Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

O objetivo geral deste procedimento é produzir um modelo de engenharia de tecido 3D do epitélio esofágico humano para uso como plataforma experimental. Isso é feito isolando primeiro fibroblastos esofágicos humanos normais e células epiteliais de amostras de tecido esofágico humano. Na segunda etapa, os fibroblastos são semeados em um acelular epitelial, sinal de poros, andaime esofágico e cultivados por sete dias.

Em seguida, o andaime é invertido e as células epiteliais esofágicas humanas isoladas são adicionadas à cultura por quatro dias. Na etapa final, o modelo é movido para a interface ar-líquido por mais cinco dias de cultura, permitindo que um epitélio estratificado maduro se desenvolva. Em última análise, a imuno-histoquímica é usada para caracterizar os principais marcadores de proliferação e diferenciação expressos pelas células epiteliais modelo.

As principais vantagens dessa técnica em relação à cultura de células 2D convencional é que ela permite que as células tenham as interações célula, célula e matriz celular que teriam in vivo. E usando essa técnica, podemos produzir um epitélio escamoso estratificado maduro semelhante ao esôfago normal. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades por três motivos.

Primeiro, pode ser um desafio garantir que a maioria das células epiteliais não se diferencie antes de ser incluída no andaime. Segundo, deve-se tomar cuidado para garantir que a interface ar-líquido correta seja fornecida durante o período em que o epitélio está amadurecendo. E três, pode ser um desafio manter a idade durante todo o período de cultura.

Para isolar as células epiteliais esofágicas humanas, coloque o tecido da mucosa escamosa esofágica colhido em uma placa de Petri estéril e use um bisturi esterilizado com etanol para cortar o tecido em tiras de 0,5 centímetro. Em seguida, incube o tecido em 0,1% de tentina coberta a 37 graus Celsius, interrompendo a digestão após uma hora com cinco mililitros de FCS. Em seguida, segurando as tiras com uma pinça, raspe suavemente a superfície epitelial com a lâmina do bisturi por um a dois minutos por tira para remover as células epiteliais para o meio circundante quando todas as tiras tiverem sido raspadas, transfira o meio contendo as células epiteliais destacadas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Depois de girar as células, descarte o sene e ressuspenda o pellet em 12 mililitros de meio epitelial. Em seguida, descarte o meio de uma cultura de células grilhões e use uma pipeta estéril para colocar as células epiteliais nas células alimentadoras para isolar os fibroblastos esofágicos humanos. Transfira as tiras de tecido raspadas para uma placa de Petri estéril e, finalmente, pique o tecido com o bisturi.

Digerir as peças em 10 mililitros de 0,5% de colagenase, uma solução coberta a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com uma atmosfera umidificada durante a noite. No dia seguinte, transfira o digesto para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e gire as células. Resus suspendendo o palato em 10 mililitros de meio de cultura de fibroblastos.

A cultura em um frasco T 75 em uma incubadora de cultura de células. Para preparar os andaimes esofágicos de porco descelularizados, comece usando uma tesoura e uma pinça para abrir o esôfago de porco longitudinalmente. Em seguida, lave o esôfago em um pote estéril de 180 mililitros contendo 100 mililitros de PBS estéril por 10 minutos com agitação suave para remover quaisquer detritos do dia enquanto o tecido está sendo enxaguado.

Pulverize uma placa de dissecção de cortiça com 70% de etanol quando a rolha estiver seca no esôfago na placa com o lado da mucosa para cima. Agora, use uma pinça estéril para agarrar a superfície da mucosa em uma extremidade do esôfago e puxe o tecido para longe da placa para separar a mucosa da submucosa subjacente. Em seguida, usando uma lâmina de bisturi estéril, disseque o esôfago longitudinalmente ao longo do próprio lanar, removendo os pinos à medida que a dissecção progride para permitir que a mucosa seja removida

Descarte a submucosa subjacente e use um bisturi para cortar a mucosa restante em pedaços quadrados de cinco centímetros. Lave as peças em 150 mililitros de PBS estéril com agitação suave, como acabamos de demonstrar. Após cinco minutos, transfira o tecido para um pote de 180 mililitros contendo 150 mililitros de uma solução molar de cloreto de sódio.

Suplementado com antibióticos a 37 graus. Após 72 horas, transfira o tecido para 150 mililitros de PBS estéril, momento em que o epitélio terá começado a se separar visivelmente do tecido subjacente. Use uma pinça estéril e uma lâmina de bisturi para remover o epitélio descolante e coloque o tecido restante em um pote fresco de 150 mililitros de PBS estéril com três lavagens de cinco minutos com agitação suave, o tecido deve agora ser armazenado em glicerol por um período mínimo de quatro meses.

Para esterilizar totalmente o andaime, comece a preparação do modelo de mucosa esofágica reidratando pedaços de andaime suíno que foram esterilizados em glicerol por pelo menos quatro meses. Em 100 mililitros de PBS estéril por cinco agitações de 10 minutos. Substituindo o supinato por PBS fresco para cada lavagem.

Após o quinto teste de agitação, o andaime é a esterilidade com uma incubação noturna em 100 mililitros de DMEM a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, transfira os andaimes para poços individuais de uma placa de seis poços com o lado submucoso para cima. Em seguida, coloque um anel estéril de aço inoxidável de grau médico no centro de cada andaime e use uma pinça estéril para pressionar suavemente os anéis para garantir uma vedação adequada com o tecido em cinco vezes.

Centralize os cinco fibroblastos esofágicos humanos em 0,2 mililitros de meio de fibroblastos no centro de cada anel. Em seguida, inunde a área ao redor da parte externa do anel com pelo menos mais dois mililitros de meio de fibroblastos e incube os andaimes em uma incubadora de cultura de células. Após 24 horas, remova os anéis e substitua o meio em cada poço por pelo menos cinco mililitros de fibroblastos frescos.

Médio, cuidando para que os andaimes fiquem totalmente imersos. Após uma semana, descarte o meio e use uma pinça para inverter a superfície da mucosa do andaime voltada para cima. Coloque os anéis de volta nos andaimes e, em seguida, adicione um centro de tempo das seis células epiteliais em 0,2 mililitros de meio composto, um no centro de cada anel.

Tampe a área fora do anel com aproximadamente dois mililitros de meio composto e devolva as construções à incubadora. Após 24 horas, remova os anéis e substitua o meio em cada poço por pelo menos cinco mililitros de meio composto fresco, um, garantindo que os andaimes estejam totalmente submersos. Após mais 24 horas, substitua o meio por pelo menos cinco mililitros de meio composto. Dois.

No quarto dia, coloque grades de malha de aço inoxidável de grau médico estéril nos poços de uma nova placa de seis poços e transfira as construções para o lado da mucosa das grades para cima. Finalmente, adicione meio composto três suficiente para alcançar a parte inferior do compósito, deixando a superfície exposta ao ar, garantindo que a amostra seja mantida em uma interface ar-líquido. A parte mais complicada do procedimento é configurar a interface ar-líquido.

Se não estiver claro se a grade está em contato líquido com uma ponta estéril para tubo, pois é mais fácil ver se a tubulação está submersa. Como alternativa, você pode tentar balançar a placa suavemente, pois é mais fácil ver o líquido quando ele está em movimento e verificar se há líquido na grade e não cobrindo sua amostra. Isso, a avaliação lógica do epitélio apresenta um epitélio escamoso estratificado de várias camadas maduro, semelhante, mas mais fino ao observado com o esôfago humano normal, com as células se tornando progressivamente mais planas e, finalmente, nucleares à medida que migram para a superfície.

A caracterização imuno-histoquímica dos principais marcadores de proliferação e diferenciação demonstra que a microanatomia do epitélio modelo é semelhante à do epitélio esofágico humano normal. Por exemplo, a expressão comparável de citoqueratina 14 é observada tanto no esôfago nativo quanto no epitélio modelo com coloração restrita às células da camada basal. Este modelo foi modificado com sucesso para incorporar células tumorais, substituindo as células epiteliais primárias por células de carcinoma, demonstrando a flexibilidade do modelo.

Por exemplo, as células de carcinoma escamoso produzem um epitélio visível na construção como uma região amarela definida com grandes fendas dentro do epitélio, provavelmente refletindo a presença de moléculas de células disfuncionais, incluindo células de adenocarcinoma de esôfago dentro do modelo, resultando em uma grande quantidade de degradação do andaime visível ao olho como um afinamento do andaime. Após duas semanas de crescimento na interface ar-líquido e confirmado na análise h e e como uma redução óbvia na espessura do andaime na região abaixo das células Após este procedimento, outros métodos de expressão gênica, como northern ou western blotting, podem ser aplicados ao mesmo tecido para responder a perguntas como, Como o epitélio responde às tensões ambientais? Portanto, isso fornece um recurso realmente valioso para analisar mais questões com maior profundidade após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores interessados na metaplasia de Barrett estudarem o efeito da exposição a componentes específicos do refluxo na expressão gênica no esôfago humano normal.