Name: Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais de amostras de medula óssea coagulada usando uroquinase. Este método enzimático oferece uma alternativa rápida e econômica para expandir MSCs em pesquisa e terapia regenerativa.

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Este trabalho foi apoiado pela Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 e pela Swiss Paraplégic Foundation.

NOTA: aspirados de medula óssea Humanos da crista ilíaca foram coletados de doadores consentindo com a aprovação do comitê de ética do cantão de Lucerna. Aspirados de medula óssea a partir de canino da crista ilíaca foram recolhidas com consent.Human do proprietário do cão (aprox. 20 ml) e canina (aprox. 10 ml), aspirados de medula óssea eram anti-coagulados por adição de 15 ml de citrato de sódio a 3,8% imediatamente depois da retirada no teatro operação. As amostras foram transferidas para o ambiente de laboratório para o processamento do mesmo dia como retirado. 1. Preparação de Urokinase (Antes de 1º Use) <ol><li> Reconstituir uroquinase utilizando solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) de acordo com as instruções do fabricante: Adicionam-se 10 ml de PBS para o frasco septo-entrada utilizando uma seringa de 10 ml. Dissolver a substância seca por agitação para obter 50.000 unidades de injeção (U) por ml. </li><li> Preparar alíquotas de 500 ul (25.000 U) em cada stubos terile. Alíquotas da loja -20 ° C e usá-lo quando necessário para pelo menos 6 meses. </li></ol> 2. Preparativos Passos (antes de cada Medula Óssea Treatment) <ol><li> Descongelar uma alíquota de urokinase (25.000 U) per aspirado de medula óssea coagulado (volumes aspirado até 25 ml foram tratados com sucesso utilizando uma alíquota única de 25.000 U). </li><li> Pré-aqueça um banho-maria ou incubadora com agitação a 37 ° C. </li></ol> 3. digestão enzimática do Clot <ol><li> Realizar todos os trabalhos em uma cabine de segurança biológica fluxo laminar para evitar contaminação microbiana das amostras de medula óssea durante o processamento. Quando se trabalha com material humano potencialmente infeccioso, o uso de luvas de protecção, bem como a manipulação cuidadosa é aconselhável. </li><li> Coloque uma peneira de 100 um de células no topo de um tubo estéril de 50 ml. Com cuidado, despeje o aspirado de medula óssea através do filtro de células, inclinando a peneira ou em movimento em torno do material do coágulo. Use a ponta da pipeta estéril paramelhor fluxo através do filtro de rede. Nota: Evite qualquer diluição do coágulo, por exemplo, lavando o coágulo com PBS. Urokinase atua indiretamente e requer componentes do soro (ie., Plasminogênio) a partir da biópsia para efetiva digerir. Enquanto continua o procedimento com o material de coágulo, o filtrado pode ser mantido à temperatura ambiente até à sua utilização no passo 3.6. </li><li> Transferir o material coágulo de medula óssea em uma placa de cultura de célula vazia usando uma pinça estéril. Cortar os detritos em pedaços pequenos de cerca de 2 mm 3, utilizando um bisturi esterilizado. </li><li> Transferir os pequenos pedaços do coágulo dentro de um tubo de reacção de 50 ml utilizando o fórceps estéreis. Verifique se o coágulo picada tem uma aparência molhada. Se ele parece ser seca, use parte do filtrado do passo 3.1 para umedecer. </li><li> Tritura-se o coágulo, pipetando para cima e para baixo para 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml de microtitulação. Adicionar uma parte alíquota de urocinase para a amostra. Incubar durante 30 min a 37 ° C, quer num banho de água ou ema (gentilmente) incubadora de agitação. </li><li> Triturar por pipetagem cima e para baixo por 5 vezes usando uma pipeta de 5 ml. Execute esta etapa em um gabinete de biossegurança. Incubar durante mais 30 min a 37 ° C. Após a incubação, tritura-se novamente 5 vezes usando uma pipeta de 5 mL. Passe longo de um 100 um novo filtro de células de reunir com o filtrado do passo 3.2. </li><li> Centrifugar a suspensão de células à temperatura ambiente durante 10 min a 500 x g. Descartar o sobrenadante. Re-suspender o sedimento de células em meio, tal como descrito abaixo, ou de acordo com o procedimento padrão de laboratório para o MSC expansão da cultura. </li></ol> 4. Sementeira para Cultura de Células de Expansão e placas CFU <ol><li> Ressuspender as células (que consiste em eritrócitos e células mononucleares) em 50 ml de meio basal Alpha-MEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina e 2,5 mg / mL de anfotericina B . Contar as células diluída 1:10 em solução de Azul de Tripano usando um chambe Neubauerr. </li><li> Placa as células em frascos de cultura de célula a uma densidade de 5 x 10 7 células / cm2, e incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C. Se possível, use hipóxia (5% de oxigênio) condições. Para o controlo do ensaio de CFU, placa 10 9 células em uma placa de cultura celular de 10 cm de diâmetro. </li><li> Após 3 dias de cultura, as células estaminais mesenquimais estão ligados à placa de cultura celular, enquanto outras células permanecem em suspensão. Mudar os meios com meio basal suplementado com factor de 5 ng / mL de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Para o controle ensaio CFU, tratar o prato de cultura de células da mesma forma. </li><li> Continue a cultura de células para um total de 2 semanas, a troca de meios três vezes por semana. Se as células superior a 80% de confluência, dividido por tripsinização. Para o controlo do ensaio de CFU, trocar a mídia da mesma forma, mas não se dividem as células para o curso de duas semanas. </li></ol> 5. Giemsa para ensaio CFU <ol><li> Preparar 10 ml de solução-Giemsa por prato: dilute a solução estoque (7,6 g / l Giemsa em glicerol: metanol) 1:10 em água estéril (sempre preparar uma diluição de trabalho de fresco). </li><li> Remova o material da placa de cultura de células e lavar as células com PBS. Seja muito precautious ao aplicar líquido para a placa de petri e evitar lavagem fora das células. </li><li> Fix células em metanol puro durante 5 min à TA. Descarte o metanol. Adicionar a solução-Giemsa e incubar durante 60 min, num incubador humidificado a 37 ° C. </li><li> Lavar duas vezes com PBS. Air secar a cabeça placa pela primeira vez em uma toalha de papel. Contar as colónias manualmente. Este é melhor conseguido utilizando uma caneta marcador na parte de trás da placa. </li></ol> 6. MSC Diferenciação <ol><li> MSCs caninos diferenciação NOTA: MSCs caninos foram diferenciadas em condrogênica, osteogênica e linhagens adipogï¿½icas por estimulação com a mídia apropriada por quatro semanas. </li><li> Para Diferenciação adipogênica, MSCs cultura em monocamada em 4 x 10 5 cells / cm 2 alternando dois diferentes condições de cultura como se segue; <ol><li> Cultura em meio de manutenção contendo adipogénese GlutaMAX DMEM +, 3% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / mL de anfotericina B e 170 mM de insulina. </li><li> Cultura em meio de indução de adipogénese com meio de manutenção suplementado com 3% de FBS, 5% de soro de coelho, 1 uM de dexametasona, 500 uM de 3-isobutil-1-metilxantina, 33 uM de biotina, 5 uM e 17 uM rosiglitazona pantotenato 16. </li><li> Revel as gotículas lipídicas por coloração com óleo Vermelho-O. Resumidamente, corrigir as células com 10% de formaldeído, lavar com PBS e manchar com óleo 0,35% O vermelho em isopropanol. </li></ol></li><li> Para diferenciação osteogénica cultura em monocamada em MSCs de 7 x 10 3 células / cm2 e estimulam a seguir: <ol><li> Avançada DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina B, 501; M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 10 mM beta-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona. </li><li> Identificar os depósitos de mineralização por Von Kossa (5% AgNO 3). Resumidamente, fixar as células com formaldeído a 10%, lava-se com PBS e mancha com 5% de AgNO 3 em água destilada. </li></ol></li><li> Diferenciação condrogênica <ol><li> Corte cubos (3 mm de cada lado) de uma esponja em forma de dispositivos médicos, constituída a partir de liofilizado colágeno tipo I, e utilizado como material de andaime para apoiar células 17. </li><li> MSCs das sementes no topo dos cubos, na concentração de 4 x 10 6 células / ml (~ 70.000 células / cubo). </li><li> Antes da adição de meios, para permitir que as células aderem aos cubos durante 30 min. </li><li> Manter construções MSC-colagénio em meio condrogénica consistindo de DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2,5 ug / ml de anfotericina B, 40 ng / ml de dexametasona, 50 ug / ml ascórbico ácido 2-fosfato,50 ug / ml de L-prolina, 1x insulina-transferrina-X Selénio, e 10 ng / ml de factor de crescimento transformante-β1. </li><li> Use coloração azul alcian visualizar acúmulo de proteoglicanos nas seções construções. Resumidamente, corar as secções O / N com 0,4% de azul de alcian dissolvido em 0,01% de H 2 SO 4 e 0,5 M de cloridrato de guanidina. Em seguida, lavam as secções foram lavadas durante 30 minutos em 40% de DMSO e 0,05 M de MgCl2. As células foram contrastadas com vermelho rápido nuclear. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Rotineiramente nós amostra da medula óssea, enquanto o paciente está a sofrer a cirurgia (no nosso caso, a cirurgia da coluna, principalmente), com a vantagem de que apenas pouco trabalho adicional tem de ser efectuada pelo pessoal na sala de cirurgia. Mesmo que as amostras são misturadas com citrato de sódio imediatamente após a retirada, muitas amostras foram parcialmente coagulado quando chegaram no laboratório para processamento. Nesta fase, resampling para substituir espécimes coagulados seria uma intervenção adici...

As células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenham um papel importante em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Eles podem migrar, diferenciar-se em vários tipos de células 1 e enxertar, o que os torna os candidatos ideais para terapias autólogos 2,3. Ultimamente, os ensaios clínicos utilizando MSCs de osso e cartilagem reparação, doença enxerto versus hospedeiro ou doença cardíaca foram lançados 4. Estes MSCs podem ser colhidas a partir do cordão umbilical, ou tecido adiposo, mas os resultados mais promissores foram obtidos a partir de medula óssea derivadas de células estaminais 5. A crista ilíaca permite recolher uma quantidade considerável de medula óssea e, portanto, serve como local principal de aspiração 6. No entanto, a qualidade do aspirado diminui com o aumento de volume de medula óssea retirada. Enquanto os primeiros 5 ml de aspirado de medula óssea conter MSCs de alta qualidade, a retirada de volumes maiores leva a diluição do aspirado com sangue periférico fesde o osso altamente vascularizado 7. Devido às actuais megacariócitos e plaquetas, aspirados de medula óssea são propensas a coagulação, a menos que sejam utilizados anticoagulantes. Mas, mesmo com anticoagulantes, pode ocorrer a formação de coágulos. Na medula óssea, as MSCs constituem apenas uma pequena proporção do conjunto total de 8 células e têm de ser expandidas em cultura para engenharia de tecidos ou mais aplicações terapêuticas 4. A qualidade de uma tal cultura depende em grande parte do conjunto de células inicial, isto é., A diversidade e um elevado número de partida 9. Baixo número de MSCs de levantamentos pode ser parcialmente explicado pela variabilidade dos doadores. Por outro lado, as MSCs a partir de amostras de baixa qualidade requerem mais tempo em cultura e passagem em estendida para atingir o número desejado de células. Em ambos os casos, passaging estendido é uma fonte de senescência celular e pode levar à perda de potencial de diferenciação 10. Portanto, os protocolos que podem maximizar celular y otimizadoield e prevenir contra os efeitos prejudiciais têm de ser desenvolvidas 11,12. Quando começamos a trabalhar com MSCs caninos, ficamos surpresos ao ver que cerca de três em cada quatro amostras de medula óssea de cães contido coágulos, enquanto amostras humanas felizmente coagulado (uma em cada dez) foram menos freqüentes. Por outro lado não foi nenhuma surpresa, observou-se que os rendimentos muito mais baixos de MSCs a partir de amostras coaguladas. Para resolver o problema recorrente de amostras coaguladas, que desenvolveu o protocolo usando o urokinase droga trombolítica em vez de reamostragem. Terapias trombolíticos pode neutralizar situações que ameaçam a vida, como a oclusão de vasos sanguíneos, provocando um ataque cardíaco, acidente vascular cerebral ou embolia devido a coagulação indesejada. Eles trabalham por degradação dos coágulos através da clivagem enzimática da fibrina pela plasmina e enzimática do plasminogênio ativadores. Apesar da ampla utilização para o tratamento de pacientes, apenas muito poucas publicações que existem atividades trombolíticos utilizadopara aplicações de laboratório para resgatar amostras coaguladas, focando principalmente nos linfócitos. Em 1987, Niku et al. descreveram o uso de estreptoquinase para dissolver coágulos de sangue, resultando em linfócitos funcionais 13 e quatro anos mais tarde, De Vis et al. estendeu o uso de estreptoquinase para isolar as células de leucemia de sangue e medula óssea para aplicações de citometria de fluxo 14. A publicação mais recente sugere o uso de Alteplase para diagnóstico de câncer 15. Enquanto estiver usando a mesma abordagem enzimática, nosso protocolo incide sobre o isolamento de multipotentes da medula óssea MSCs forma a fornecer uma ferramenta para os pesquisadores da área de células-tronco.

<table><tbody><tr>Componentes <td></td><td></td><td></td><td>Médios Basais</td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Humano FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha com Nucleosídeo, com Glutamina Estável</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Inativado por Calor</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>Componentes Adipogênicos do Meio DMEM-HAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Soro para coelhos</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazona&nbsp;</td><td>Pantotenato Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Óleo Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Componentes do Meio Osteogênico Ácido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-glicerofosfato</td><td>Nitrato de prata Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>(AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Componentes</td><td></td><td></td><td></td> do meio condrogênico</tr><tr><td>Biopad - dispositivo médico em forma de esponja</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-prolina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento transformador humano-&beta; 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear rápido vermelho</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Citrato tri-sódico genérico</td><td></td><td></td> di-hidratado Applichem A3901 <td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td></td> Urokinase Medac 1976826 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% de tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>coloração de Giemsa</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4)</td> <td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td> <td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de guanidina</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Consumíveis Tubo de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reação de 50 ml</td><td>Seringa Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>de 10 ml</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Sterican (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos de 1,7 ml</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>pinça estéril</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>bisturi estéril</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Placa de corte de células Primaria</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Improved</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>frasco de cultura de células - Frasco T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança microbiológica classe II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>banho-maria</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes Pipeta sorológica 5ml</td><td>Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>microscópio</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>incubadora umidificada Heracells 240</td><td>Thermo científico</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo 75004331</td><td></td><td></td> científico</tr></tbody></table>

um método enzimático para a salvação da células-tronco mesenquimais de amostras clotted medula Óssea

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Células-tronco mesenquimais (MSCs) - geralmente obtidas da medula óssea - geralmente requerem cultura de expansão. Nosso protocolo usa uroquinase de grau clínico para degradar coágulos na medula óssea e liberar MSCs para uso posterior. Este protocolo fornece uma alternativa rápida e barata à reamostragem da medula óssea. A medula óssea é uma importante fonte de MSCs, que são interessantes para engenharia de tecidos e terapias autólogas com células-tronco. Após a retirada, a medula óssea pode coagular, pois compreende todo o sistema hematopoiético. Os coágulos resultantes também contêm MSCs que são perdidas para cultura de expansão ou terapia direta com células-tronco. Percebemos que 74% das amostras de medula óssea canina continham coágulos e produziram menos da metade do número de células-tronco esperado de amostras não coaguladas. Assim, desenvolvemos um protocolo para digestão enzimática desses coágulos para evitar a reamostragem de medula óssea trabalhosa e cara. A uroquinase - um medicamento trombolítico clinicamente aprovado e prontamente disponível - elimina os coágulos da medula óssea quase completamente. Como consequência, os aspirados de medula óssea tratados produzem um número semelhante de MSCs como amostras não coaguladas. Além disso, após o tratamento com uroquinase, as células mantiveram sua atividade metabólica e a capacidade de se diferenciar em linhagens condrogênicas, osteogênicas e adipogênicas. Nosso protocolo recupera amostras de sangue coagulado e medula óssea sem afetar a qualidade das células. Isso torna a reamostragem obsoleta, reduz consideravelmente os custos de amostragem e permite o uso de amostras coaguladas para pesquisa ou terapia.

Os fatos que 74% das amostras de medula óssea de cães (n = 54) contidos coágulos quando chegaram em nosso laboratório (Figura 1A), juntamente com a diminuição da produtividade MSC partir dessas amostras, nos fez acreditar que um número considerável de MSCs foi preso dentro dos coágulos . Com efeito, uma simples DAPI-mancha de material de coágulo seccionado confirma a presença de células nucleadas em alta densidade (Figura 1B). E isso leva a baixos números de MSCs disponíveis para expans...

As células-tronco mesenquimais são geralmente obtidas da medula óssea e requerem cultura de expansão. Quando as amostras coagulam antes do processamento, um protocolo usando a droga trombolítica (enzimática) uroquinase pode ser aplicado para degradar o coágulo. Assim, as células são liberadas e disponibilizadas para cultura de expansão. Este protocolo fornece uma alternativa rápida e barata à reamostragem.

Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

O objetivo geral deste procedimento é aproveitar amostras de medula óssea coagulada digerindo os coágulos com uroquinase. Isso é realizado primeiramente filtrando a amostra de medula óssea em um filtro celular. Em seguida, o coágulo de medula óssea é cortado em pequenos pedaços.Em seguida, o coágulo é transferido para um tubo Falcon e digerido usando uroquinase. Por fim, o material do coágulo digerido é semeado para a expansão de células-tronco mesenquimais ou MSCs. Em última instância, as placas são comparadas a uma placa controle utilizando em sustain para avaliar a eficácia da digestão.A implicação desta técnica estende-se à terapia ou diagnóstico com células-tronco autólogas. Porque o enxerto exige expansão e diferenciação de um grande número de células-tronco. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando percebemos que muitas amostras de medula óssea provenientes do DOC estavam coaguladas ao chegarem ao nosso laboratório.Não queríamos simplesmente descartar amostras tão preciosas para reconstituir a uroquinase. Injete 10 mililitros de PBS estéril no frasco com entrada septada e vortexe para dissolver até uma concentração de 50.000 unidades por mililitro. Aliquote 500 microlitros contendo 25.000 unidades cada em tubos estéreis e armazene a menos 20 graus Celsius por até seis meses para realizar uma reação de digestão. Descongele um alíquota de uroquinase por aspirado de medula óssea turva de até 25 mililitros.Pré-aqueça um banho-maria ou incubadora com agitação a 37 graus Celsius sob uma cabine de fluxo laminar. Com luvas colocadas, posicione um filtro celular de 100 micrômetros sobre um tubo de 50 mililitros. Despeje cuidadosamente o aspirado de medula óssea através do filtro celular, inclinando o filtro ou movimentando o material coagulado.Derrame cuidadosamente o aspirado da medula óssea através do filtro celular sem inclinar o filtro ou movimentar o material do coágulo. Utilize uma pipeta estéril para melhorar o fluxo através da malha do filtro com pinça estéril. Transfira o material do coágulo da medula óssea para uma placa de cultura celular vazia.Em seguida, utilize um bisturi estéril para cortar os detritos em pedaços de dois milímetros cúbicos. Depois, com uma pipeta microliterada de cinco mililitros, triture o coágulo pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Em seguida, adicione uma alíquota de uroquinase à amostra e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos em banho-maria ou incubadora com agitação.Após a incubação na câmara de segurança biológica, realiza-se novamente a trituração e incuba-se por mais 30 minutos. Em seguida, tritura-se mais cinco vezes e passa-se a amostra por uma nova peneira de células de 100 micrômetros, reunindo-a com o filtrado inicial. Centrifuga-se a suspensão celular a 500 × g e temperatura ambiente por 10 minutos. Após a remoção do sobrenadante, utiliza-se 50 mililitros de meio basal para ressuspender o pellet.Usando solução azul de tripano, dilua um ALI quádruplo de células re-suspensas na proporção de um para 10 e adicione a suspensão à câmara de Neubauer para contagem. Após a contagem das células, plaque-as em frascos de cultura celular com densidade de cinco vezes 10 à sétima potência de células por centímetro cúbico para a placa controle do ensaio de CFU.10 elevado à nona células em uma placa de cultura celular redonda com diâmetro de 10 centímetros, incubada em câmara umidificada a 37 graus Celsius. Após três dias de cultivo, as MSCs estarão aderidas à placa de cultura celular, enquanto outras células permanecerão em suspensão. Utilize meio basal contendo cinco nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos básico para substituir o meio tanto nas placas experimentais quanto nas de controle.Continue o cultivo por um total de duas semanas, trocando o meio três vezes por semana. Se as células excederem 80% de confluência, faça a tripsinização do cultivo e divida para realizar o ensaio de CFU.Prepare 10 mililitros de solução GSA por placa utilizando água estéril para diluir a solução estoque. De um a dez. Remova o meio do recipiente de cultura celular e use PBS para lavar cuidadosamente as células com metanol puro.Fixe as células à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, descarte o metanol e adicione a solução de gemsa. Incube em câmara umidificada a 37 graus Celsius por 60 minutos após a incubação.Use PBS para lavar as células duas vezes. Em seguida, seque a placa ao ar. Coloque-a primeiro sobre uma toalha de papel com um marcador no verso da placa.Conte manualmente as colônias para diferenciação adipogênica. Cultive as CMMs em monocamada a quatro vezes 10 à quinta células por centímetro quadrado. Alterne entre duas condições de cultura diferentes para a primeira condição.Cultive as células em um meio de manutenção da adipogênese e, para a segunda condição, cultive as células. Utilize um meio de indução da adipogênese com meio de manutenção de acordo com as receitas descritas no protocolo textual. Para visualizar as gotículas lipídicas, use formaldeído a 10% para fixar brevemente as células.Em seguida, lave as células com PBS antes de usar óleo vermelho O a 0,35% em isopropanol para corar as células destinadas à cultura de diferenciação osteogênica de MSCs em monocamada a sete vezes 10 das terceiras células por centímetro quadrado. Após estimular as células utilizando o meio descrito no protocolo do texto, use formaldeído a 10% para fixar brevemente as células. Uma vez que as células tenham sido lavadas com PBS, utilize Von Kossa para identificar depósitos minerais a fim de realizar a diferenciação congênita a partir de um dispositivo médico com formato de esponja, constituído de cubos de colágeno tipo I liofilizado com três milímetros de lado, semeando MSCs sobre os cubos numa concentração de quatro vezes 10 à oitava células por mililitro, após permitir que as células aderissem aos cubos por 30 minutos à temperatura ambiente.Mantenha os constructos de colágeno de CMM em meio congênico conforme listado no protocolo textual. Adicione solução de Ian Blue a 0,4% às seções e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, use DMSO a 40% e cloreto de magnésio 0,05 molar para lavar as células por 30 minutos antes de usar vermelho nuclear rápido para contracolorar as células conforme demonstrado aqui.Uma simples seção corada com DAPI do material do coágulo confirma a presença de células nucleadas em alta densidade, indicando que um número considerável de CMMs está aprisionado dentro dos coágulos. Utilizando o protocolo descrito neste vídeo, o tratamento com uroquinase permitiu a digestão de todo o material, exceto 15% em peso de coágulos sanguíneos caninos e 9% em peso de coágulos humanos, para determinar a eficácia da digestão com uroquinase. Células provenientes dos filtrados das amostras coaguladas e dos coágulos digeridos foram semeadas separadamente e incubadas por duas semanas.O tratamento sustentado das células mostrou 3,8 vezes mais UFCs em amostras caninas digeridas com uroquinase do que nos respectivos filtrados iniciais. As amostras digeridas de origem humana apresentaram 1,6 vez mais UFCs do que os filtrados não digeridos. Neste experimento, MSCs provenientes de coágulos de medula óssea foram comparadas a MSCs derivadas de amostras de medula óssea coagulada do UNC quanto à sua capacidade de diferenciação sob condições apropriadas de cultivo.Após quatro semanas em cultura, foi possível diferenciar MSCs de amostras digeridas em linhagens adipogênicas, osteogênicas e congênicas. Além disso, as colorações com vermelho de von Kossa, vermelho O e azul de Cian indicaram ausência de diferenças no grau de diferenciação entre os grupos. Uma vez dominado, o Mr.Nick pode ser realizado em cerca de uma hora e meia, se for executado corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco hematopoéticas para cultura de expansão, mesmo quando suas amostras estiverem coaguladas, em vez de descartar a amostra. Nosso protocolo utiliza a enzima quinase para digerir o coágulo e as células-tronco ES para cultura de expansão.

an-enzymatic-method-to-rescue-mesenchymal-stem-cells-from-clotted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Rat CTMs foram isoladas do fémur ea tíbia e então enriquecida por separação de células magnéticas. Células classificadas foram confirmados para a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. Estas células também foram cultivadas na densidade clonal para formar colônias individuais e, em seguida essas colônias foram separados por cilindros de clonagem.

Isolamento e Enriquecimento de células-tronco mesenquimais Rat (MSC) e Separação de-colônia Único Derivado MSCs

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm potencial de diferenciação em relação à linhagem osteoblástica quando estimuladas com fatores solúveis ou biomateriais específicos. Este trabalho apresenta uma nova opção para a entrega de MSCs a partir de membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emprega a matriz óssea bovina Nukbone (NKB) como um andaime.

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

A cultura de células estromais mesenquimais humanas (hMSCs) com soro autólogo, reduz os riscos de rejeição por material de xenogénico e outros efeitos negativos. Também permite a recuperação de um subconjunto de células progenitoras mesodérmica, que pode fornecer as hMSCs frescos. Incorporação hMSCs em um coágulo de fibrina autóloga permite fácil manuseio e implantação cirúrgica eficaz.

Estromais mesenquimais cultura de células e Entrega em condições autólogas: Uma abordagem inteligente para aplicações ortopédicas

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.

Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos

Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

O presente protocolo descreve um método econômico para purificar, expandir e caracterizar células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) altamente homogêneas de camundongos. Essa abordagem facilita a aquisição de grandes quantidades de BMSCs com alto potencial de proliferação e diferenciação, apoiando modelos de camundongos e avançando na pesquisa pré-clínica.

Purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais da medula óssea derivadas de camundongos

Este protocolo descreve um método de triagem baseado em esferas magnéticas, utilizando anticorpos de citometria de fluxo marcados com ficoeritrina (PE) e microesferas anti-PE para isolar subpopulações específicas de células-tronco mesenquimatosas com alta positividade de marcadores-alvo pós-sorte, preservando a proliferação/atividade metabólica baseada em CCK-8 sob as condições testadas, sem exigir classificadores celulares caros ou esferas personalizadas específicas para o alvo.

Isolamento e validação de subpopulações de células-tronco mesenquimais positivas para podoplanina usando uma estratégia indireta de esferas magnéticas

Aprenda a isolar células-tronco mesenquimais de amostras de medula óssea coagulada usando uroquinase. Este método enzimático oferece uma alternativa rápida e econômica para expandir MSCs em pesquisa e terapia regenerativa.

Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea

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