Isolamento de células mononucleares do Sistema Nervoso Central de ratos com EAE

Ok. Olá, sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vou mostrar como isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos.

Portanto, este procedimento envolve anestesiar profundamente um rato para realizar uma perfusão cardíaca, de modo que não tenhamos nenhum sangue contaminante no sistema nervoso central. Quando o retirarmos, então extrairemos o cérebro e a medula espinhal, faremos uma suspensão de células únicas usando um filtro celular e, em seguida, utilizando um gradiente de dupla camada de percol, isolaremos as células mononucleares. Vamos começar.

Agora estou pronto para realizar a perfusão cardíaca, então vou mostrar todos os materiais de que preciso para isso. A primeira coisa de que precisamos é de um frasco de Bel, e aqui embaixo colocamos toalhas de papel embebidas com anestésico volátil. Você pode usar halano ou isoflurano.

A seguir, precisamos de algo para segurar o rato e de algo para coletar o sangue. Assim, temos esta instalação improvisada para perfundir os ratos. Você vai usar uma agulha de 21 gauge e vamos perfundir uma solução salina por gravidade por meio de um sistema de perfusão intravenosa.

Se você não tiver acesso a um desses sistemas, também pode encher várias seringas com soro fisiológico e perfundir manualmente. Mas isso é muito mais fácil. E o que também precisamos é de um corpo de seringa de 10 ml no qual colocamos lenços de papel Kim.

E vou colocar o anestésico, um pouco do anestésico, na narina do rato para garantir que ele permaneça profundamente anestesiado durante o procedimento. E, é claro, você precisará de instrumentos. Hoje, não vou realizar um procedimento estéril porque não vou colocar as células em cultura.

Portanto, todos os instrumentos que estou utilizando não são estéreis. Mas, é claro, se você deseja colocar suas células em cultura, talvez queira usar instrumentos estéreis. Para os fins deste vídeo, vou utilizar um rato que está realmente morto.

Então posso realizar o procedimento lentamente para mostrar a você, passo a passo. É claro que, em um procedimento real, você precisaria de um rato profundamente anestesiado, mas não morto. Você desejaria que o coração ainda estivesse batendo.

Então, vamos começar com essa rata. Coloquei a rata de costas, voltada para longe de mim, e coloquei as toalhas umedecidas sobre o seu nariz. Em seguida, a primeira coisa que vou fazer é verificar se a rata está profundamente anestesiada.

Portanto, você precisa fazer isso antes de cada um desses procedimentos. Então, pego minha pinça e belisco o rato, e não há nenhuma reação. Se houver qualquer reação, você precisa colocar o rato de volta no belger para garantir que ele esteja profundamente anestesiado.

Então vou usar etanol a 70% para encharcar a metade superior do rato. Em seguida, vou abrir a cavidade torácica. Primeiro, vou cortar a pele e abri-la lateralmente.

Então vou abrir a cavidade propriamente dita. Esta massa aqui é o coração. Aqui você pode ver o átrio direito.

É isso que vou cortar para permitir que o sangue escoe. E então, para perfundir todo o corpo, preciso inserir minha agulha no ventrículo esquerdo. Vou inserir minha agulha bem aqui.

E uma vez que a agulha for inserida, vou abrir o tubo IV para permitir que o soro fisiológico flua, e deixarei por cinco a dez minutos. Se a perfusão estiver boa, você observará uma descoloração do pulso vermelho, do nariz vermelho e dos olhos do rato, é claro, indicando que o sangue está saindo do corpo do rato. Isso significa que a perfusão deve estar adequada.

Aqui está o rato após a perfusão cardíaca. Como é possível observar, o nariz, as orelhas e os olhos deste rato já não estão rosados ou vermelhos. Estão completamente brancos, o que indica que a perfusão funcionou bem.

Todo ou a maior parte do sangue saiu das manchas do rato. Agora que o rato foi perfundido cardíacamente, preciso cortar sua cabeça. Preciso decapitar o rato.

E para isso, vou usar equipamento de laboratório comum. Agora vou remover o cérebro da rata. Vou encharcar todo o pelo com etanol 70% apenas para evitar que pelos se espalhem ao redor.

Em seguida, vou remover primeiro a pele. E como não pretendo utilizar o cérebro para histologia, e vou cortá-lo em pedaços pequenos, não estou sendo muito cuidadoso ao removê-lo de forma limpa. De uma só vez, vou inserir minha tesoura na base do crânio, onde o cérebro se conecta à medula espinhal bem aqui.

E vou cortar o osso em cada lado e, em seguida, vou remover a parte superior. E vou fazer isso repetidamente. Assim, aqui está o cérebro completamente exposto.

E como você pode ver, a perfusão funcionou bem porque o cérebro está completamente claro. Em um animal não perfundido, você veria que a camada superior do cérebro estaria completamente coberta por capilares vermelhos, capilares sanguíneos vermelhos, de modo que você não os vê em absoluto, o que indica que a perfusão foi bem-sucedida. Agora vou extrair o cérebro, certificando-me de não deixar o bulbo olfatório para trás, e vou colocá-lo em um tubo contendo uma solução chamada PBS gelada.

Agora, ainda sem ter muito cuidado para mantê-lo intacto, vou colocar o cérebro no tubo com PBS e vou cortar os nervos ópticos; então, usando uma espátula, ele sairá com bastante facilidade. Agora vou remover a medula espinhal do mesmo rato. E novamente, como vamos cortá-la em pequenos pedaços, não precisarei ter muito cuidado em removê-la de maneira muito limpa, desde que consiga retirar toda ela.

Primeiro, corto a pele ao longo da coluna vertebral e a coluna vertebral fica visível aqui. Em seguida, vou remover a carne aqui para que a coluna vertebral fique exposta por completo. E bem aqui é possível ver a medula espinhal.

Em um camundongo, você pode cortar as duas extremidades e injetar PBS com a seringa, e a medula espinhal sairá quase inteira. Mas em ratos, não é tão fácil. Preciso abri-la e remover a medula espinhal com uma espátula.

Agora vou cortar em ambos os lados e, assim como fiz com o cérebro, corto e removo o osso para expor a medula espinhal. E, da mesma forma que ocorreu com o cérebro, a medula espinhal está completamente branca, o que indica que a perfusão cardíaca funcionou bem. E vou fazer isso ao longo de toda a coluna vertebral.

E desço até aproximadamente o nível do quadril direito, que é bem aqui. Então, vou usar uma pinça, e isso não é muito bonito, mas vou simplesmente puxar a medula espinhal e colocá-la no meu tubo com o cérebro. Agora, no meu tubo, tenho tanto o cérebro quanto a medula espinhal do rato, e agora estou pronta para preparar minha suspensão de células simples.

Agora estou pronto para preparar uma suspensão de células isoladas a partir do meu sistema nervoso central. Para isso, vou precisar de uma placa de petri de 10 centímetros, na qual colocarei um filtro de células de 70 mícrons. Também vou utilizar o êmbolo de uma seringa de um mililitro, além de pinça e tesoura.

Então, vou colocar minha amostra na peneira de células e verificar se não sobrou nada no tubo. Em seguida, vou cortá-la em pedaços pequenos, misturando o cérebro e a medula espinhal. Quando tudo estiver bem picado, vou usar o êmbolo da seringa de Oneill e empurrá-lo através da peneira.

E você vai observar progressivamente que o PBS fora do separador celular ficará mais turvo conforme as células isoladas passam por ele. Se eu quisesse que minha suspensão celular fosse estéril, é claro que faria isso em uma câmara de cultura de tecidos e não colocaria os dedos dentro dela. Agora que o PBS está turvo, vou coletá-lo pela primeira vez e colocá-lo em um tubo de 50 mL.

Mas também vou manter o controle visual e vou adicionar mais PBS ao meu filtro celular, e vou esmagar a amostra. Como o SNC contém muita gordura, é um dos órgãos que considero mais difíceis de preparar uma suspensão celular usando esta técnica. Portanto, passei todo o meu SNC pelo filtro celular várias vezes e coletei toda a suspensão de células isoladas.

E aqui está o tubo que enchi até 50 ml com PBS contendo minha suspensão de células únicas preparada a partir do SNC da direita. Agora, vou centrifugar este tubo para prepará-lo para o gradiente, então as células terminaram de centrifugar. Temos um pellet agora, então vou descartar o sobrenadante e vou ressuspender minhas células em 20 mililitros de Percoll a 30% em PBS.

E vou sobrepor isso a 10 mils de perkel 70% em PBS para promover a migração. Então descarto o sobrenadante. Desfaço o pallet para garantir que as células estejam em uma suspensão simples e não em agregados no pellet.

Agora tenho minha suspensão de células do SNC em suspensão simples de células. Vou suspender essas células em 20 mL de Percoll a 30% em PBS e vou sobrepor esses 20 mL sobre 10 mL de Percoll a 70% em PBS. Em seguida, vou centrifugar.

Agora vou pegar meus 20 mililitros de suspensão do SNC e sobrepor lentamente sobre a camada de percol 70% para facilitar. Você também pode adicionar um corante como vermelho de fenol em uma das camadas, mas não tenho certeza sobre o que ele faz às células, caso faça algo. Por isso, tento evitá-lo.

Você deseja ir devagar o suficiente para que as duas camadas não se misturem, de modo que não haja turbulência acentuada na camada inferior. E conforme a camada superior fica mais espessa, você pode aumentar a velocidade. Agora, adicionei minhas células ao gradiente.

Então, a camada clara aqui embaixo é a camada de 70% de percel, e a camada turva na parte superior é uma camada de 30% de percel que contém minha suspensão de células isoladas. E agora vou colocar este tubo na centrífuga por 20 minutos, e conseguirei visualizar a camada de células monoculares caso tenha trabalhado bem. Agora concluímos a centrifugação do gradiente.

Portanto, como sempre, ao centrifugar um gradiente, tenha muito cuidado para desligar o freio, a fim de evitar que ele interrompa o gradiente ao desacelerar muito rapidamente. Agora temos nossas camadas. Na parte superior do gradiente, há uma camada de gordura que vou remover para evitar contaminar minha suspensão celular.

E na interface entre as duas camadas de percel 30 e 70%, você observa que a interface não é nítida, está difusa, e é exatamente onde estão as células. Assim que eu remover as células, você verá que a interface ficará muito mais nítida. Então, vou apenas remover a maior parte da gordura na camada superior e descartá-la no lixo.

Não preciso remover todo o líquido, mas quero retirar o suficiente para que ele não recubra completamente minha pipeta quando eu descer para obter as células monoculares. Agora, usando outra pipeta de transferência, vou até o nível da interface e coletarei minhas células. Assim, coletei várias milésimas no nível da interface.

Então, provavelmente tenho todas as células que poderia obter ali. O número de células monoculares no SNC era realmente pequeno. Agora tenho minhas células mononucleares no tubo.

Vou completar esse tubo até 50 ml com PBS e vou centrifugar as células para sedimentá-las, o que irá remover a perla. Recomendo lavá-las pelo menos algumas vezes com um tubo cheio de PBS para garantir que você se livre de toda a perla. Depois disso, as células estarão prontas para qualquer procedimento que deseje realizar com elas.

Hoje eu mostrei a você como isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos. Então, é claro, uma vez que você tenha essas células mononucleares, pode purificá-las ainda mais para isolar, por exemplo, linfócitos T da população. O que vou fazer com essas células é realizar um ensaio de citometria de fluxo para detectar as populações celulares que estavam no meu cérebro.

E boa sorte com o seu isolamento celular.