Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar um protocolo simples para isolar neutrófilos, armadilhas extracelulares ou redes de sangue total humano usando reagentes prontamente disponíveis. Isso é conseguido isolando primeiro os neutrófilos do sangue total humano, usando uma técnica de centrifugação diferencial como segunda etapa. Neutrófilos isolados são estimulados com PMA para induzir a formação de redes, também chamada de NETose.

Em seguida, uma placa é preparada com um isolado de rede livre de células e células cancerígenas são adicionadas para demonstrar como as redes afetam a adesão das células. Os resultados mostram que a adição de uma rede monocamada melhora a adesão de 5 49 células cancerígenas e que essa adesão é reduzida quando as redes são degradadas. Usando DNAS uma demonstração visual deste método é fundamental.

Dada a novidade desta técnica, o manuseio de neutrófilos ou armadilhas celulares são extremamente difíceis devido à fragilidade dessas estruturas. Para começar, obtenha 80 mililitros de sangue total humano fresco em 14 tubos superiores verdes heparinizados, conforme descrito no protocolo de texto. Abra cada tubo e adicione cinco mililitros de PBS sem cálcio e magnésio a cada tubo.

Em seguida, adicione 15 mililitros de meio de separação de linfócitos ou LSM em cada um dos quatro tubos cônicos de 50 mililitros à temperatura ambiente. Em seguida, use uma agulha de calibre 18 montada em uma seringa de 60 mililitros para colocar cuidadosamente o sangue diluído no LSM, criando uma interface sanguínea LSM afiada, centrifugue os tubos a 800 vezes G por 30 minutos a 21 graus Celsius sem quebrar para parar a centrífuga, aspire e descarte cuidadosamente as duas camadas líquidas superiores e a interface entre elas, deixando apenas a camada vermelha inferior. Este pellet contém eritrócitos e neutrófilos.

Adicione 20 mililitros de PBS e 20 mililitros de solução de dextrano a 6% a cada tubo. Inverta suavemente cada tubo e deixe-os descansar em temperatura ambiente por 30 minutos. Os glóbulos vermelhos sedimentarão no fundo do tubo.

Em seguida, transfira os sobrenadantes para tubos novos e descarte os paletes. Centrifugue os sobrenadantes a 450 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante, deixando o pellet rico em neutrófilos. Prepare uma solução de lise com 0,5 mililitros de tampão de lise em 4,5 mililitros de água estéril.

Adicione um total de cinco mililitros da solução de lise a cada tubo e agrupe todos os pellets em um frasco. Coloque o frasco no escuro por 10 minutos em temperatura ambiente para piolhos de quaisquer glóbulos vermelhos restantes. Centrifugue os neutrófilos a 450 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e lave o pellet com cinco mililitros de PBS sem cálcio e magnésio. Em seguida, centrifugar novamente a amostra a 450 vezes G a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante que contém a solução de lise restante. Ressuspenda o pellet de neutrófilos em 30 mililitros de meio RPMI frio suplementado com soro bovino fetal a 3% e coloque o tubo no gelo para estimular a formação de armadilhas ou redes extracelulares de neutrófilos.

Adicione 500 nano molares de PMA a 30 litros da suspensão de neutrófilos em uma placa plana de cultura de tecidos de 150 milímetros por 25 milímetros. Com uma grade de 20 milímetros, incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, aspire suavemente e descarte o meio, tomando cuidado para não romper a camada de redes e neutrófilos aderirem ao fundo do prato.

Em seguida, use uma pipeta para lavar o fundo de cada prato com 15 mililitros de PBS frio sem cálcio e magnésio, todo o material aderente deve ser removido do fundo. Recolher a suspensão de lavagem num tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 450 vezes G durante 10 minutos. A quatro graus Celsius, os neutrófilos e quaisquer células restantes serão atingidos na parte inferior.

Deixando um sobrenadante rico em rede livre de células, em seguida, decanta o sobrenadante em vários tubos de 1,5 mililitro e centrifuga a oito 18.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para granular o DNA, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em PBS de modo que a concentração corresponda a duas vezes 10 elevado ao sétimo neutrófilo por 100 microlitros de PBS. Este estoque líquido livre de células pode ser usado para experimentos subsequentes.

Meça a concentração de DNA da amostra usando espectrofotometria. Uma concentração adequada deve variar entre 140 e 180 nanogramas por microlitro a 100 microlitros do estoque líquido em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços e incubar a placa durante a noite a quatro graus Celsius no escuro para revestir os poços 12 a 20 horas depois, use um microscópio para verificar a formação de uma monocamada uniforme de redes livres de células no fundo dos poços. Uma vez verificada a monocamada, aspire suavemente todo o material não aderente para fora dos poços.

Certificando-se de não interromper a monocamada na parte inferior. Este é o aspecto mais desafiador deste procedimento. Para manter uma monocamada líquida adequada, você deve manusear a placa com muito cuidado.

Adicione todos os reagentes e células lentamente na lateral dos poços, aspire muito suavemente e evite tocar no fundo do poço com uma ponta de sucção. Com o material não aderente removido, adicione suavemente 100 microlitros de uma solução de bloqueio de albumina de soro bovino a 1% em cada poço e deixe por uma hora em temperatura ambiente. Não agite ou agite a placa, pois isso pode romper a camada mono da rede.

Em seguida, prepare 5 49 células cancerígenas colhendo-as quando estiverem 70 a 80% confluentes. Usando técnicas padrão, ressuspenda as células em meio a uma concentração de duas vezes 10 elevado a quatro células por 100 microlitros. Manchar as células adicionando um microlitro de CFS e por mililitro de meio e deixá-las em temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, centrifugue as células a 450 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células no volume inicial do meio para manter uma concentração de duas vezes 10 elevado às quartas células cancerígenas por 100 microlitros de meio. Pegue a placa revestida com rede e aspire suavemente a solução de bloqueio.

Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão de células cancerígenas a cada poço e permita que as células adiram à placa por 90 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, aspire totalmente o líquido e adicione 1000 unidades de DNAs, um a alguns poços por 10 minutos para degradar as redes em outros poços. Adicione 100 microlitros de água estéril por poço por 10 minutos como controle do veículo. Em seguida, aspire suavemente o líquido de cada poço e lave com 100 microlitros de PBS para remover qualquer não aderente.

Um aspirar de 5 a 49 células e descartar toda a solução nos poços, deixando apenas as redes e as células cancerígenas aderentes no fundo. Em seguida, adicione 100 microlitros de uma solução de formaldeído a 4% por poço para fixar as células, transfira imediatamente a placa para um microscópio de fluorescência para ler o ensaio e, em seguida, plotar e analisar os resultados. Usando o software de análise de dados.

Redes livres de células foram usadas em ensaios de adesão estática com 5 49 células cancerígenas. A microscopia de luz mostrou que as células cancerígenas aderem fortemente à monocamada líquida. In vitro.

Essa adesão diminuiu depois que a monocamada líquida foi degradada pelo DNA, uma microscopia de fluorescência de 5 49 células cancerígenas marcadas confirmou esses resultados. A ligação de 5 49 células à monocamada líquida foi quantificada pela contagem do número de células por campo de alta potência. Como mostrado aqui, não houve alteração na adesão das células cancerígenas às redes no controle do veículo.

No entanto, houve uma diminuição significativa na adesão de células cancerígenas a redes na presença de DNA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como isolar e manusear redes de sangue humano total. Esses isolados de rede livre de células podem ser usados em uma variedade de técnicas, incluindo imunofluorescência, microscopia confocal, microscopia eletrônica e western blotting.