Name: Oxigênio-Glucose Privação e reoxigenação como um In Vitro Isquemia e reperfusão Lesão modelo para estudar Disfunção Barreira Hematoencefálica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a usar privação de oxigênio-glicose e reoxigenação como modelo in vitro de lesão por isquemia-reperfusão para estudar disfunção da barreira hematoencefálica em células endoteliais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos Scott and White Hospital Auxílio à Pesquisa Programa de apoio financeiro e Texas A &amp; M Health Science Center College of Medicine Laboratório Integrado Imaging para o uso do microscópio confocal a laser. Reconhecemos o Sr. Glen Cryer para obter ajuda com a edição do manuscrito.

1. Plantio de células endoteliais <ol><li> Obter culturas primárias de RBMEC de adultos a partir de ratos Sprague Dawley (ou obtê-los comercialmente). </li><li> Cultivar RBMECs em 100 centímetros fibronectina (50 ug / ml) placas de petri revestidas usando o cérebro de rato meio de crescimento de células endoteliais. Mudar a forma de dois em dois dias, até que seja atingida a confluência. </li><li> Ao chegar a 80-90% de confluência, lavar suavemente as células em 5 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS), através de agitação. As células são, então, separado por expondo-os a um ml de solução quente de 0,25% tripsina ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), equilibrado a 37 ° C. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 2-5 min, até que as células são separadas e dispersas. NOTA: Toque na placa de cultura para separar as células. Ver as células ao microscópio para confirmar a separação completa de células da superfície do prato. </li><li> Adicionar 5 ml de meios completo numa placa de Petri a fim de neutralizar a tripsina.Pipeta o meio contendo células destacadas e recolhê-la para um tubo de centrífuga de 15 ml. . </li><li> Centrifuga-se o meio contendo as células endoteliais a 220 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e preservar o pellet contendo cells.Suspend o sedimento em 3-5 ml fresco cérebro de rato meio de crescimento de células endoteliais por misturando suavemente para cima e para baixo com células pipeta será, em seguida, ser contados utilizando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro. </li><li> Transferir a suspensão de células em fibronectina (50 ug / ml) pré-revestidas 8 sistema corrediça câmara bem estéril, 0,7 cm2 / poço com uma densidade de sementeira variando entre 10.000-15.000 células por poço. Crescer as células a 37 ° C até confluência é conseguido NOTA: Para a realização de transferências de Western ou outros ensaios, as células podem ser cultivadas em placas de 10 cm de cultura de células ou pratos especiais como exigido pela experiência. </li></ol> 2. oxigênio e glicose Privação-reoxigenação In VitroModelo NOTA: O protocolo a seguir foi adaptado de Zulueta et al. 1997; H Zhu et ai. 2012 8,9. <ol><li> Utilizar a hipóxia sistema de cultura celular para estudar os efeitos da de OGD-R em RBMECs (ver Figura 1). Configuração e calibração do sistema de cultura celular hipoxia antes de começar a experiência, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Retirar as lâminas de câmara confluente (passo 1.8) a partir do 37 ° C incubadora. Substituir o meio completo na corrediça câmara com desoxigenado, não glicose, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e colocados em câmara de hipoxia de 95%, N 2 e CO 2 a 5% durante 2 h a 37 ° C, para representar OGD condição. </li><li> Mover as células de volta para a incubadora com 95% de O2, 5% de CO2 a 37 ° C e fornecidas com células endoteliais do cérebro de rato meio completo fresco e incuba-se durante mais 1 h a 37 ° C. NOTA: Este passo representa uma situação reoxigenação. </li><li> Use os slides câmara para localização de imunofluorescência e rotulagem rhodamine phalloidin (ver secção 3). </li></ol> 3. Localização por imunofluorescência de ZO-1 e F-actina Etiquetagem Usando rodamina faloidina <ol><li> Expor as lâminas de câmaras contendo as monocamadas RBMEC a 100 ul de meio Opti-MEM / soro reduzida / poço durante 1 h. Lavam-se as lâminas de câmara 3 vezes em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,0-7,2). </li><li> Fixar as células utilizando 100 uL de paraformaldeído a 4% em PBS (pH 7,0-7,2) durante 15 minutos e lava-se as lâminas de câmara por mais 3 vezes em PBS (pH 7,0-7,2). </li><li> Permeabilizar as células utilizando 100 ul de 0,5% de Triton X-100 em PBS, (pH 7,0-7,2) durante mais 15 min. Bloquear com 100 ul de 2% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS durante uma hora. Após este passo, quer células mancha / etiqueta quer para ZO-1 ou f- actina. <ol><li> Para imunofluorescência staining incubar as células com um anticorpo anti-coelho primário contra ZO-1 em 1: 150, preparado em 2% de BSA-PBS, durante O / N a 4 ° C. Lavam-se as células três vezes em PBS, (pH 7,0-7,2). Incubar com 100 ul de fluoresceína isotiocianato (FITC) tagged anticorpo secundário anti-coelho durante 1 h à TA. </li><li> Para a etiquetagem Rodamina Faloidina, seguindo bloqueio, expor as células a 100 ul de rodamina faloidina na diluição 1:50, preparado em 2% de BSA-PBS, durante 20 min. </li><li> Lavam-se as células de coloração por imunofluorescência e rodamina faloidina rotulagem em PBS, (pH 7,0-7,2). Monte as câmaras que usam meios de montagem contendo reagente anti-fade com DAPI. </li></ol></li><li> Visualizar as células utilizando uma lente de imersão em água e X 60 células são digitalizadas num plano óptico sob um microscópio confocal. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

OGD-R como um modelo in vitro para a lesão de isquemia-reperfusão tem sido bem estabelecido para o estudo de neurónios 10,11. Existem também estudos que mostram o efeito de OGD em células endoteliais cerebrais e alterações na permeabilidade e TJ integridade 9. No entanto, o nosso estudo mostra o efeito de OGD, bem como reoxigenação, que é uma representação mais próxima da lesão de reperfusão isquémica em condições in vivo que ocorrem após acidente vascular cerebral isquémico. ...

A isquemia-reperfusão (IR) é encontrada lesão a ser a causa frequente de diversas complicações debilitantes e mortes associadas com acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, trauma, doença vascular periférica e lesão cerebral traumática 1,2. IR lesão em vasos cerebrais é uma lesão secundária precoce levando a inflamação e edema 3. Uma das complicações graves que ocorrem como um resultado de stress oxidativo e metabólica seguinte inflamação é a perda de equilíbrio homeostático que conduz à formação de radicais livres, alterações na barreira sangue-cérebro (BBB) ​​junções apertadas (TJs) e permeabilidade microvascular 4,5. Actualmente, em modelos in vivo utilizados para estudar os efeitos do dano por IR na certificação incluem a oclusão da artéria cerebral média (MCAO), microembolia, e animais transgénicos ou knockout. No entanto, cada um tem os seus inconvenientes e limitações como discutido por Hossmann 6. Modelo MCAO é usado para estudar o effecst de estresse redox, mudanças nas comunicações de junção da certificação e as interações entre o cérebro e as células do sistema imunológico. No entanto, eles apresentam vários desafios técnicos, tais como a necessidade de procedimentos microcirúrgicos precisas e as dificuldades das mesmas. Microembolismo instantaneamente quebra da BBB, enquanto o uso de animais transgénicos ou knockout para estudar a isquemia cerebral pode ter desafios como influências dependente de genes moleculares na formação de enfarte, alterações na anatomia vascular e diferentes pesos corporais 6. Portanto, modelos in vitro de isquemia ter encontrado um interesse crescente nos últimos tempos, principalmente devido à sua aplicabilidade na realização de estudos sobre os mecanismos de drogas. No entanto, os resultados de estudos in vitro podem não representar plenamente um estudo in vivo e deve ser interpretado com cautela 6. Counteractive efeito de baixas concentrações de oxigênio em monocamadas de células endoteliais e de permeabilidade microvascular ter sidoestudados por Ogawa 7. Células endoteliais microvasculares cérebro de rato (RBMECs) foram utilizados para desenvolver in vitro a certificação. A privação de oxigênio-glucose e reoxigenação técnica (OGD-R) apresentado neste protocolo foi adaptado de estudos de Zulueta et al e Zhu et al 8,9. Nós expostas células endoteliais cerebrais a OGD-R, colocando-os numa câmara de hipoxia / anoxia contendo 0% de O2, 5% de CO 2 e 95% de N2. As células foram depois avaliadas para alterações na integridade e formação de fibras de stress TJ usando localização imunofluorescência e marcação com rodamina-faloidina respectivamente. Imunofluorescência para zonula occludens-1 (ZO-1) é realizada para determinar a integridade TJ, como ZO-1 é um importante membrana andaimes proteína ligada TJ. Rotulagem rodamina faloidina determina a actina filamentosa (F-actina) no citoesqueleto da célula e é uma clara indicação de formação de fibras de stress de actina em células endoteliais. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; O objetivo deste método é fornecer uma visão sobre o desenvolvimento de OGD-R como um modelo no IR vitro para estudar a certificação células endoteliais integridade TJ e formação de fibras de stress f-actina. Os resultados irão fornecer informações sobre o destino de proteína TJ, ZO-1 e formação de fibras de stress seguinte OGD-R. Compreender essas relações será uma oportunidade para determinar os mecanismos moleculares subjacentes que são acionados seguintes OGD-R e desenvolver potenciais estratégias terapêuticas para melhorar a interrupção certificação após o tratamento OGD-R.

<table><tbody><tr><td>Proox modelo 110</td><td>Biospherix</td><td>Modelo 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, sem glicose</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina Faloidina</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Anticorpo Policlonal para Coelho</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp; bem estéril, vidro&nbsp; slides&nbsp;</td><td>Anticorpo</td> secundário anti-coelho marcado <td>com FITC da</td> Thermo scientific 177402 <td></td></tr><tr><td>FITC&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Qualquer outro PBS disponível pode ser usado</td></tr></tbody></table>

oxigênio-glucose privação e reoxigenação como um<em&gt; in vitro</em&gt; isquemia e reperfusão lesão modelo para estudar disfunção barreira hematoencefálica

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Isquemia e reperfusão (IR) lesão é conhecido por contribuir significativamente para a morbidade e mortalidade associadas com acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Acidentes vasculares cerebrais isquêmicos são responsáveis ​​por 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais. Uma causa comum de lesão de IR é o rápido ingresso de fluidos após uma oclusão crónica / aguda de sangue, os nutrientes, oxigénio ao tecido provocando a formação de radicais livres. Acidente vascular cerebral isquémico é seguido pela barreira sangue-cérebro (BBB) ​​e disfunção vasogénico edema cerebral. Estruturalmente, as junções apertadas (TJS) entre as células endoteliais desempenham um papel importante na manutenção da integridade da barreira sangue-cérebro (BBB). IR lesão é uma lesão secundária precoce conduz a uma resposta não específica, inflamatória. Estresse oxidativo e inflamação metabólica seguinte desencadeia dano cerebral secundário, incluindo a certificação permeabilidade e perturbação da junção apertado integridade (TJ). Nosso protocolo apresenta in vitro &lt;/ Em&gt; exemplo de privação de oxigênio-glucose e reoxigenação (OGD-R) em células endoteliais cérebro de rato integridade TJ e formação de fibras de stress. Actualmente, vários experimental em modelos in vivo são utilizados para estudar os efeitos da lesão de IR; no entanto eles têm várias limitações, como os desafios técnicos na realização de cirurgias, gene influências moleculares dependentes e dificuldade em estudar as relações mecanicistas. No entanto, em modelos in vitro pode ajudar a superar muitas destas limitações. O protocolo apresentado pode ser usado para estudar os mecanismos moleculares e várias relações mecanísticos para proporcionar potenciais estratégias terapêuticas. No entanto, os resultados de estudos in vitro pode ser diferente da padrão em estudos in vivo e deve ser interpretado com cautela.

Células cultivadas em pré-revestidas fibronectina lâminas de câmara Nunc II foram submetidos a OGD-R, colocando em um modelo de 110 câmara Biospherix ProOx. Após sujeitar as células a OGD-R, que foram processados ​​para ZO-1 coloração juncional utilizando a técnica de imunofluorescência, conforme mostrado na Figura 2 e montagem do citoesqueleto indicando a formação de fibras de stress de actina F usando etiqueta mancha rodamina faloidina como mostrado na Figura 3. As células de controlo...

A lesão de isquemia-reperfusão (RI) está associada a uma alta taxa de morbidade e mortalidade. O objetivo do modelo in vitro de privação e reoxigenação de oxigênio-glicose (OGD-R) descrito aqui é avaliar os efeitos da lesão de isquemia e reperfusão em uma variedade de células, particularmente em células endoteliais da barreira hematoencefálica (BHE).

Oxigênio-Glucose Privação e reoxigenação como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Isquemia e reperfusão Lesão modelo para estudar Disfunção Barreira Hematoencefálica

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o papel da privação de oxigênio e glicose como um modelo in vitro de lesão por isquemia e reperfusão para estudar a disfunção da barreira hematoencefálica. Isso é realizado expondo células endoteliais cerebrais cultivadas em lâminas com câmara à privação de oxigênio e glicose, substituindo o meio por meio desoxigenado sem glicose e expondo-as a um ambiente de câmara de hipóxia por duas horas; em seguida, as células são retornadas a condições normais por uma hora para alcançar a reoxigenação. Após o processamento das células, realiza-se coloração imunofluorescente de Zola Occludin um e marcação de Rod Domine Phin do filamento de actina.As células são então imagiadas usando uma objetiva de imersão em água de 60 x em um microscópio confocal para obter cortes ópticos individuais para análise. O procedimento será demonstrado por Hem Nega, um estudante de pós-graduação no meu laboratório. Para iniciar o procedimento, tenha em mãos culturas primárias de RBM EECS obtidas de ratos Sprague Dawley adultos. Linhagens comercialmente disponíveis também são aceitáveis.Cultive as R BM EECS em placas de 100 centímetros revestidas com fibronectina, cultivando-as em meio de crescimento para células endoteliais do cérebro de rato, e troque o meio a cada dois dias. Incube as células até que atinjam 80 a 90% de confluência. Em seguida, lave suavemente as células com cinco mililitros de PBS.Em seguida, desprenda as células da placa adicionando primeiro um mililitro de solução de tripsina-EDTA 0,25% aquecida e agitando suavemente a placa. Incube então as células por dois a cinco minutos. Bata na lateral do recipiente para aumentar a dessociação celular e observe as células ao microscópio para confirmar seu desprendimento.Para encerrar a tripsinização, adicione cinco mililitros de meio completo e, em seguida, pipeteie o meio com as células destacadas e colete-o em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o meio com as células a 220 ×g durante cinco minutos, aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em três a cinco mililitros de meio fresco, fazendo passar suavemente as células por uma pipeta de cinco mililitros.Agora conte as células e transfira de 20 a 30.000 para cada poço de uma lâmina com câmara de oito poços revestida com fibrina e actina. É claro que elas também podem ser cultivadas de forma diferente para outras aplicações. Em seguida, incube a lâmina com câmara até que as células atinjam confluência, como preparação.Configure e calibre o sistema de cultura celular de hipóxia. De acordo com as instruções do fabricante, o ambiente da câmara deve ser composto por 95% de nitrogênio, 5% de dióxido de carbono e mantido a 37 graus Celsius. Agora, desoxigene o DMEM livre de glicose colocando-o na câmara de hipóxia por quatro a seis horas.Inicie o estresse celular substituindo o meio por DMEM sem glicose e desoxigenado e, em seguida, coloque as células na câmara de hipóxia por duas horas. Após duas horas, devolva as células ao meio completo para células endoteliais cerebrais de rato. Em seguida, reoxigene as células retornando-as às condições normais por uma hora.Inicie expondo cada poço de monocamadas de R-B-M-E-C a 100 a 200 microlitros de meio com soro reduzido ideal e continue a incubação por uma hora. Em seguida, lave as lâminas de câmara três vezes usando de 100 a 200 microlitros de PBS por poço em cada lavagem. Fixe as células com paraformaldeído 4% em PBS e incube as lâminas por 15 minutos à temperatura ambiente, depois lave as células três vezes com PBS como antes.Agora, permeabilize as células aplicando de 100 a 200 microlitros de Triton X-100 0,5% em PBS em cada poço e deixe a placa incubando por mais 15 minutos à temperatura ambiente. Após a permeabilização das células, aplique a solução bloqueadora e deixe agir sobre as células por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, realize imunofluorescência para a proteína ZO-1 ou marque o F-actina.Para realizar a imunofluorescência das células para ZO um, incube-as com o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave as células três vezes em PBS, como ao remover o fixador. Em seguida, incube as células em 100 a 200 microlitros de anticorpo secundário anti coelho marcado com fitzina por uma hora à temperatura ambiente para marcar as células com r Domine Phin.Após aplicar a solução bloqueadora por uma hora, exponha as células a 100 a 200 microlitros de R domine Phin em uma diluição de 1:50 com 2% B-S-A-P-B-S por 20 minutos. Após a incubação com o anticorpo secundário ou com o R domine Phin, lave as células com PB S três vezes novamente como antes. Em seguida, remova as câmaras destacando a parte elástica.Prossiga com a montagem das lâminas utilizando meio contendo agente anti-desvanecimento e imagem DPI. As células com microscopia confocal em um único plano com objetivo de 60 x. Células cultivadas em câmara revestida com fibronectina.As lâminas foram submetidas à RDOG colocando-as em uma câmara de hipóxia. Conforme descrito. As células foram então processadas para junção ZO-1.Células-controle coradas mostraram integridade de junções contínua, enquanto células privadas de oxigênio e glicose apresentaram junções descontínuas. Além disso, alterações no citoesqueleto foram observadas usando aero domine foid com marcação para mostrar o estresse do F-actina. Células-controle na formação de fibras de estresse não mostraram ou apresentaram mínima formação de fibras de estresse de F-ACT, enquanto células submetidas à RDOG tiveram aumento na formação de fibras de estresse.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a privação de oxigênio e glicose e a reoxigenação. Isso pode ser usado como um modelo de lesão por isquemia e reperfusão para estudar a barreira hematoencefálica, a integridade das junções apertadas e o estresse. Formação de fibras.

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Alluri, H., et.al. Privação e reoxigenação de oxigênio-glicose como um modelo de lesão de isquemia-reperfusão in vitro para estudar a disfunção da barreira hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015).O vídeo demonstra o impacto da privação de oxigênio-glicose e subsequente reoxigenação nas células endoteliais microvasculares do cérebro de ratos (RBMECs), simulando condições hipóxicas e carentes de nutrientes. Essas condições resultam em depleção de ATP, aumento do cálcio intracelular e geração...

Impacto da privação e reoxigenação de oxigênio-glicose nas interações célula-célula

Oclusão carotídea bilateral juntamente com hipotensão sistêmica produz isquemia cerebral em ratos, resultando em danos ao hipocampo com gravidade reproduzível. Assuntos animais são prejudicados com padrões previsíveis de danos cerebrais, eles se recuperam expediente, e as taxas de mortalidade são comparativamente baixas.

2-oclusão do vaso / hipotensão: um modelo de rato de isquemia cerebral

In vitro estão sendo desenvolvidos modelos de lesões cerebrais traumáticas para reproduzir in vivo deformação cerebral. Estiramento lesão induzida tem sido utilizada para neurónios, astrócitos, células da glia, da aorta e células endoteliais cerebrais. No entanto, nosso sistema utiliza a barreira hemato-encefálica (BBB), modelo que possui propriedades que constituem um modelo legítimo do BBB para estabelecer um modelo TBI vitro.

Estique em células cerebrais endoteliais microvasculares (cEnd) como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de lesão cerebral traumática do cérebro Barreira Hemato

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Acidente vascular cerebral isquêmico é um evento complexo, no qual a contribuição específica dos astrócitos à região afetada do cérebro exposto a privação de oxigênio glicose (OGH) é difícil de estudar. Este artigo apresenta uma metodologia para obter isolados astrócitos e estudar sua reatividade e proliferação em condições OGH.

Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma técnica altamente reprodutível para avaliação na vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em modelos do rato de acidente vascular cerebral isquêmico.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Aqui, descrevemos o método para estabelecer um modelo de cultura de células triplas da barreira hematoencefálica baseado em células endoteliais microvasculares cerebrais humanas primárias, astrócitos e pericitos. Este modelo multicelular é adequado para estudos de disfunção da unidade neurovascular durante acidente vascular cerebral isquêmico in vitro ou para a triagem de candidatos a medicamentos.

Um Modelo de Cultura de Células Primárias Triplas da Barreira Hematoencefálica Humana para o Estudo do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico In Vitro

A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.

Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Aprenda a usar privação de oxigênio-glicose e reoxigenação como modelo in vitro de lesão por isquemia-reperfusão para estudar disfunção da barreira hematoencefálica em células endoteliais.

Oxigênio-Glucose Privação e reoxigenação como um In Vitro Isquemia e reperfusão Lesão modelo para estudar Disfunção Barreira Hematoencefálica (Vídeo) | JoVE Journal

Oxigênio-Glucose Privação e reoxigenação como um

Explorar mais vídeos