Superfície reforçada Raman Detection Espectroscopia de Biomoléculas Usando EBL Fabricadas Nanoestruturados Substratos

O objetivo geral do presente experimento a seguir é fabricar e caracterizar sistemas nanobiológicos conjugados fazendo a interface de substratos sólidos nanoestruturados com biomoléculas imobilizadas. Isso é conseguido utilizando litografia de feixe de elétrons de ultra alta resolução ou EBL para obter matrizes de minúsculas nanoestruturas metálicas em suportes de sílica fundida. Como segunda etapa, os substratos são colocados em solução e as biomoléculas são imobilizadas em suas superfícies, produzindo as interfaces nanobiológicas.

Em seguida, a espectroscopia de ramen aprimorada de superfície ou SIRS é empregada para sondar as moléculas biológicas nas interfaces. Os espectros sir resultantes exibem a característica do modo ramen das moléculas particulares com intensidades fortemente dependentes do design do substrato. A principal vantagem de nossa abordagem sobre as técnicas existentes, como a espectroscopia de infravermelho, é que a sensibilidade pode ser muito aprimorada devido ao plasma de superfície e à ressonância dentro das nanoestruturas metálicas.

Nossa abordagem cria superfícies altamente seletivas que podem ser prontamente controladas usando a combinação de funcionalização molecular e litografia por feixe de elétrons. Este método pode responder a questões-chave em vários campos, desde pesquisa de exploração em biologia estrutural ou serviços mobilizados por polímeros até o desenvolvimento de vários dispositivos envolvendo interfaces nanobiológicas. Esses métodos podem fornecer na ciência as propriedades estruturais das biomoléculas com implicações que se estendem ao diagnóstico médico ou detecção ambiental.

Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois envolve aspectos de nanofabricação, funcionalização de superfície, bioquímica e espectroscopia, que tradicionalmente não estão relacionados Para iniciar a rotação do polimetilmetacrilato ou PMMA, resista e camadas condutoras nos substratos. Para conseguir isso, use um girador de wafer com um mandril a vácuo e coloque as amostras individualmente no centro do mandril. Coloque uma gota de PMMA resist no centro das amostras usando uma pipeta de vidro.

Em seguida, gire a 3.500 RPM por 60 segundos com um tempo de aceleração de dois segundos. Em seguida, asse os substratos a 180 graus Celsius por três a cinco minutos após assar os substratos, resfrie as amostras à temperatura ambiente com os substratos resfriados e retorne ao mandril giratório. Espalhe uma gota de polímero condutor no substrato.

Gire o substrato por 40 segundos a 3000 RPM com uma rampa de dois segundos após a rotação. Asse as amostras a 80 graus Celsius por um minuto após realizar a litografia por feixe de elétrons ou exposição EBL conforme descrito no protocolo de texto, prepare um béquer com a água ionizada para remover o polímero condutor. Em seguida, prepare um segundo copo com uma mistura de revelador e mexa por cinco minutos, defina a temperatura ambiente.

Por fim, preparar o isopropanol num terceiro copo como agente de enxaguamento com uma pinça. Coloque as amostras na água por três segundos para remover o filme de polímero condutor. Em seguida, coloque a amostra no revelador e mova a pinça lentamente para cima e para baixo por 20 segundos, transfira imediatamente os substratos para o isopropanol e enxágue por mais 10 segundos antes de secar a amostra com nitrogênio, carregue as amostras de cabeça para baixo no sistema evaporador de feixe de elétrons para permitir que o metal evaporado seja depositado na face frontal das amostras.

Deposite uma camada de ouro de 10 nanômetros de espessura nas amostras para os desenhos um e três e uma camada de prata de 10 nanômetros de espessura para o projeto. Dois a uma taxa de aproximadamente 0,1 nanômetros por segundo. Em seguida, encha um sistema de sonicação até a altura recomendada com água e encha um béquer separado com acetona.

Coloque uma amostra virada para cima na parte inferior do copo e deixe-a de molho por 10 minutos segurando o copo. Coloque-o no banho-maria e deixe a altura da acetona corresponder à altura da água. Em seguida, ligue o sistema de sonicação.

Permita que a sonicação ocorra por até 60 segundos. Para preparar primeiro as amostras de projeto, prepare uma solução milimolar de MUA e etanol à temperatura ambiente e sonice por 10 minutos. Mergulhe o substrato nanoestruturado adequado na solução de MUA por 48 horas.

Em seguida, enxágue a amostra com etanol três vezes e seque por cinco minutos. Defina a temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma solução 75 milimolar de EDC e água destilada.

Prepare também uma solução de 15 milimolares de NHS em água destilada usando um depósito de micropipeta, 100 microlitros de NHS sobre o ouro no substrato e adicione imediatamente 100 microlitros de EDC na mesma área. Incube por um minuto para ativar a monocamada auto-montada de MUA. Em seguida, coloque uma gota de 100 microlitros de proteína, uma solução na mesma área do substrato.

Coloque a amostra em um compartimento de uma placa de Petri com um mililitro de água destilada em outro compartimento. Feche a placa de Petri com uma tampa e armazene a amostra por 24 horas a cinco graus Celsius. Em seguida, enxágue a amostra em água destilada três vezes, continuamente as amostras em copos separados por 20 segundos em cada copo, não deixe as amostras secarem após o enxágue ou durante o enxágue para o projeto de duas amostras.

Prepare uma solução 0,9 milimolar de proteína de ligação à glicose ou GBP em tampão fosfato de potássio. Preparar também uma solução de glicose DG a 100 milimolares no tampão. Em seguida, misture 30 microlitros da solução de glicose D e 30 microlitros da solução de GBP.

Usando um recipiente de microtubo de plástico de um mililitro e uma micropipeta, incube por 30 minutos e, em seguida, deposite 20 microlitros da solução de GBP livre de ligante e 20 microlitros da solução de GBP ligada ao ligante nos substratos preparados. Usando uma micropipeta, armazene as amostras a cinco graus Celsius por 24 horas em uma placa de Petri com tampa selada. Enxágue as amostras três vezes na solução tampão de fosfato de potássio à temperatura ambiente Para preparar.

Projete três amostras diluindo a solução de APRE ou DBA de ligação à dopamina até uma concentração de um micromolar. Usando o tampão tris EDTA com um pH final de 7,4, prepare uma solução de dopamina para uma concentração de cinco micromolares medindo o pó de dopamina em uma balança analítica e misturando-o na solução salina tamponada com fosfato ou PBS com uma esfera de agitação por cinco minutos. Em seguida, deposite uma gota de 20 microlitros da solução de DBA na superfície de cada substrato e deixe a amostra descansar por uma hora em temperatura ambiente com uma tampa sobre a placa de Petri.

Depois de enxaguar as amostras três vezes em um tampão de fosfato de potássio, coloque as amostras na vertical em cima de um lenço de limpeza para secar a parte de trás, mantendo um filme na parte frontal do substrato. Reserve uma amostra como controle. Em seguida, coloque uma gota de cinco microlitros da solução de dopamina na superfície do PBS existente.

Solte as amostras restantes. Incubar as amostras durante 10 minutos antes de as enxaguar três vezes na solução tampão fosfato de potássio. Para realizar espectroscopia de ramen.

Coloque cada amostra em uma câmara à prova d'água para evitar a evaporação por exposição ao laser. Encha uma seringa de plástico com graxa de alto vácuo quimicamente inerte. Em seguida, coloque as amostras em lâminas de vidro e dispense alguns milímetros de graxa ao redor das amostras sem tocar nas amostras.

Coloque uma lamínula de microscópio em cima dos substratos. Pressione suavemente para formar uma vedação, criando uma fina interface líquida entre os substratos e as lamínulas sem permitir que o tampão entre em contato com a graxa a vácuo. Usando um sistema de microscópio Raman óptico, obtenha um foco na superfície da região do padrão nano de metal a ser amostrada sem ligar o laser.

Execute a amostragem Raman conforme descrito no protocolo de texto mostrado. Aqui estão as matrizes de pontos de nano padrão de níquel de ouro e prata em sílica fundida. O uso de litografia por feixe de elétrons ou EBL permite excelente posição e dimensão.

O tamanho do ponto de controle e a largura da lacuna são controlados pela exposição EBL. Matrizes hexagonais de dose de extremidade de ouro de níquel prateado são exibidas aqui. O comportamento de nucleação de tais camadas metálicas muito finas resulta em estruturas descontínuas.

Aqui está o espectro da série da proteína A imobilizada por substrato no projeto: uma intensidade de sinal da matriz um é muito mais forte do que da matriz dois. O sinal da matriz três era muito fraco. O espaçamento entre lacunas é claramente um parâmetro crítico para o desacoplamento do plasma e o aprimoramento da superfície do espalhamento de ramen exibido.

Aqui estão os espectros da proteína de ligação à glicose mostrando os efeitos de diferentes designs de substrato no estado livre e ligado ao ligante. Finalmente, os espectros s do aptâmero de ligação à dopamina são mostrados para moléculas livres de ligantes e ligadas a ligantes. Um espectro de dopamina em pó é mostrado para referência.

Ao tentar este procedimento, é importante evitar a contaminação dos substratos. Como uma técnica de espectroscopia é altamente sensível e você pode ter leituras falsas Empregando este procedimento. Podem ser identificados desenhos óptimos de substrato de origem para analitos específicos.

Em seguida, outros métodos nphy, como phy não impresso, podem ser executados para melhorar a escalabilidade da fabricação do substrato após seu desenvolvimento. Essa técnica ajudou os pesquisadores no campo da bioquímica e biossensoriamento a detectar moléculas biológicas sem certas superfícies em quantidades muito pequenas, permanecendo em solução. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como controlar o tamanho da nanoestrutura do metal e as propriedades do filme usando técnicas de fabricação e como explorar diferentes estratégias de reconhecimento biomolecular para atingir diferentes analitos.