexo e variável e oferece uma maneira muito confiável e replicável para isolar NETs livres de células purificadas com menos etapas do que outros protocolos. Além disso, reagentes prontamente disponíveis são empregados adicionando à simplicidade protocolos e reduzindo significativamente o se...

Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETs) são recém-descoberto elementos derivadas de neutrófilos compostas de cadeias de DNA extracelular decoradas por centenas de proteínas e histonas. Eles são segregadas por neutrófilos no contexto da infecção e inflamação seguintes estímulos específicos e eles foram reconhecidos inicialmente fazer parte dos mecanismos de defesa contra as infecções de neutrófilos. Eles foram mostrados primeiro a promover a captura de vários invasores microbianos, incluindo bactérias, vírus e fungos 1-3. Aprisionando do micróbio, então, levar a sua destruição tanto diretamente pelo proteínas associadas a NET 3,4 e indiretamente através de recrutamento local de células fagocíticas 5,6. O papel de NET, contudo, não parece ser limitado a defesa do hospedeiro. Mais recentemente, têm sido mostrado desempenhar um importante papel em doenças auto-imunes 7,8, trombose 9, desordens relacionadas com a gravidez 10 e ainda a progressão do cancro11,12. Por conseguinte, afigura-se que as redes de desempenhar um papel importante em um grande número de diversos processos fisiológicos. No entanto, dada a natureza inovadora de tais pesquisas, ainda há muito a ser elucidado com respeito aos mecanismos pelos quais NETs exercem os seus efeitos. Este trabalho apresenta um método simplificado para o isolamento de NET na ausência de neutrófilos. No vídeo a seguir, demonstramos uma técnica simplificada e fácil de isolar NETs de sangue humano. NET isentos de células podem então ser utilizados em uma série de experiências in vitro, incluindo coloração, imuunofluorescence, apagando assim como um certo número de ensaios, tais como adesão, migração e proliferação. Outros protocolos de existir 13, 19, no entanto eles são geralmente longos, complexos, caros, e frequentemente, baixo rendimento 13. Este protocolo simplificado utiliza reagentes básicos e diminui o número de passos necessários para isolar neutrófilos, minimizando assim o comprimento da procedure ao mesmo tempo maximizar o rendimento. O método a seguir combina diferentes técnicas para isolamento de neutrófilos anteriormente descrito na literatura para obtenção de um protocolo simples, obtendo-se uma amostra muito pura de neutrófilos vivos. Tal como sugerido na literatura, o sangue venoso é recolhido em tubos com EDTA e utilizado dentro de 10 minutos para evitar a activação de neutrófilos 14. Usamos Meios de Separação de Linfócitos (LSM) centrifugação com gradiente de densidade para isolar granulócitos e células vermelhas do sangue heparinizado a partir de sangue total, um método adaptado de a técnica de centrifugação de densidade Ficoll inicialmente descrito por Boyum et al 15. LSM é uma modificação da formulação Boyum que substitui o diatrizoato de sódio para o metrizoato de sódio e foi utilizada com sucesso em muitos estudos para isolar neutrófilos 16-18. Após centrifugação diferencial de densidade, monócitos e linfócitos são descartados; células vermelhas do sangue são então sedimentadoutilizando uma solução de dextrano a 6% e os 14 restantes glóbulos vermelhos são lisadas para se obter uma população de neutrófilos puros, que é verificada com azul de Tripano e coloração com azul de metileno. Numerosos agentes têm sido utilizados para induzir NETosis tanto in vitro e in vivo, incluindo lipopolissacárido (LPS), e acetato de miristato de forbol (PMA) e as interleucinas (IL-8) 3,5,6. No seguinte protocolo, isolados neutrófilos são estimuladas com PMA 500 ​​nM durante 4 horas, o que tem sido demonstrado ser uma concentração adequada para permitir a formação NET consistente e fiável sem promover a apoptose 19,20. Após o isolamento, é mostrado como NET isentos de células obtidos a partir deste protocolo pode ser utilizado em um ensaio de adesão. DNAse1 é utilizado para digerir ou degradar NET como descrito anteriormente e, portanto, serve como um controlo 2,3,11. Outras opções incluem a utilização de inibidor de elastase de neutrófilos (NEI) para inibir formati NET, o que é uma alternativa aceitável quando o objectivo é inibir a formação de NET, em vez de efectuar a sua degradação 11. Embora NEi tem um número de funções variadas, foi previamente mostrado que a deposição NET pode ser inibida por NEi por bloqueio da descondensação de cromatina, a desgranulação de neutrófilos e a morte nuclear 12

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (PBS), modificada, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Meio de separação de linfócitos (LSM)</td><td>Wisent</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de dextrano (pó)</td><td>Spectrum</td><td>DE130</td><td>6% A solução de dextrano é feita suplementando PBS com Ca e Mg com 6% de pó de dextrano</td></tr><tr><td>Meio RPMI-1640 com L-glutamina</td><td>Wisent</td><td>A solução de 350-000-CL</td><td>3% RPMI é feita suplementando RPMI com 3% de soro fetal bovino</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse Lysing tampão</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td> <td>Sigma-Alrdrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos Integrid com grade de 20 mm (150 x 25 mm)</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

simplificado humanos neutrófilos extracelulares traps (nets) isolamento e manuseio

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrófilos extracelulares Armadilhas (NETS), foram recentemente identificadas como parte do arsenal antimicrobiano da neutrófilo. Para além do seu papel no combate às infecções, investigação recente demonstrou que eles podem ser envolvidos em muitos outros processos de doença, incluindo a progressão do cancro. Isolando NETs purificadas é um elemento crucial para permitir que o estudo dessas funções. Neste vídeo, demonstramos um método simplificado de célula livre isolamento NET a partir de sangue humano utilizando reagentes facilmente disponíveis. Isolado NET pode então ser utilizado para a coloração de imunofluorescência, blotting ou vários ensaios funcionais. Isto permite uma avaliação das suas propriedades biológicas na ausência dos potenciais efeitos de confusão dos próprios neutrófilos. Uma técnica de separação por gradiente de densidade é utilizada para isolar os neutrófilos a partir de sangue completo de dadores saudáveis. Isolado neutrófilos são então estimulados por forbol 12-myrsiState 13-acetato (PMA) para induzir NETosis. Os neutrófilos activados são então descartados, e um estoque NET livre de células é obtida. Em seguida, demonstram como NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão com células de cancro do pulmão humano A549. O estoque NET é utilizado para revestir os poços de uma cultura de células de 96 poços da placa S / N, e depois de se assegurar a formação de uma monocamada NET adequada no fundo dos poços, CFSE rotulados células A549 são adicionados. As células aderentes são quantificados utilizando um microscópio de fluorescência Nikon TE300. Em alguns poços, 1000U DNAse1 é adicionado 10 minutos antes da contagem de degradar NET

Realização bem sucedida de um ensaio de adesão estático com NET requer revestimento adequada dos poços com uma monocamada de NET antes da adição de células de cancro (Figura 1). Todos os passos subsequentes deve ser feito com cuidado para não perturbar essa camada. Quando uma camada adequada de NET é formada, espera-se ver as células cancerosas significativa adesão às NET como pode ser visto na Figura 2A e 2C. Este efeito é abolida pela adição de DNAse1, que degrada NET...

No seguinte protocolo, descrevemos um modo muito simples para isolar armadilhas de Neutrófilos extracelulares (NETS) a partir de sangue total humano utilizando reagentes prontamente disponíveis. Em seguida, demonstram como os NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão in vitro com células cancerosas.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

O objetivo geral do seguinte experimento é demonstrar um protocolo simples para o isolamento de armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs, a partir de sangue total humano, utilizando reagentes de fácil acesso. Isso é alcançado primeiramente isolando neutrófilos do sangue total humano, utilizando uma técnica de centrifugação diferencial como segundo passo. Os neutrófilos isolados são estimulados com PMA para induzir a formação de NETs, processo também denominado NETose.Em seguida, prepara-se uma placa com um isolado de rede livre de células e adicionam-se células cancerígenas para demonstrar como as redes afetam a adesão dessas células. Os resultados mostram que a adição de uma monocamada de rede melhora a adesão de células cancerígenas 5 49 e que essa adesão é reduzida quando as redes são degradadas. O uso de DNAS é uma demonstração visual crítica deste método.Dada a novidade desta técnica, o manuseio de armadilhas celulares de neutrófilos é extremamente difícil devido à fragilidade dessas estruturas. Para começar, obtenha 80 mililitros de sangue humano total fresco em 14 tubos com tampa verde heparinizados, conforme descrito no protocolo textual. Abra cada tubo e adicione

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para gerar e isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Os neutrófilos são isolados do sangue periférico e estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA) para produzir TNEs. Durante a incubação, os neutrófilos passam por um processo de morte celular (NETosis) para liberar NETs compreendendo cromatina descondensada misturada com proteínas citoplasmáticas granulares.

Uma técnica in vitro para gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.

Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Aprenda a isolar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) de sangue humano usando centrifugação diferencial e PMA. Este método demonstra como os NETs afetam a adesão de células cancerígenas em ensaios in vitro.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

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