Name: Superfície reforçada Raman Detection Espectroscopia de Biomoléculas Usando EBL Fabricadas Nanoestruturados Substratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a fabricar substratos nanoestruturados por litografia de feixe de elétrons para espectroscopia Raman reforçada por superfície. Este método permite detectar proteínas e aptâmeros imobilizados com alta sensibilidade.

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Os autores gostariam de agradecer: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside e Albert Cao por sua ajuda no desenvolvimento e preparação dos conjugados de proteínas, bem como o aptâmero de DNA; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar e Trevor Olsen por sua assistência na preparação da amostra, Jonathan Mane por sua assistência na geração de imagens das estruturas moleculares; e as fontes de financiamento, incluindo o Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá – Instituto Nacional de Nanotecnologia (NRC-NINT), Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e a Universidade de Alberta por apoiar o trabalho.

1. Preparação do Substrato <ol><li> Use uma serra de semicondutores em cubos para cortar um wafer de sílica fundida (FS) em um centímetro x 1 cm ou dados menores. </li><li> Amostras limpas em uma solução piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; ATENÇÃO: forte oxidante) banho de 28 para 15 min, em seguida, lavar os dados em água deionizada e seco em nitrogênio. </li><li> As amostras são colocadas sobre uma placa de aquecimento a face para cima a 180 ° C durante 15 min. Arrefecer as amostras após a remoção da placa de RT. </li><li> Para Designs 1 e 3, vá para o passo 2. </li><li> For Design 2, colocar a amostra em uma câmara de evaporação por feixe de elétrons e revestimento com uma camada de 10 nm de Ni. </li></ol> 2. Fabricação de Máscaras PMMA Nano-modeladas Usando Electron Beam Litografia (EBL) <ol><li> Spin-coat da PMMA resistir e camadas condutoras sobre os substratos. <ol><li> Use um spinner wafer com um mandril de vácuo e as amostras lugar individualmente no centro do chuck. Lugar1 gota de polimetilmetacrilato (PMMA) em resistir ao centro das amostras, utilizando uma pipeta de vidro e de centrifugação a 3500 rpm durante 60 segundos com um tempo de subida de 2 seg. </li><li> Coza os substratos a 180 ° C durante 3-5 min. Após o cozimento dos substratos, arrefecer as amostras para RT. </li><li> Com os substratos arrefecida e devolvida ao mandril rotativo, espalhar uma gota de polímero condutor sobre o substrato. Gire o substrato para 40 segundos a 3.000 rpm com um tempo de rampa 2 sec. Amostras Asse em forno a 80 ° C durante 1 min. </li></ol></li><li> Realizar exposição EBL de acordo com o procedimento padrão 16,17,18,29. <ol><li> Usando as instruções do fabricante, preparar um projeto de exposição empregando doses de recursos a partir da Tabela 1 com o menor tamanho possível passo viga. </li><li> Coloque a amostra na câmara de litografia por feixe de elétrons. Se o sistema não tem EBL de auto-focagem, utilizar uma pequena distância a partir do zero, onde o padrão é para ser exposto e para longe da extremidade do talão para focoing. </li><li> Usando as instruções do fabricante, faça o necessário foco e correção de astigmatismo, bem como o alinhamento campo de gravação conforme o caso, e expor a amostra. Para permitir o perfil de exposição adequado e melhor qualidade padrão, use uma energia do feixe de elétrons de 30 keV e 7,5 mm de abertura para as exposições. </li></ol></li><li> Remover o polímero condutor e desenvolver amostras expostas. <ol><li> Prepara-se uma proveta com água desionizada (DI) de água para remover o polímero condutor e um segundo recipiente com uma mistura de revelador (IPA: H 2 O 7: 3), e agita-se durante 5 min à temperatura ambiente. Prepara-se isopropanol (pureza elevada) em um terceiro balão como um agente de enxaguamento. </li><li> Com uma pinça, coloque as amostras na água durante 3 segundos para remover o filme de polímero condutor, em seguida, coloque a amostra para o desenvolvedor e mover as pinças lentamente para cima e para baixo por 20 s. Transferir imediatamente os substratos para o isopropanol e enxaguar para mais de 10 segundos, em seguida, secar a amostra com nitrogênio. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Noble metal Nanoestruturas Fabrication <ol><li> Coloque as amostras de cabeça para baixo para o sistema evaporador de feixe de electrões para permitir o metal evaporado para ser depositado sobre a face frontal das amostras. Deposite a 10 nm de espessura Au camada sobre as amostras para Designs 1 e 3, e uma camada de 10 nm de espessura Ag for Design 2, a uma taxa de aproximadamente 0,1 nm / seg. </li><li> Encher um sistema de ultra-sons para a altura recomendada com água e encher um recipiente separado com acetona. Colocar-se uma face da amostra do fundo do copo e permitir que a amostra de molho durante 10 minutos. Segurando a taça, colocá-lo dentro do banho de água e permitir que a altura da acetona para coincidir com a altura da água e ligar o sistema de ultra-sons. Permitir sonificação a ocorrer por até 60 seg. </li><li> Usando o mesmo procedimento, conforme detalhado na etapa 3.1, preparação de substratos uniformes almofada Au e Ag pela deposição de 10 nm de espessura filmes metálicos em FS (Designs 1 e 3) e FS Ni-revestidos (projeto 2) substrates pular a etapa 2. </li></ol> 4. Bio-funcionalização de Substratos <ol><li> Prepare um projeto amostras: <ol><li> Prepara-se uma solução 1 mM de ácido 11-mercaptodecanoic (MUA) em etanol à temperatura ambiente. Sonicate para 10 min. </li><li> Imergir substrato nanoestruturada adequado na solução de MUA durante 48 horas. Lavar a amostra com etanol e seco três vezes durante 5 min à TA. </li><li> Prepara-se uma solução 75 mM de N-etil-N &#39;- (3- (dimetilamino) propil) carbodiimida (EDC) em água Dl. Prepara-se uma solução 15 mM de N-hidroxissuccinimida (NHS) em água Dl. </li><li> Usando uma micropipeta depósito 100 ul de NHS no Au sobre o substrato, e adicione imediatamente 100 uL de EDC sobre a mesma área. Incubar durante 1 min para activar a monocamada auto-montada (SAM) de MUA. </li><li> Colocar uma gota 100 uL de solução de proteína A (47 | iM) sobre a mesma área do substrato e armazenar a amostra durante 24 horas a 5 ° C em um ambiente multi-compartimento Petri dish com 1 ml de água Dl no outro compartimento, e com uma tampa selada. </li><li> Lavar a amostra com água DI 3 vezes por mexendo continuamente as amostras em copos separados por 20 segundos em cada copo. Não deixe que as amostras de secar após a lavagem ou durante a lavagem. </li><li> Vá para a etapa 5. </li></ol></li><li> Prepare Design 2 amostras: <ol><li> Prepara-se uma solução 0,9 mM de glucose proteína de ligação (BRL) em tampão de fosfato de potássio (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Prepara-se uma solução 100 mM de D-glicose no buffer. </li><li> Misturar 30 ml de solução de D-glucose a 100 mM e 30 ul de solução 0,9 mM de GBP 1 ml usando um recipiente de plástico e um microtubo micropipeta. Incubar por 30 min. </li><li> Depósito de 20 ul da solução de ligando livre GBP e da solução de GBP ligada ao ligando cada um dos substratos preparados utilizando uma micropipeta. Armazenar as amostras a 5 ° C durante 24 horas numa placa de Petri com uma tampa selada. </li><li> Lavar as amostras 3 vezes nosolução tampão de fosfato de potássio à temperatura ambiente. </li><li> Vá para a etapa 5. </li></ol></li><li> Prepare Design 3 amostras: <ol><li> Dilui-se a solução de aptâmero de ligação da dopamina (DBA), para uma concentração de 1 uM, utilizando o tampão TRIS de EDTA com um pH final de 7,4. </li><li> Prepara-se uma solução de dopamina para uma concentração de 5 uM medindo o pó de dopamina numa balança analítica e misturando-a no soro tamponado com fosfato (PBS) com um cordão de agitação durante 5 min. </li><li> Depositar uma gota de 20 ul da solução de DBA na superfície de cada substrato e deixar que as amostras de sentar-se durante 1 hora à temperatura ambiente com uma tampa sobre a caixa de Petri. </li><li> Lavar as amostras 3 vezes em tampão de fosfato de potássio (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). </li><li> As amostras são colocadas em posição vertical no topo de uma sala limpa classe limpar a seco da parte traseira, mantendo um filme sobre o lado da frente do substrato. Defina uma amostra de lado como um controle. </li><li> Colocar uma gota de 5 ul da solução de dopamina on a superfície da gota existente da solução tampão PBS nos restantes amostras com as concentrações de dopamina desejados. Incubar a amostra durante 10 min. </li><li> Coloque uma gota de solução de dopamina na superfície do pad Au sem aptamer. Incubar durante 10 min. </li><li> Lavar as amostras em solução tampão de fosfato de potássio 3 vezes. </li></ol></li></ol> 5. Espectroscopia Raman <ol><li> Coloque cada amostra em uma câmara à prova de água para evitar a evaporação pela exposição laser. <ol><li> Encha uma seringa de plástico com quimicamente inerte graxa alto vácuo, amostras lugar em lâminas de vidro e dispensar alguns milímetros de em torno das amostras de graxa sem tocar nas amostras. </li><li> Coloque uma lamela de microscópio em cima dos substratos e pressione ligeiramente para baixo para formar um vedante, criando uma interface líquido fino entre os substratos e as lamelas, sem permitir que o tampão para entrar em contacto com a massa de vácuo. </li></ol></li><li> Usando umsistema de microscópio óptico de Raman, obter uma focagem sobre a superfície da região modelada-nano o metal a ser amostrada sem ligar o laser. </li><li> Realizar Raman amostragem 18,19 com uma intensidade do laser entre 2,4-3,1 mW com uma duração total de menos de 20 segundos para impedir danos para a amostra com uma objectiva de ampliação 10X. Adquirir espectros Raman para amostras de Designs 1, 2, e 3, utilizando os comprimentos de onda de excitação, como indicado na Tabela 1. Além disso adquirir espectros Raman controle de soluções de proteína A, GBP, e D-glucose, e para a dopamina em pó empregando lâminas de vidro sem metal nanoestruturas como suporte para comparação. </li></ol>

<ol><li>Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Nanomaterial+Bioconjugates%3A+A+Review+of+Current+and+Emerging+Purification+and+Characterization+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques.</a> Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).</li>
<li>Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Bio-Functionalized+Electrodes%3A+Recent+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications%2C+Techniques%2C+and+Microfluidic+Interfacing+for+Nanoscale+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing.</a> Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).</li>
<li>Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithography-Based+Nanoelectrochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lithography-Based Nanoelectrochemistry.</a> Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).</li>
<li>Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Covalent+Protein+Immobilization%3A+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications.</a> Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).</li>
<li>Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Histidine-Tagged+Proteins+on+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).</li>
<li>Kim, D., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Immobilization+Techniques+for+Microfluidic+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays.</a> Biomicrofluidics. 7, 041501(2013).</li>
<li>Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+with+Plasmonic+Nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Biosensing with Plasmonic Nanosensors.</a> Nature Materials. 7, 442-453 (2008).</li>
<li>Bantz, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Progress+in+SERS+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.Chem%22%5BJournal%5D)">Recent Progress in SERS Biosensing.</a> Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).</li>
<li>Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS%3A+Materials%2C+Applications%2C+and+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">SERS: Materials, Applications, and the Future.</a> Mater. Today. 15, 16-25 (2012).</li>
<li>Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating%2C+Characterizing%2C+and+Controlling+Chemistry+with+SERS+Hot+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.Chem.Chem.Phys%22%5BJournal%5D)">Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots.</a> Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).</li>
<li>Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+on+the+Fabrication+of+Substrates+for+Surface+Enhanced+Raman+Spectroscopy+and+their+Applications+in+Analytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry.</a> Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).</li>
<li>Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Metal+Nanostructure+for+SERS+Application%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanomater%22%5BJournal%5D)">Engineering Metal Nanostructure for SERS Application.</a> J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).</li>
<li>Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectric-Substrate-Induced+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+B%22%5BJournal%5D)">Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering.</a> Phys. Rev. B. 80, 085416(2009).</li>
<li>Merlen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Enhanced+Spectroscopy+with+Gold+Nanostructures+on+Silicon+and+Glass+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates.</a> Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).</li>
<li>Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopatterning+of+PMMA+on+Insulating+Surfaces+with+Various+Anticharging+Schemes+Using+30+keV+Electron+Beam+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+B%22%5BJournal%5D)">Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography.</a> J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304(2011).</li>
<li>Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Multilayer+Systems+in+Electron+Beam+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+B%22%5BJournal%5D)">Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography.</a> J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407(2013).</li>
<li>Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+EBL+Fabricated+Nanostrucutred+Substrates+for+SERS+Detection+of+Protein+A+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.B%22%5BJournal%5D)">Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution.</a> J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).</li>
<li>Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy+Detection+of+Protein-Ligand+Binding+Using+D-glucose+and+Glucose+Binding+Protein+on+Nanostructured+Plasmonic+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates.</a> , (2014).</li>
<li>Peters, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Fabrication+and+Testing+of+Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy+Substrates+for+the+Detection+of+Biomolecules+%5BMSc+%5D%22">Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]</a>. , University of Alberta. (2014).</li>
<li>Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dmensional+Solution+Structure+of+the+B+Domain+of+Staphylococcal+Protein+A%3A+Comparisons+of+the+Solution+and+Crystal+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures.</a> Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).</li>
<li>Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Structure+of+E.+Coli+Glucose%2FGalactose+Binding+Protein+Bound+with+Glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Collaboratory+for+Structural+Bioinformatics+%28RCSB%29+Protein+Data+Bank%22%5BJournal%5D)">High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose.</a> Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).</li>
<li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VMD+-+Visual+Molecular+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Graphics%22%5BJournal%5D)">VMD - Visual Molecular Dynamics.</a> J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).</li>
<li>Walsh, R., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+Function+in+the+DNA+Homolog+of+the+RNA+Dopamine+Aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).</li>
<li>Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ValFold%3A+Program+for+the+Aptamer+Truncation+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Inf%22%5BJournal%5D)">ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process.</a> Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).</li>
<li>Han, K., Lee, Y., Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PseudoViewer%3A+Automatic+Visualization+of+RNA+Pseudoknots%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots.</a> Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Binding+Proteins%3A+a+Versatile+Superfamily+for+Protein+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).</li>
<li>Benson, D. E., Conrad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+Bioelectronic+Interfaces+by+Exploiting+Hinge-Bending+Motions+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins.</a> Science. 293, 1641-1644 (2001).</li>
<li>Bozic, S., Chorzempa, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozic%2C+S+%22Pirahna+Cleaning%22">Pirahna Cleaning</a>. , University of Alberta. (2011).</li>
<li>Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , University of Alberta. (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Atomic+and+Molecular+Electronic+Structure+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">General Atomic and Molecular Electronic Structure System.</a> J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).</li>
<li>Bode, B. M., Gordon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MacMolPlt%3A+a+Graphical+User+Interface+for+GAMESS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Mol.+Graph.+Mod%22%5BJournal%5D)">MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS.</a> J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).</li>
<li>Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopical+Vibrational+Band+Assignment+and+Qualitative+Analysis+of+Biomedical+Compounds+with+Cardiovascular+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Chem.+Tech.+Res%22%5BJournal%5D)">Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity.</a> Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).</li>
<li>Bandekar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+Modes+and+Protein+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Amide Modes and Protein Conformation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).</li>
<li>Barth, A., Zscherp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Vibrations+Tell+About+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">What Vibrations Tell About Proteins.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).</li>
<li>Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+Raman+Microscopy%3A+Current+Applications+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).</li>
<li>Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+Analysis+of+Dopamine+Neutral+Base+based+on+Density+Functional+Force+Field%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.-Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field.</a> Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).</li>
<li>Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Protein+A+on+SAMs+for+the+elaboration+of+immunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Surf.+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors.</a> Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).</li>
<li>Lakowicz, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiative+decay+engineering%3A+2.+Effects+of+Silver+Island+Films+on+Fluorescence+Intensity%2C+Lifetimes%2C+and+Resonance+Energy+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer.</a> Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

SERS está ganhando reconhecimento como uma técnica extremamente poderosa de detecção de bio oferecendo muitas vantagens exclusivas. A relação com vibrações moleculares permite identificar selectivamente &quot;impressões digitais&quot; de analitos específicos a partir de espectros de SERS, ao passo que a sensibilidade extremamente elevada faz com que seja possível a detecção de quantidades muito pequenas da substância a analisar 9,10,11,35. Além disso, a SERS é uma técnica não destrutiva que também é relativamente insensível à água, e assim é muito bem adequado para sondar materiais biológicos no seu ambiente aquoso 9 natural. Os resultados apresentados enfatizam estas vantagens, bem como demonstrar ainda mais forte potencial de SERS como uma técnica livre de marcador muito flexível de detecção de bio. Em três modelos diferentes empregando monocamadas de biomoléculas imobilizadas-substrato, modos de Raman foram detectados que poderia ser atribuído a confiança dos analitos particulares. Que a detecção dessas biomoléculas, or seus respectivos ligantes, foram demonstradas empregando superfícies planas de sílica fundida como o apoio para substratos SERS, faz com que os projetos compatíveis com a eletrônica e as configurações atuais microfluídica, prometendo inúmeras aplicações em relação com arquiteturas bioelectrónicas interface materiais biológicos com superfícies de electrónica emergente e dispositivos electroquímicos 2,3. Importante, em dois de três modelos de detecção SERS foi demonstrada para a ligação específica de moléculas pequenas, tais como a glucose e a dopamina, utilizando monocamadas de proteína imobilizada na superfie e aptâmero, respectivamente, como os elementos de reconhecimento. No entanto, vários aspectos devem ser levados em conta, de, a fim de alcançar uma detecção de bio-SERS eficiente no ambiente &quot;on-chip&quot;. Primeiro de tudo, um desafio bem conhecido que é comum para a maioria das biomoléculas é a sua propensão para se degradar, especialmente quando expostas a condições não-naturais, tais como envi secoente ou luz laser intenso. Durante todo o protocolo, enfatizamos a importância de sempre manter as amostras bio-funcionalizada imersos em soluções adequadas durante todo o experimento, desde a preparação das amostras para a aquisição de espectros Raman. Para o último, uma câmara à prova de água tem sido costume concebido (Figura 7) para evitar a evaporação do líquido durante exposições a laser. A duração da exposição e intensidade do laser também deve ser limitado, tal como descrito no passo 5.3 do protocolo para evitar danos das amostras. Os resultados da detecção de SERS são encontrados sensível à geometria do substrato utilizado, e particularmente a separação entre as característica de nanoestruturas metálicas. Como decorre Figuras 8 e 9, a intensidade SERS da Design amostras de 1 depende fortemente da largura das lacunas entre a UA nano-pontos em sílica fundida. Fora de três matrizes de Au nanopontos testado in esta concepção (Figura 8), a intensidade mais elevada de Raman é conseguido com matriz I, que possui as aberturas mais estreitas entre as características Au e, portanto, fornece reforço campo electromagnético mais eficiente. Como mostra a Figura 9 ilustra, é necessário o controlo de separações inter-apresentam ao nível de 10-20 nm ou menos. Empregando EBL para fabricar substratos SERS, como demonstrado aqui, fornece uma resolução eficiente especificamente para controlar a largura das lacunas inter-metragens. Com uma EBL-tom de protecção positiva, tais como o PMMA, o tamanho dos orifícios nas máscaras de PMMA pode ser variada simplesmente alterando as doses de exposição. Após a decolagem, isso resulta em diferentes tamanhos de pontos fabricadas de metal, e a largura de lacunas entre os pontos poderão ser sintonizadas como desejado, selecionando exposição EBL adequada doses 18. O outro desafio é a otimização da geometria substrato SERS para aplicação de detecção de bio específico. Embora o efeito de aumento de increases com uma diminuição das lacunas inter-metragens, o tamanho relativamente grande de moléculas biológicas impõe limitações sobre como diminuir a distância pode ser. Isto é evidente a partir dos resultados para Design 2, em que o método de imobilização é tal que a proteína liga-se eficientemente apenas à superfície entre pontos de metal nobre, mas não para os próprios pontos (ver Figura 3B). Como resulta a partir da Figura 10, os espectros de SERS para almofadas Ag não estruturados não mostram quaisquer bandas do analito. Embora as almofadas exibem uma estrutura nano-cristalina com lacunas inter-ilhas muito finas (veja a Figura 6F) essas lacunas são demasiado estreitas para acomodar uma molécula de proteína. Ainda uma outra dimensão de complexidade é adicionado quando a proteína-ligando de ligação tem de ser detectado. Na Figura 10, as bandas de SERS CH são mais pronunciados nos espectros de GBP ligada ao ligando do que na livre de ligando, que pode ser explicada pela hipótese de uma alteração da conformação GBPapós a ligação de D-glucose 2 7,27, resultando numa estrutura mais rígida com o aumento da actividade de Raman. Se compararmos os dois substratos nanoestruturados, a banda CH de proteína livre de ligante é mais forte nos espectros SERS obtida com o substrato nano-pontos, ao passo que tanto as bandas de proteína e glicose CH de proteína ligada ao ligando são mais pronunciados com as nano-hexágonos substrato. Dois fatores são esperados para resultar em tais diferenças, a disponibilidade de espaço entre Ag apresenta onde o GBP poderia ligar-se a Ni, e da susceptibilidade da proteína livre ligado ao ligando e ligando para o reforço eletromagnético do espalhamento Raman em &quot;pontos quentes&quot; entre esses recursos. Por um lado, o padrão nano-dots oferece uma área inter-característica relativamente maior, onde o revestimento Ni está disponível para a proteína de se ligar, o que pode explicar uma banda CH mais acentuada observada para GBP livre de glucose no Ag substrato nano-pontos. Por outro lado, devido sua estru não uniformeture (veja a Figura 6D), Ag nano-hexágonos pode ser propenso a mostrar uma melhoria eletromagnético forte em intervalos estreitos entre as ilhas Ag dentro de nano-hexágonos, resultando em bandas de vibração CH mais fortes de GBP ligados a glicose no substrato nano-hexágonos. Alguns detalhes desta interação requerem uma verificação mais aprofundada, e otimização de substratos SERS para analitos complexas, que envolvem grandes proteínas, como o GBP ainda está no pipeline. Claramente, a detecção de SERS de ligação empregando biomoléculas imobilizadas como um elemento de reconhecimento de ligando é facilitada quando apenas o ligando é Raman activa numa região seleccionada, ao passo que as outras componentes não são. Este é o caso de desenho 3, onde são obtidos SERS pronunciados bandas de dopamina ligado a aptâmero (Figura 11). A par aptâmero-dopamina exibe excelente especificidade e o espectro de SERS compreende bandas pronunciadas sem qualquer sinal de fundo significativa. <p class="jove_content"&gt; Future avanço da tecnologia SERS rótulo-fee envolveria extensos testes de aumento do sinal SERS &#39;biomoléculas com uma ampla gama de diferentes designs nanoestrutura superfície. O uso do e gravação direta de litografia por feixe de elétrons para fabricar várias nanoestruturas com um excelente nível de controle sobre o tamanho, forma e separação inter-metragem, combinado com os protocolos de preparação de amostras apresentadas aqui, iria facilitar a comparação e validação cruzada dos resultados obtidos por diferentes grupos de pesquisa. Isso resolveria o maior desafio da reprodutibilidade quando substratos SERS são fabricados empregando alternativa &quot;bottom up&quot; métodos 11,12,13, permitindo um melhor controle do tamanho de metal da nanoestrutura ea posição em direção a uma identificação confiável de projeto ótimo substrato para uma ampla variedade de aplicações. Escalabilidade destas técnicas podem ser posteriormente melhorada combinando EBL com métodos nanolithography complementares, tais como nanoimpressão litográfica 19 em direção a futura produção em massa de projetos em nanoescala otimizado empregando as técnicas EBL ajustáveis.

Capacidades de desenvolver e caracterizar conjugadas nano-biológico sistemas de interface nanoestruturas sólidos e polímeros biológicos estão se tornando cada vez mais importante para novos avanços na próxima geração de bio-sensores e bio-tecnologias de atuação 1,2. Trata-se de estudos multidisciplinares através de um número de campos de pesquisa, como a fabricação de componentes pertinentes de estado sólido (micro-nano ou eletrodos, revestimentos de nano-projetado, nanofios ou nanopartículas) 2,3,4; imobilização de biomoléculas sobre as superfícies para a criação de bioconjugados desejados 5,6,7; e monitorar interfaces de nano-biológico 1. Na maioria dos casos, a selecção de fabrico ideal, bio-funcionalização, e os métodos de caracterização é fortemente inter-relacionados. Claramente, a escolha de técnicas de nanofabrico iria ser accionado pelos requisitos dos componentes do estado sólido do sistema, sendo em grande parte, dependente do método de detecção, em que turn é determinada pela natureza dos biopolímeros envolvidas e a fim de controlar a interface. Fora de uma ampla variedade de técnicas utilizadas para caracterizar sistemas Bioconjugate 1,3 superfície melhorada, espectroscopia de Raman (SERS) tem emergido como um método altamente promissora para a detecção de espécies químicas e biológicas em superfícies 8,9,10,11. SERS emprega espalhamento inelástico de luz monocromática por biomoléculas imobilizadas de superfície (Figura 1) que permitem a captura de assinaturas originais correspondentes às vibrações moleculares. Esta capacidade de distinguir entre diferentes moléculas sem envolver rótulos, química complexa, ou etapas demoradas, faz SERS um método potencialmente muito eficiente de detecção de bio. Outra vantagem importante de SERS é a sua elevada sensibilidade. A excitação de plasmons de superfície localizados pela luz interagindo com nanoestruturas de metais nobres (substratos SERS) aumenta drasticamente a intensity de Raman do analito, permitindo a detecção de quantidades muito pequenas de moléculas, a partir de monocamadas de até o limite de uma única molécula 8,9,10,11. Finalmente, a maioria das biomoléculas requerem soluções aquosas de ser estável. Porque a água muitas vezes tem atividade Raman limitado, sinal de fundo a partir de amostras aquosas é minimizado 9. Aplicações da SERS exibiram um aumento exponencial na última década 10. No entanto, um desafio muito discutido da SERS é que o reforço eletromagnética de espalhamento Raman depende criticamente o tamanho, forma, e espaçamento de nanoestruturas metálicas onde as ondas plasmonic são induzidas 11,12,13. A fim de conseguir medições SERS eficazes e reprodutíveis, o controle sobre a geometria do substrato é necessária nas dimensões em escala nano. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" /> Figura 1. Scheme da espectroscopia Raman superfície melhorada. Numerosos métodos empregados para fabricar substratos SERS 11,12,13 pode ser grosseiramente classificados em métodos de baixo para cima e de cima para baixo. Os métodos do primeiro tipo, empregar vários processos de auto-montagem ou dirigida síntese química para a produção de nanoestruturas. Muitas vezes abordados exemplos incluem a imobilização de nanopartículas monodispersos em suportes sólidos 11,12,13, térmica, por pulverização catódica, ou à deposição eletroquímica de filmes de metal rugosas 11,12, e vários métodos de síntese química 13. Embora tais técnicas tendem a ser relativamente simples e barata, a maioria deles são desafiados por uma falta de controlo sobre o local das estruturas e reprodutibilidade limitada de amostra para amostra. Em contraste, as técnicas de litografia de cima para baixo empregar instrumentos manipuláveis ​​como feixes de partículas para criar padrões desejados em superfícies. Um dos mais frequentemente utilizadométodos nanolitografia, litografia por feixe de elétrons (EBL), oferece excelente controle sobre os recursos até abaixo de 10 nm e também a flexibilidade para permitir diferentes modelos de substrato em suportes sólidos 11,12. Em EBL, um feixe de electrões focado para baixo para um ponto de alguns nanómetros em diâmetro varreduras através de uma superfície de um material sensível electrões (resistir) causando uma alteração química em regiões expostas. Para tom resiste positivo, tal como polimetilmetacrilato (PMMA), os resultados de exposição do feixe de electrões em cisão das cadeias de polímero que constituem a resistir, levando a um aumento da solubilidade no seio de um solvente apropriado (programador). O processo de litografia de feixe de electrões inclui spin-coating de uma camada uniforme de resistir a um substrato; exposição do material resistir alvo de uma câmara de vácuo com um feixe de electrões; e desenvolvimento da amostra para remover as regiões solúveis. Suportes dielétricos debaixo nanoestruturas metálicas, tais como sílica fundida, têm been mostraram aumentar significativamente as intensidades em SERS devido à localização das ondas plasmonic em comparação com outros materiais, tais como silício 14,15. No entanto padronização EBL em substratos dielétricos, especialmente em nanoescala, implica desafios significativos devido ao acúmulo de carga durante a exposição. Anteriormente, temos mostrado 16,17 que estas dificuldades podem ser ultrapassadas pela colocação camadas poliméricas condutoras acima resistir a. A Figura 2 mostra um diagrama esquemático do processo global de fabricação usando a exposição e revelação EBL seguido de deposição de metal e de descolagem para a produção de nanoestruturas metálicas em fundido suportes de sílica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de eLectron litografia por feixe, a deposição de metal, e do processo de decolagem passos empregados para fabricar nanoestruturas metálicas em substratos dielétricos 16-19. Neste artigo, apresentamos toda a seqüência de etapas do processo envolvendo substratos SERS fabricação por EBL, bio-funcionalização dos substratos, e recolha dos espectros de Raman. Três projetos exploradas em nossos trabalhos recentes 18,19 são abordados (ver Figuras 3 e 4, e Tabela 1). No desenho 1, proteína A recombinante é imobilizado em bio-Au funcionalizado em nanoestruturas de sílica fundida (FS) de suporte 18, e detecção SERS da proteína é demonstrada. No desenho 2, proteína recombinante 21,26,27 com e sem o ligando (D-glicose) de ligação da glicose é imobilizado por meio de etiquetas de histidina em espaços entre nanoestruturas de Ag sobre FS Ni-revestidos, e a ligação da glicose com a proteína é detectado. In Design 3, tiolado DN de ligação da dopaminaUm aptâmero 19,23 Au é imobilizado sobre nanoestruturas de FS, e a ligação da dopamina pelo aptâmero imobilizado é demonstrado. Inclusive de todas as etapas experimentais relevantes, desde a preparação do substrato para obtenção dos espectros Raman, e representativas de diferentes biomoléculas e estratégias de imobilização, estes exemplos são úteis para uma ampla variedade de aplicações, desde a pesquisa exploração interrogando interfaces de nano-biológico por SERS para o desenvolvimento da SERS biossensores de pequenas moléculas que empregam em proteínas ou obrigatório como um método de reconhecimento aptamer-ligando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" /> Figura 3. Esquemas de três desenhos representativos utilizando diferentes biomoléculas, os métodos de imobilizaçãoção, e materiais de substrato: (A) de proteína A imobilizada sobre os metais nobres nano-funcionalizados pontos por uma monocamada auto-montada (SAM) de ácido 11-mercaptodecanoic (MUA) em água Dl; (B) proteína de ligação marcado glicose-histidina (GBP) complexado com D-glucose imobilizado sobre a superfície do substrato de metal nobre entre nano-pontos; (C) tiol terminada a ligação da dopamina aptamer concluída com a dopamina (DBA) imobilizada em metais nobres nano-pontos. Ver mais detalhes na Tabela 1. In Design 2 ilustrado por painel (B), uma amostra sem o ligando correspondente também foi preparado para comparação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" /> Figura 4.Biomoléculas empregues em três modelos: (A) de proteína A; (B) proteína de ligação da glicose e D-glicose; (C) ligação de DNA e aptâmero dopamina dopamina. As estruturas de proteínas terciárias em (a) e (b) são tomados a partir de Protein Data Bank, PDB ID 1BDD 20 e 2HPH 21, respectivamente, e desenhada com VMD para LINUXAMD64, versão 1.9.1 22. A estrutura secundária aptâmero em (c), está prevista a partir da sequência de 23 utilizando o software e ValFold 24 desenhada com PseudoViewer 3.0 25. As letras G, A, T, C e correspondem a guanina, adenina, timina, citosina e nucleotídeos, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Projeto 1 </td&gt; <td> Projeto 2 </td><td> Projeto 3 </td></tr><tr><td> Biopolímero </td><td> Proteína A </td><td> Proteína de ligação da glicose (GBP) </td><td> Aptamer ligação da dopamina (DBA) </td></tr><tr><td> Encadernador </td><td> Ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) monocamada auto-montados (SAM) </td><td> Tags de histidina </td><td> Ligantes Tiol </td></tr><tr><td> Ligand </td><td> Nenhum </td><td> D-glicose </td><td> Dopamina </td></tr><tr><td> Solução </td><td> Deionizada (DI) de água </td><td> Tampão fosfato de potássio </td><td> Tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) e tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); Salina tamponada com fosfato (PBS) </td></tr><tr><td> Substrato </td><td> Au estruturas na FS </td><td> Ag estruturas em Ni-revestido FS </td><td> Au estruturas na FS </td></tr><tr><td> Ar modeladoeA </td><td> 4 mm x 10 mm </td><td> 4 mm x 8 mm </td><td> 4 mm x 10 mm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Padrão </td><td rowspan="3"> Au pontos, 50 nm campo </td><td> Dots AG, 40 nm campo </td><td> Hexágonos Au, pitch 200 nm </td></tr><tr><td> Hexágonos Ag, pitch 200 nm </td><td> Au almofadas não estruturados </td></tr><tr><td> Ag almofadas não estruturados </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> Doses de exposição EBL </td><td> Dots: </td><td> Dots: 105 uC / cm 2 </td><td rowspan="4"> Hexagons: 180 uC / cm 2 </td></tr><tr><td> Matriz I 120 mC / cm2 </td><td> Hexagons: 170 uC / cm 2 </td></tr><tr><td> Matriz II 96 uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Matriz III 72mC / cm2 </td><td></td></tr><tr><td> Comprimento de onda de excitação laser </td><td> 532 nm </td><td> 532 nm </td><td> 780 nm </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Três projectos dos sistemas de nano-biológico.

<table><tbody><tr><td>Ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>450561&amp;nbsp; ALDRICH</td><td>Utilizado para funcionalização da superfície no Design 1</td></tr><tr><td>Polímero condutor</td><td><a href="http://www.mrc.co.jp" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mitsubishi Rayon</a></td><td>aquaSAVE-57xs</td><td>Uma camada com espessura de 70 nm é utilizada como revestimento antiacúmulo de carga para exposições de litografia por feixe de elétrons (EBL)</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Laboratório Colaborador</td><td></td><td>Ligante no Design 2</td></tr><tr><td>Dopamina</td><td>Laboratório Colaborador</td><td></td><td>Ligante no Design 3</td></tr><tr><td>Aptâmero de ligação à dopamina (DBA)</td><td><a href="http://www.idtdna.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integrated DNA Technologies Inc.</a></td><td>5'- /Modificador Tiol C6 S-S/&amp;nbsp;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'&amp;nbsp;</td><td>Biopolímero no Design 3</td></tr><tr><td>Placas de sílica fundida</td><td><a href="http://www.markoptics.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mark Optics&lt;br/&gt;</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína ligadora de glicose (GBP)</td><td><a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Laboratório Colaborador</a></td><td>&lt;a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532"&gt;PDB ID 2HPH&lt;/a&gt;</td><td>Biomacromolécula no Design 2</td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo</td><td><a href="http://www.dowcorning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Dow Corning</a></td><td></td><td>Usado para selar câmara à prova d'água</td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio 30%, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Usado para a solução de piranha</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-etil-&lt;em&gt;N'&lt;/em&gt;-(3-(dimetilamino)propil)carbodiimida (EDC)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>03450 FLUKA</td><td>Utilizado para a imobilização do biopolímero no Design 1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Hidroxissuccinimida (NHS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>130672 ALDRICH</td><td>Utilizado para a imobilização do biopolímero no Design 1</td></tr><tr><td>Tampão de fosfato de potássio</td><td>Laboratório Colaborador</td><td></td><td>Tampão utilizado na amostragem por Raman</td></tr><tr><td>tampão fosfato&amp;nbsp; salina (PBS)</td><td>Laboratório Colaborador</td><td></td><td>Solvente no Design 3</td></tr><tr><td>Polimetilmetacrilato (PMMA) 950 A2</td><td><a href="http://www.microchem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MicroChem&amp;nbsp;</a></td><td></td><td>Uma camada de 90 nm de espessura é utilizada como resistente de tom positivo em litografia por feixe de elétrons</td></tr><tr><td>Proteína A recombinante</td><td><a href="http://www.proteinmods.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Protein Mods Inc</a></td><td>&lt;a href="http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd"&gt;PDB ID 1BDD&lt;/a&gt;</td><td>Biomacromolécula no Design 1</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 96%, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Usado para a solução de piranha</td></tr><tr><td>Tampão de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) e ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>T9285 SIGMA</td><td>Tampão no Design 3
&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipamento&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Nome&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Empresa&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Número do Catálogo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comentários&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td>Serra de corte</td><td>Diamond Touch Technology Inc.&lt;br /&gt;(17301 W Colfax Ave #&amp;nbsp;152, Golden, CO</td><td></td><td>Utilizado para cortar pastilhas de FS</td></tr><tr><td>Evaporador por feixe de elétrons</td><td><a href="http://www.lesker.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Kurt J. Lesker</a></td><td></td><td>Utilizado para a evaporação de Au e Ag</td></tr><tr><td>Evaporador por feixe de elétrons</td><td><a href="http://www.ultrahivac.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Johnsen Ultravac (JUV)</a></td><td>JuV E-gun</td><td>Utilizado para a evaporação de Ni</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio (25 mm)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>12-545-102</td><td>Utilizado em câmara à prova d'água</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio (3&amp;times;1 pol.</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td></td><td>Utilizado em câmara à prova d'água</td></tr><tr><td>Raith 150&lt;sup&gt;DOIS&lt;/sup&gt; Sistema de exposição à EBL</td><td><a href="http://www.raith.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Raith Inc.</a></td><td>Raith 150&lt;sup&gt;DOIS&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; sistema</td><td>Utilizado para exposições de EBL</td></tr><tr><td>microscópio Raman</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>Nicolet Almega XR</td><td>Utilizado para espectroscopia Raman</td></tr><tr><td>Sistema de sonicação</td><td><a href="http://www.bransonic.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Branson</a></td><td></td><td>Usado para descolagem e mistura de soluções</td></tr><tr><td>Spinador</td><td><a href="http://www.brewerscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Batedor magnético com aquecimento e placa aquecedora</a></td><td>Cee 200X e Cee 1300X</td><td>Usado para fazer a deposição por centrifugação de PMMA e polímero condutor</td></tr></tbody></table>

superfície reforçada raman detection espectroscopia de biomoléculas usando ebl fabricadas nanoestruturados substratos

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Fabricação e caracterização de nano-conjugadas biológica sistemas de interface nanoestruturas metálicas em suportes sólidos com biomoléculas imobilizadas é relatado. Toda a sequência de passos experimentais relevantes é descrito, envolvendo a fabricação dos substratos nanoestruturados utilizando litografia por feixe de elétrons, a imobilização de biomoléculas sobre os substratos, e sua caracterização utilizando superfície melhorada espectroscopia Raman (SERS). Três modelos diferentes de sistemas de nano-biológico são empregues, incluindo a proteína A, proteína de ligação a glicose, e um aptâmero de ligação ao ADN de dopamina. Nos dois últimos casos, a ligação de ligandos respectivos, D-glucose e da dopamina, também está incluída. Os três tipos de biomoléculas são imobilizados em substratos nanoestruturados por métodos diferentes, e os resultados de imagiologia SERS são relatados. As capacidades de SERS para detectar modos de vibração a partir de proteínas de superfície imobilizada, bem como para capturar a uma proteína-ligandod aptâmero-ligando de ligação são demonstradas. Os resultados ilustram também a influência da geometria da superfície de nanoestrutura, biomoléculas estratégia de imobilização, actividade Raman das moléculas e a presença ou ausência da ligação sobre os espectros de SERS adquirida ligando.

Recolha de controlo espectros de Raman para os principais componentes, incluindo as proteínas livres em solução e ligandos livres em solução ou em forma de pó sem o uso de substratos contendo metal, é importante para permitir uma comparação adequada, bem como para fins de interpretação. A Figura 5A apresenta uma Raman típico espectro para a proteína livre Um em água DI numa lâmina de vidro sem substratos nanoestruturados. Duas bandas com maior intensidade Raman, a banda em 2931 centímetros -1 e em 1,091 centímetros -1, correspondem às vibrações que envolvem ligações CH e CS, respectivamente. Outras bandas com uma menor intensidade de Raman tal como 563 centímetros -1, 1450 centímetros -1, -1 e 1,653 centímetros 2,426 centímetro -1, pode ser atribuída a uma sobreposição de modos de vibração 18,32,33,34. Os espectros de Raman de controlo para o GPB ligando livre em solução tampão com três concentrações diferentes, 0,3, 0,9 e 1,3 mM, estão apresentados na Figura 5B. Em t<html> ele figura, a banda larga de cerca de 3.400 cm-1 corresponde ao solvente 35, enquanto que a banda a 2935 centímetros -1 representa vibrações envolvendo ligações CH da proteína 32,33. A Figura 5C mostra o comprimento de onda elevado espectro de Raman para a D-glucose em solução tampão para diferentes concentrações: 1, 6, 100, 200 e 400 mm. Quando a concentração de glucose é aumentada, as bandas de vibração ligações CH surgir em 2890 centímetros -1 e 2960 centímetros -1. Os espectros de Raman de controlo de dopamina na forma de cristais obtidos com ambos os 532 nm e os comprimentos de onda de excitação de 780 nm são apresentados na Figura 5D. Grande parte do espectro de Raman vem do anel benzeno flexão e estiramentos CH ligação das moléculas de 19,36. Algumas das bandas a cerca de 3000 cm-1 só são observadas no 532 nm, mas não 780 nm de comprimento de onda de excitação. pload / 52712 / 52712fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Espectro de Raman de controle de proteína A em água desionizada obtida a 532 nm de comprimento de onda de excitação 18 (A); Os espectros de Raman da proteína de ligação da glicose livre de ligando em solução tampão obtida a 532 nm de comprimento de onda de excitação (B); Os espectros de Raman de D-glicose em solução tampão obtida a 532 nm de comprimento de onda de excitação (C); e espectros de dopamina em pó obtido a 532 nm e 780 nm comprimento de onda de excitação 19 (D). Todos os espectros são espectros de Raman regular de soluções (a, b, c) e pó (d) em lâminas de vidro, sem substratos nanoestruturados. In (D), a atribuição de Raman regimes de turnos para várias vibrações moleculares foi feito usando General Atomic e Eletrônica Molecular Sistema Estrutura (GAMESS) 30 e 31 de MacMolPlt software conforme detalhado em outro lugar 19. Reproduzido painel (a) com a permissão de 18 Americuma sociedade da Vacuum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A fim de obter espectros de SERS de biomoléculas imobilizadas de superfície, os substratos que compreendem nanoestruturas metálicas em suportes de sílica fundida são fabricados como descrito nas etapas 1-3. A qualidade de substratos fabricados é monitorado através de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os procedimentos padrão SEM são descritos em outros lugares 16,17,18, 19 e não incluídos no presente protocolo. A Figura 6 mostra imagens SEM representativas de Au e Ag nano-pontos e nano-hexágono como estruturas (painéis ad), bem como não -structured Au e Ag pads (painéis E e F, respectivamente). Os próximos passos envolvem a imobilização de material biológico nas substratos nanoestruturados que empregam três desenhos listados na Tabela 1, e os seus espectros de aquisição de SERS. Em o<html> rder para manter um ambiente aquoso durante Raman de imagem, cada uma das amostras é colocado no seu solução correspondente (ver Tabela 1), tampado com uma tampa de vidro fina, e selado conforme ilustrado na Figura 7. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" /> Figura 6. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) imagens de 10 grossas Au e Ag nanoestruturas de superfície nm utilizados como substratos SERS: (A, B) matrizes de nanopontos; (C, D) matrizes de nano-hexágonos; (E, F) almofadas não estruturados. Substratos com Au estruturas (à esquerda) empregam apoios FS, enquanto substratos com estruturas AG (direita) usar um revestimento Ni grosso nm 10 no FS. As imagens foram obtidas como descrito em outro lugar 16,17,18.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" /> Figura 7. Esquema de câmara à prova de água para Raman imagens de amostras bio-funcionalizada em solução. No desenho 1, proteína A recombinante é imobilizado sobre os substratos funcionalizados por uma monocamada auto-montada, de 11-mercaptodecanoic ácido (MUA) em água Dl 18. Os substratos neste projeto compreende três matrizes de Au pontos com um arremesso de nm 50 e distâncias variadas inter-ponto sobre sílica fundida (ver Figuras 6A e 8). O processo de imobilização de proteínas começa com a formação de um SAM sobre os substratos. Para obter a ligação entre SAM e a proteína covalente, os grupos ácido carboxílico do SAM são transformados em amina reactivo NHS-éster por tratamento com uma mistura de N </em&gt;-etil-N &#39;- (3- (dimetilamino) propil) carbodiimida (EDC), solução de N-hidroxissuccinimida (NHS) em água desionizada e solução. A imobilização de proteína A ocorre por deslocamento do grupo NHS por resíduos de lisina da proteína 37. Um exemplo de amostras de imagem de desenho 1 com a proteína A imobilizada sobre nanoestruturas de Au é mostrado na Figura 9. A Figura 9A apresenta uma imagem de microscópio óptico das amostras, que compreendem três matrizes de bio-funcionalizado Au nanopontos com diferentes intervalos inter-ponto (ver 3aa e também as Figuras 8), e a Figura 9B mostra o mapeamento espectral de Raman ao longo destas matrizes. Pode ver-se que as maiores intensidades de Raman são encontrados Array I, em que as lacunas entre os pontos são mais reduzida, enquanto que intensidades mais baixas são obtidas por matriz III com as maiores diferenças inter-dot. Isto pode ser explicado por um efeito de acoplamento de plasmon mais forte produzida pela maior fie elétricolds em espaços estreitos entre os pontos 18. A Figura 9C mostra os espectros de SERS mais forte obtido por matrizes I e II. Os espectros apresentam várias bandas (1630 centímetros -1, -1 1964 centímetros, 2280 centímetros -1, 2.577 centímetros -1, e 2916 centímetros -1) em proximidade com os modos de Raman de proteína livre A em solução visto na Figura 5A. Atribuível a vibrações de vários títulos encontrados nas proteínas, essas bandas quer aparecer em locais semelhantes em ambos proteína imobilizada e em solução, ou são ligeiramente deslocado para números de onda um pouco maiores quando imobilizado. Em contraste, os espectros SERS de substratos nanoestruturados semelhantes funcionalizado por MUA SAM sem a proteína mostram um padrão completamente diferente de 18, o que confirma que a Figura 9 representa mapeamento SERS de imobilizado na superfície da proteína A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma</a><html> versão maior desta figura. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" /> Figura 8. Imagens em SEM das três matrizes de Au nanopontos sobre substrato FS usados ​​em Design 1 18. As matrizes têm a mesma altura de 50 nm e um pouco raios ponto diferente, resultando em diferentes larguras de lacunas inter-ponto. Isto é conseguido através da aplicação de diferentes doses de exposição EBL para produzir máscaras de PMMA para as três matrizes (ver Tabela 1). Doses de exposição mais altos resultam em buracos mais largos em máscaras de PMMA, permitindo maiores tamanhos de ponto Au após metalização e decolagem. Reproduzido com permissão de 18 Vacuum Sociedade Americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9. SERS imagem de imobilizada-substrato proteína A em Design 1 18. Imagem de microscópio óptico da amostra (A), composta por três matrizes de Au nanopontos com passo de 50 nm e diferentes intervalos inter-ponto sobre um substrato de sílica fundida (ver também A Figura 6), o bio-funcionalizado como mostrado na Figura 3A. (B) Mapeamento de Raman da amostra. (C) a partir de espectros de SERS de matriz de pontos I e II. No painel (B), o eixo vertical representa a distância entre o substrato, o eixo horizontal representa o desvio de Raman, e a barra de legenda indica as intensidades Raman. Linhas em painéis (B) e (C) representam bandas Raman referência de proteína livre Um em solução e (*) no painel vertical tracejada (C) indica bandas SERS de Matriz I. O Raman espectros foram obtidos 532 nm de excitaçãocomprimento de onda. Reproduzido com permissão de 18 Vacuum Sociedade Americana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Em Design 2, a proteína recombinante de ligação da glicose (GBP) 21 complexado com D-glucose (ligando) é imobilizada sobre os substratos apropriados em solução tampão de fosfato de potássio. As amostras com imobilizada GBP sem ligando também são preparados para comparação. Neste design, a proteína de ligação a glicose está ligado à superfície por meio de um marcador de histidina, que se liga bem a Ni, mas não para metais nobres 6. Uma vez que os substratos compreendem matrizes de Ag nano-pontos, nano-hexágonos, e almofadas Ag não estruturados em FS Ni-revestidas (Figuras 6B, 6D, 6F e, respectivamente), pode-se esperar mais de moléculas de proteínas imobilizadas para ser localizado em lacunas entre Ag nanoestruturas onde revestimento Ni é avdisponív eis. Os espectros de Raman obtido para imobilizada livre de glucose e GBP ligados a glucose são apresentados nas Figuras 10A e 10B, respectivamente. Todos estes exibem espectros de uma banda larga em 3.300 cm-1, que corresponde à solução-tampão 35. Os espectros obtidos com uma almofada Ag desestruturado conter apenas esta única banda e não mostram quaisquer modos de vibração de proteínas, o que confirma que a proteína imobilizada não é encontrado na superfície de Ag como esperado. Em contraste, o espectro obtido com matrizes de Ag nano-pontos e apresentam bandas de nano-hexágonos cerca de 1,550 centímetros -1 e 2,900 centímetros -1, que representam o analito 32,33. Em particular, a banda larga a cerca de 1,550 centímetros -1, conhecida como a banda de amida II, é atribuível ao péptido ligações vibrações em proteínas 33,34. No caso considerado, esta faixa representa uma superposição dos modos de vibração de GBP imobilizados na superfície Ni entre característica Ags, e é indicativo de reforço SERS destes modos na vizinhança de nanoestruturas de metal nobre quando os substratos que contêm nano-pontos ou nano-hexágonos são utilizados. Esta banda é muito fraca para a proteína em solução, na ausência de realce SERS (Figura 5B) e ausente em almofadas Ag sem Ni superfície disponível para a ligação à proteína, mas é bem pronunciado para substratos nanoestruturados com alguma superfície Ni acessíveis para a proteína se liguem. No entanto, ainda mais importante para o presente estudo são os outros, faixas estreitas em torno de aproximadamente 2900 centímetros -1 que pode ser atribuído à CH vínculo wibrations 32,33. O espectro de GBP sem glicose mostra uma banda acentuada a 2933 centímetros -1 com o substrato nano-pontos, e uma banda fraca, mas visível no comprimento de onda semelhante com o substrato nano-hexágonos (Figura 10A). Diferentemente do caso de proteína livre de glicose, os espectros SERS de GBP ligada à glicose mostrado na Figu<html> re 10B exibem duas bandas correspondentes a CH regimes títulos vibrações, em 2850 centímetros -1 e 2.910 centímetros -1. As bandas são bem pronunciada no espectro de GBP ligado a glicose no substrato nano-hexágonos, e eles também podem ser vistos no espectro de GBP em substrato nano-pontos. A banda em 2.850 centímetros -1 é razoavelmente perto dos 2890 centímetros -1 no espectro de um controlo de Raman a partir de D-glucose em solução, e, portanto, pode ser atribuída à glicose, ligado à proteína, enquanto que a outra banda (em 2,910 centímetro -1) é atribuível a vibrações das ligações CH, tanto da proteína e glicose. Pode-se concluir que a diferença de assinaturas SERS de livre de glicose e glucose-bound imobilizada-substrato GBP é observável na região, e as vibrações ligação CH de glicose ligada a proteínas são detectáveis ​​empregando o projeto descrito. 10.jpg &quot;/&gt; Figura 10. espectros SERS de (A) sem ligando e (B) proteína de ligação de glicose ligada ao ligando imobilizado em três diferentes substratos em Design 2. Os espectros foram obtidos com 780 nm de comprimento de onda de excitação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> No desenho 3, o aptâmero de ligação da dopamina personalizado (DBA) com terminação de tiol 23 está imobilizado sobre o substrato em tampão tris (hidroximetil) aminometano (TRIS), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), solução tampão, e a dopamina é então ligado para o aptâmero 19 imobilizada. Os substratos para este projeto contém matrizes de Au nano-hexágonos sobre FS (Figura 6C). Não estruturados Au pads (Figura 6E) também são utilizados para fins de controle. Uma vez que o ADN é intrinsecamente fluorescente 38, 780 nm de excitação waveleng<html> th é utilizado em Design 3 para reduzir este factor. Nesta concepção, o elemento de reconhecimento (aptâmero) não é activo em Raman a região de Raman turnos considerados na Figura 11, enquanto que a dopamina mostra uma actividade significativa de Raman nesta região. Como o sinal a partir de amostras expostas a apenas a dopamina sem aptâmero imobilizado não apresenta bandas de dopamina resultantes 19, as bandas observadas SERS Espera-se que originam a partir da dopamina ligado a aptâmero. A Figura 11 compara os espectros de SERS de aptâmero imobilizado sobre nanoestruturas de ouro antes e após a adição de dopamina. Como esperado, imobilizada aptamer livre de dopamina não apresentam bandas Raman. Em contraste, um número de bandas de Raman pronunciados são observados durante ligados a dopamina aptâmero imobilizada. As posições da maioria das bandas na Figura 11 estão próximos aos de dopamina cristalino, embora com diferenças de amplitudes. igura 11 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg &quot;/&gt; Figura 11. espectros SERS de livre-ligante (linha roxa) e ligado ao ligando (linha azul) aptamer imobilizada em Au substratos nano-hexágono em Design de ligação da dopamina 3 19. A linha vermelha mostra um espectro de controle SERS de dopamina em pó. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos a fabricação e caracterização de sistemas nanobiológicos fazendo interface com substratos nanoestruturados com proteínas imobilizadas e aptâmeros. As etapas experimentais relevantes envolvendo a fabricação litográfica de substratos nanoestruturados, biofuncionalização e caracterização de espectroscopia Raman aprimorada por superfície (SERS) são relatadas. A detecção SERS de proteínas imobilizadas na superfície e a sondagem da ligação proteína-ligante e aptâmero-ligante são demonstradas.

Superfície reforçada Raman Detection Espectroscopia de Biomoléculas Usando EBL Fabricadas Nanoestruturados Substratos

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

O objetivo geral do presente experimento a seguir é fabricar e caracterizar sistemas nanobiológicos conjugados fazendo a interface de substratos sólidos nanoestruturados com biomoléculas imobilizadas. Isso é conseguido utilizando litografia de feixe de elétrons de ultra alta resolução ou EBL para obter matrizes de minúsculas nanoestruturas metálicas em suportes de sílica fundida. Como segunda etapa, os substratos são colocados em solução e as biomoléculas são imobilizadas em suas superfícies, produzindo as interfaces nanobiológicas.Em seguida, a espectroscopia de ramen aprimorada de superfície ou SIRS é empregada para sondar as moléculas biológicas nas interfaces. Os espectros sir resultantes exibem a característica do modo ramen das moléculas particulares com intensidades fortemente dependentes do design do substrato. A principal vantagem de nossa abordagem sobre as técnicas existentes, como a espectroscopia de infravermelho, é que a sensibilidade pode ser muito aprimorada devido ao plasma de superfície e à ressonância dentro das nanoestruturas metálicas.Nossa abordagem cria superfícies altamente seletivas que podem ser prontamente controladas usando a combinação de funcionalização molecular e litografia por feixe de elétrons. Este método pode responder a questões-chave em vários campos, desde pesquisa de exploração em biologia estrutural ou serviços mobilizados por polímeros até o desenvolvimento de vários dispositivos envolvendo interfaces nanobiológicas. Esses métodos podem fornecer na ciência as propriedades estruturais das biomoléculas com implicações que se estendem ao diagnóstico médico ou detecção ambiental.Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois envolve aspectos de nanofabricação, funcionalização de superfície, bioquímica e espectroscopia, que tradicionalmente não estão relacionados Para iniciar a rotação do polimetilmetacrilato ou PMMA, resista e camadas condutoras nos substratos. Para conseguir isso, use um girador de wafer com um mandril a vácuo e coloque as amostras individualmente no centro do mandril. Coloque uma gota de PMMA resist no centro das amostras usando uma pipeta de vidro.Em seguida, gire a 3.500 RPM por 60 segundos com um tempo de aceleração de dois segundos. Em seguida, asse os substratos a 180 graus Celsius por três a cinco minutos após assar os substratos, resfrie as amostras à temperatura ambiente com os substratos resfriados e retorne ao mandril giratório. Espalhe uma gota de polímero condutor no substrato.Gire o substrato por 40 segundos a 3000 RPM com uma rampa de dois segundos após a rotação. Asse as amostras a 80 graus Celsius por um minuto após realizar a litografia por feixe de elétrons ou exposição EBL conforme descrito no protocolo de texto, prepare um béquer com a água ionizada para remover o polímero condutor. Em seguida, prepare um segundo copo com uma mistura de revelador e mexa por cinco minutos, defina a temperatura ambiente.Por fim, preparar o isopropanol num terceiro copo como agente de enxaguamento com uma pinça. Coloque as amostras na água por três segundos para remover o filme de polímero condutor. Em seguida, coloque a amostra no revelador e mova a pinça lentamente para cima e para baixo por 20 segundos, transfira imediatamente os substratos para o isopropanol e enxágue por mais 10 segundos antes de secar a amostra com nitrogênio, carregue as amostras de cabeça para baixo no sistema evaporador de feixe de elétrons para permitir que o metal evaporado seja depositado na face frontal das amostras.Deposite uma camada de ouro de 10 nanômetros de espessura nas amostras para os desenhos um e três e uma camada de prata de 10 nanômetros de espessura para o projeto. Dois a uma taxa de aproximadamente 0,1 nanômetros por segundo. Em seguida, encha um sistema de sonicação até a altura recomendada com água e encha um béquer separado com acetona.Coloque uma amostra virada para cima na parte inferior do copo e deixe-a de molho por 10 minutos segurando o copo. Coloque-o no banho-maria e deixe a altura da acetona corresponder à altura da água. Em seguida, ligue o sistema de sonicação.Permita que a sonicação ocorra por até 60 segundos. Para preparar primeiro as amostras de projeto, prepare uma solução milimolar de MUA e etanol à temperatura ambiente e sonice por 10 minutos. Mergulhe o substrato nanoestruturado adequado na solução de MUA por 48 horas.Em seguida, enxágue a amostra com etanol três vezes e seque por cinco minutos. Defina a temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma solução 75 milimolar de EDC e água destilada.Prepare também uma solução de 15 milimolares de NHS em água destilada usando um depósito de micropipeta, 100 microlitros de NHS sobre o ouro no substrato e adicione imediatamente 100 microlitros de EDC na mesma área. Incube por um minuto para ativar a monocamada auto-montada de MUA. Em seguida, coloque uma gota de 100 microlitros de proteína, uma solução na mesma área do substrato.Coloque a amostra em um compartimento de uma placa de Petri com um mililitro de água destilada em outro compartimento. Feche a placa de Petri com uma tampa e armazene a amostra por 24 horas a cinco graus Celsius. Em seguida, enxágue a amostra em água destilada três vezes, continuamente as amostras em copos separados por 20 segundos em cada copo, não deixe as amostras secarem após o enxágue ou durante o enxágue para o projeto de duas amostras.Prepare uma solução 0,9 milimolar de proteína de ligação à glicose ou GBP em tampão fosfato de potássio. Preparar também uma solução de glicose DG a 100 milimolares no tampão. Em seguida, misture 30 microlitros da solução de glicose D e 30 microlitros da solução de GBP.Usando um recipiente de microtubo de plástico de um mililitro e uma micropipeta, incube por 30 minutos e, em seguida, deposite 20 microlitros da solução de GBP livre de ligante e 20 microlitros da solução de GBP ligada ao ligante nos substratos preparados. Usando uma micropipeta, armazene as amostras a cinco graus Celsius por 24 horas em uma placa de Petri com tampa selada. Enxágue as amostras três vezes na solução tampão de fosfato de potássio à temperatura ambiente Para preparar.Projete três amostras diluindo a solução de APRE ou DBA de ligação à dopamina até uma concentração de um micromolar. Usando o tampão tris EDTA com um pH final de 7,4, prepare uma solução de dopamina para uma concentração de cinco micromolares medindo o pó de dopamina em uma balança analítica e misturando-o na solução salina tamponada com fosfato ou PBS com uma esfera de agitação por cinco minutos. Em seguida, deposite uma gota de 20 microlitros da solução de DBA na superfície de cada substrato e deixe a amostra descansar por uma hora em temperatura ambiente com uma tampa sobre a placa de Petri.Depois de enxaguar as amostras três vezes em um tampão de fosfato de potássio, coloque as amostras na vertical em cima de um lenço de limpeza para secar a parte de trás, mantendo um filme na parte frontal do substrato. Reserve uma amostra como controle. Em seguida, coloque uma gota de cinco microlitros da solução de dopamina na superfície do PBS existente.Solte as amostras restantes. Incubar as amostras durante 10 minutos antes de as enxaguar três vezes na solução tampão fosfato de potássio. Para realizar espectroscopia de ramen.Coloque cada amostra em uma câmara à prova d'água para evitar a evaporação por exposição ao laser. Encha uma seringa de plástico com graxa de alto vácuo quimicamente inerte. Em seguida, coloque as amostras em lâminas de vidro e dispense alguns milímetros de graxa ao redor das amostras sem tocar nas amostras.Coloque uma lamínula de microscópio em cima dos substratos. Pressione suavemente para formar uma vedação, criando uma fina interface líquida entre os substratos e as lamínulas sem permitir que o tampão entre em contato com a graxa a vácuo. Usando um sistema de microscópio Raman óptico, obtenha um foco na superfície da região do padrão nano de metal a ser amostrada sem ligar o laser.Execute a amostragem Raman conforme descrito no protocolo de texto mostrado. Aqui estão as matrizes de pontos de nano padrão de níquel de ouro e prata em sílica fundida. O uso de litografia por feixe de elétrons ou EBL permite excelente posição e dimensão.O tamanho do ponto de controle e a largura da lacuna são controlados pela exposição EBL. Matrizes hexagonais de dose de extremidade de ouro de níquel prateado são exibidas aqui. O comportamento de nucleação de tais camadas metálicas muito finas resulta em estruturas descontínuas.Aqui está o espectro da série da proteína A imobilizada por substrato no projeto: uma intensidade de sinal da matriz um é muito mais forte do que da matriz dois. O sinal da matriz três era muito fraco. O espaçamento entre lacunas é claramente um parâmetro crítico para o desacoplamento do plasma e o aprimoramento da superfície do espalhamento de ramen exibido.Aqui estão os espectros da proteína de ligação à glicose mostrando os efeitos de diferentes designs de substrato no estado livre e ligado ao ligante. Finalmente, os espectros s do aptâmero de ligação à dopamina são mostrados para moléculas livres de ligantes e ligadas a ligantes. Um espectro de dopamina em pó é mostrado para referência.Ao tentar este procedimento, é importante evitar a contaminação dos substratos. Como uma técnica de espectroscopia é altamente sensível e você pode ter leituras falsas Empregando este procedimento. Podem ser identificados desenhos óptimos de substrato de origem para analitos específicos.Em seguida, outros métodos nphy, como phy não impresso, podem ser executados para melhorar a escalabilidade da fabricação do substrato após seu desenvolvimento. Essa técnica ajudou os pesquisadores no campo da bioquímica e biossensoriamento a detectar moléculas biológicas sem certas superfícies em quantidades muito pequenas, permanecendo em solução. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como controlar o tamanho da nanoestrutura do metal e as propriedades do filme usando técnicas de fabricação e como explorar diferentes estratégias de reconhecimento biomolecular para atingir diferentes analitos.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

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Superfície reforçada Raman Detection Espectroscopia de Biomoléculas Usando EBL Fabricadas Nanoestruturados Substratos

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