Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

O objetivo geral deste procedimento é isolar vesículas extracelulares usando uma plataforma baseada em papel. Isso é feito primeiro laminando com duas folhas de poliestireno com celulose circular, recortes de papel alinhados em uma série de furos passantes registrados. O segundo passo é conjugar quimicamente moléculas que ligariam vesículas extracelulares à zona de teste de papel.

Em seguida, a amostra biológica pode ser pipetada diretamente na zona de teste de papel e as vesículas extracelulares são isoladas após a etapa de enxágue. A etapa final é caracterizar as vesículas extracelulares capturadas usando microscopia eletrônica, Eliza ou análise transcriptômica. Em última análise, subconjuntos de vesículas extracelulares de amostras de soro tão pequenas quanto 10 microlitros podem ser purificados e concentrados.

Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a ultraeducação, é que ela é muito suave, montada e simples de executar. Demonstrando o procedimento será um estudante de pós-graduação deve você. Começando com duas folhas de poliestireno, crie uma série de recortes circulares.

Cada um exibindo um diâmetro de menos de cinco milímetros com um punção manual ou cad, plotter de corte automatizado. Além disso, corte uma série de cromatografia de cinco milímetros de diâmetro, discos de papel com um furador. Coloque uma folha de poliestireno na bancada e sobreponha um único disco de papel em cima de cada orifício correspondente.

Coloque os discos de papel registrando e sobrepondo a segunda folha de poliestireno. Verifique o alinhamento geral antes de colar o sanduíche em um laminador térmico. Em seguida, inicie as modificações químicas da superfície nos discos de papel inserindo o dispositivo laminado em uma câmara de plasma.

Ative brevemente a superfície do papel com plasma de oxigênio após a liberação do vácuo da câmara, transfira imediatamente o dispositivo de papel para a solução de cilina e incube por 30 minutos. Defina a temperatura ambiente. Remova o excesso de pistas cy enxaguando o dispositivo com cinco mililitros de etanol 200 proof.

Em seguida, incube o dispositivo com a solução de ligação A-G-M-B-S por 15 minutos. Defina a temperatura ambiente. Remova o excesso de molécula de ligação com grandes quantidades de enxágues com etanol.

Em seguida, incube o dispositivo com avadon por uma hora a quatro graus Celsius e remova o avadon não ligado com uma lavagem PBS de cinco mililitros. O dispositivo pode então prosseguir para a etapa de ligação do anticorpo ou ser armazenado a quatro graus Celsius por quatro semanas, se necessário. Após a fixação Aden, pipete 10 microlitros de solução de bloqueio nas regiões expostas do disco de papel e incube o papel por 10 minutos.

À temperatura ambiente, repita a adição de 10 microlitros de solução de bloqueio e a incubação em temperatura ambiente de 10 minutos. Mais duas vezes para completar a biofuncionalização do substrato de papel exposto, pipetar 10 microlitros das moléculas capturadoras biotiniladas nos discos e incubar por 10 minutos À temperatura ambiente para vesículas extracelulares, as moléculas de captura de escolha podem ser anticorpos anti CD 63 ou um xin cinco. Repita a pipetagem de 10 microlitros e os processos de incubação de 10 minutos.

Mais duas vezes Após a captura de fixação da molécula. Lave o excesso de porções pipetando. 10 microlitros do tampão de lavagem apropriado em cada disco de papel.

Incube a lavagem por um minuto em temperatura ambiente e repita as etapas de lavagem de 10 microlitros e incubação de um minuto mais duas vezes. O dispositivo de papel totalmente funcionalizado está agora pronto para isolar vesículas extracelulares do soro ou humor aquoso para processamento de soro. Colete 10 mililitros de sangue periférico em um tubo vacutainer e inverta suavemente o tubo cinco vezes.

Coloque o tubo na posição vertical e aguarde 30 minutos. Defina a temperatura ambiente, centrifugue a amostra de sangue por 15 minutos. Defina a temperatura ambiente.

Transfira a camada superior de soro transparente para um tubo de plástico limpo e descarte a fase semissólida inferior. Clareie o soro em uma velocidade de centrifugação mais alta por 30 minutos. Defina a temperatura ambiente.

Transferir o sobrenadante para um novo tubo e remover as partículas finas passando o sobrenadante através de um filtro de 0,8 micrómetros. O soro filtrado resultante pode ser usado imediatamente ou armazenado a 80 graus Celsius negativos. Se as vesículas extracelulares forem extraídas do humor, colete o humor aquoso dos pacientes diretamente por meio de procedimentos invasivos e armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos.

Até o uso, nenhuma etapa de filtração ou clarificação é necessária para amostras de humor vítreo. Para isolar vesículas extracelulares de soro ou humor aquoso, pipete cinco microlitros da amostra biológica em cada disco de substrato de papel biofuncionalizado. Incube o local por um minuto em temperatura ambiente e repita os processos de pipetagem de cinco microlitros e incubação de um minuto.

Mais duas vezes Após a ligação de afinidade, enxágue as vesículas não ligadas pipetando primeiro 10 microlitros do tampão de lavagem apropriado. Incubar o tampão durante um minuto à temperatura ambiente e repetir a lavagem de 10 microlitros e a subsequente incubação. Passo mais duas vezes.

As vesículas extracelulares capturadas estão agora prontas para os seguintes ensaios a jusante para fixar as vesículas capturadas na pipeta de suporte de papel funcionalizado 10 microlitros de 0,5 x fixador de karnofsky em cada disco de papel. Deixe a reação de reticulação prosseguir à temperatura ambiente por 10 minutos e enxágue todos os discos com grandes quantidades de PBS por cinco minutos. Em seguida, desidrate os substratos de papel aplicando as seguintes lavagens em ordem.

Uma incubação de 35% de etanol, duas incubações de 50% de etanol, duas incubações de 70% de etanol, duas incubações de 95% de etanol e quatro incubações de 100% de etanol. Para cada lavagem individual, deixe a solução de etanol incubar em cima dos discos de papel em temperatura ambiente por 10 minutos. Quando o dispositivo de papel é seco, a pulverização catódica cobre as amostras com uma camada de 18 nanômetros de ouro paládio em uma pulverização catódica de metal.

Insira a amostra em um microscópio eletrônico de varredura e realize microscopia a cinco quilovolts para evitar o excesso de carga da amostra biológica para detectar vesículas capturadas por meio de imunoensaios. Comece adicionando cinco microlitros de anticorpo primário anti CD nove em cada disco de papel e incube em temperatura ambiente por um minuto. Remova todos os anticorpos não ligados lavando o dispositivo de papel com 30 mililitros de PBS em temperatura ambiente por meio de agitação mecânica.

Em seguida, pipete cinco microlitros de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rabanete em cada papel. Disco e incubar à temperatura ambiente durante um minuto. Lave o dispositivo com 30 mililitros de PBS por meio de agitação mecânica para remover anticorpos secundários não ligados.

Por fim, adicione cinco microlitros de mistura de substrato colorido e métrico em cada papel. Incube a reação em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos e escaneie a mudança resultante na intensidade da cor especial usando um scanner de mesa. Para começar, isole os discos de papel individuais do dispositivo a granel cortando regiões do excesso de laminado de poliestireno usando uma tesoura ou uma lâmina de barbear.

Coloque cada disco de papel em uma microcentrífuga limpa de 1,5 mililitro. Duas vesículas capturadas adicionando 265 microlitros de tampão de lise. E 35 microlitros de transportador de remoção de polissacarídeo à base de PVP para cada vórtice de tubo vigorosamente.

Para garantir a vesícula completa, lise e deslocamento das moléculas de RNA liberadas, adicione 30 microlitros de solução homogeneizada ao vórtice de lisado para misturar e incubar o tubo no gelo por 10 minutos. Em seguida, adicione 330 microlitros de mistura de ácido fenol clorofórmio ao lisado para garantir a separação específica da fase adequada do RNA das proteínas e do vórtice de DNA vigorosamente por pelo menos 15 segundos por tubo. Centrifugar o tubo a toda a velocidade durante cinco minutos.

À temperatura ambiente, transfira o RNA contendo a fase aquosa superior para um tubo novo de 1,5 mililitro e descarte a fase orgânica inferior. Adicione 1,25 volumes aquosos de 100% de etanol ao RNA e vórtice brevemente para misturar. Em seguida, aplique a mistura em uma coluna comercial de extração sólida de RNA.

Centrifugar o tubo durante 15 segundos à temperatura ambiente e rejeitar a fracção de passagem do fluxo. Lave a coluna adicionando 700 microlitros de solução de trabalho. Número um, centrifugue o tubo por cinco a 10 segundos e descarte o fluxo.

Em seguida, lave a coluna com 500 microlitros de solução de trabalho. Número dois, centrifugue o tubo por cinco a 10 segundos. Descarte o fluxo e repita a lavagem mais uma vez.

Remover qualquer etanol residual com uma centrifugação final de um minuto à temperatura ambiente e transferir a coluna de extracção seca para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 100 microlitros de água livre de RNA R pré-aquecida. Centrifugar o tubo à velocidade máxima durante cinco a 10 segundos e rejeitar a coluna de extracção superior, se necessário.

Concentre e purifique ainda mais o RNA EIT usando um kit comercial de limpeza de RNA usando biotina marcada com fluorescência. Como repórter da mobilização de sou de superfície. A eficácia e especificidade do protocolo de funcionalização do papel podem ser vistas comparando a alta fluorescência incorrida na superfície modificada do reticulador com superfícies de papel não funcionalizadas.

Além disso, quando a molécula repórter é substituída por um anticorpo anti CD 63 biotinilado, o substrato de papel devidamente funcionalizado facilitará uma taxa de captura de vesículas extracelulares mais alta em relação a um substrato de papel de controle negativo. Quando diferentes moléculas de captura são imobilizadas em substratos de papel, diferentes subgrupos de vesículas extracelulares parecem exibir diferentes distribuições de tamanho usando o dispositivo de papel. Também se pode testar o conteúdo de RNA intravesical e a abundância de proteínas de superfície específicas da vesícula.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e atender o aumento em les extracelulares usando um dispositivo baseado em papel.