Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

O objetivo geral deste procedimento é avaliar as primeiras consequências de mutações nos fatores de iniciação da tradução sem interferência de mRNA recém-transcrito ou de problemas de eficiência de transfecção que ocorrem frequentemente em estudos com células eucarióticas. Isso é feito primeiro sintetizando o tipo selvagem mutante e controle, ou mRNA GFP a partir de plasmídeos correspondentes. Em seguida, o RNA sintetizado é microinjetado em citos XUS Lavis no estágio seis, e sua maturação é estimulada com progesterona.

Em seguida, a maturação do cito é avaliada pela visualização da quebra da vesícula germinativa e alguns dos componentes da cascata MA quinase cuja ativação depende da expressão da proteína do musgo são analisados por western blot. Finalmente, a poliadenilação de mRNA de musgo e outros mRNAs necessários para a recuperação da miose de citos XPO são estudados. Em última análise, maturação cinética do cite.

As análises de Western blot e poliadenilação são usadas para mostrar um impacto potencial da expressão da proteína quando um fator de iniciação da tradução é mutado. A principal vantagem desta técnica sobre nossos métodos existentes ou sistema celular reconstituído extraído igualmente com germe ou reticulócito de coelho, é que os efeitos de uma mutação introduzida em uma RM. NA será rapidamente observável e facilmente estudado em vários impostos xop. Cytes Mais geralmente.

Este modelo tem as vantagens da simplicidade com suas células gigantes únicas, e seu uso leva a uma quantidade considerável de material para experimentos bioquímicos. Este processo também é eficiente em termos de tempo em comparação com a geração de linhagens celulares estáveis. Este missô pode ajudar a responder a questões-chave em estudos de tradução, como entender melhor o papel de domínios específicos de fatores de ação ou estudar o Splicing desses fatores.

Adicionamos a ideia para este método pela primeira vez quando queríamos estudar o impacto de um fator de iniciação de tradução mutado na síntese de proteínas sem interferência da transcrição. Dessa forma, evitamos possíveis loops de feedback entre esses dois mecanismos. De fato, a transcrição do material é armazenada e colocada.

A tradução pode ser desencadeada com progesterona Após defecar, xus lavos cita e prepara CRN de acordo com o protocolo de texto, use 10 esfregões e 6,6% de formaldeído para lançar um gel AROS de 1,5%. Prepare as amostras em um tubo de 0,2 mililitro com 8,8% de formaldeído, 60% para AMIDE 0,1 volumes de 10 esfregões e um microlitro de CRNA, incube a 70 graus Celsius por três minutos e coloque os tubos no gelo por 10 minutos. Centrifugue as amostras a 5.000 vezes G por alguns segundos antes de adicionar dois microlitros de tampão de carregamento de gel.

Execute as amostras a 90 volts por 20 minutos para desdenhar o gel. Mergulhe-o em água livre de nuclease durante a noite. Em seguida, analise-o para verificar a qualidade do CNA.

Use um espectrofotômetro para determinar a concentração de CNA e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius para realizar a microinjeção de RNA. Use o meio ND 96 para encher uma placa de Petri raspada uma a duas horas após a desfolha. Disponha os citos ao longo de uma faixa raspada no prato.

Em seguida, usando uma micropipeta capilar com uma ponta quebrada colocada em um ângulo de 45 graus. Insira a ponta capilar cerca de 150 a 200 mícrons de profundidade na zona equatorial abaixo da área pigmentada do animal. Injete 30 nanogramas de CRNA em 60 nanolitros no primeiro oócito.

Em seguida, espere de cinco a 10 segundos antes de remover a ponta capilar para evitar que a amostra vaze. Para injetar o próximo cite Mova manualmente o prato. Transfira os citos injetados para 24 placas de cultura de poços cheias de três mililitros de meio ND 96 e leve-os a 19 graus Celsius para desencadear a maturação mitótica.

Incubar os oócitos em ND 96 com dois microgramas por mililitro de progesterona ou PG a 19 graus Celsius por 15 horas. Testar o efeito de tradução de CRNAs EIF 4G one do tipo selvagem no fenótipo mutante de acordo com o protocolo de texto. Determinar a extensão da quebra da vesícula germinativa sob um microscópio estereoscópico.

Conte o número de citos maduros após a estimulação do PG pela presença de uma mancha branca no pólo preto do animal. Repita a contagem a cada hora até a 24ª hora para realizar análises de sangue ocidentais. Use os movimentos para frente e para trás de uma ponta de micropipeta a quatro graus Celsius para homogeneizar 10 citos em 200 microlitros do tampão mostrado aqui.

Centrifugar as amostras a 10 000 vezes G durante 15 minutos para extrair a fracção citoplasmática do meio. Faseie a fração superior dos lipídios correspondentes e a inferior em detritos celulares. Recolher a fracção citoplasmática e armazenar uma alíquota para determinar a concentração de proteínas.

Combine o restante em uma proporção de um para um com o buffer de amostra lamely ou Biss antes de executar a página SDS e o western blotting. De acordo com o protocolo de texto. Para realizar um ensaio de poliventilação, coloque cinco citos por condição em tubos de micro fuga de 1,5 mililitro com um mililitro de um XPBS livre de nuclease lave os citos.

Em seguida, sob a capela de exaustão, use um kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante para isolar o RNA. Depois de verificar a integridade do RNA e determinar a concentração, preparar duas misturas de ligação por condição de CRNA com os seguintes reagentes para a primeira mistura. Adicione RNA de citos não estimulados com pg e à segunda mistura.

Adicione RNA de oócitos estimulados por PG. Incube a 37 graus Celsius por uma hora e depois a 65 graus Celsius por 20 minutos. Para inativar a enzima usando um kit de transcrição reversa CD NA.

Para cada amostra, preparar a mistura RT aqui enumerada. Adicione 10 microlitros da reação de ligadura previamente preparada e realize a RT de acordo com as instruções do fabricante após a realização da PCR, usando a seguinte mistura de reação e condições para cada reação a quatro microlitros de tampão de carga e execute 10 microlitros de cada amostra em um gel 3%agros a 110 parafusos. Finalmente, analise o gel após 10 e 20 minutos para observar uma mudança no tamanho refletindo o comprimento da cauda poliA e, portanto, a maturação do RNA, que é um pré-requisito para sua tradução.

Como mostrado aqui, a maturação cinética de oócitos microinjetados em condições de controle é semelhante ao tipo selvagem, com números semelhantes submetidos a GVBD 12 e 24 horas após a estimulação do PG, 24 horas após a estimulação do PG. A porcentagem de oócitos que atingem a maturação é semelhante para o tipo selvagem, bem como para os controles injetados com água e GFP, indicando que a microinjeção com água ou controle ou CRNAs EIF 4G teve pouco efeito na microinjeção de miose de oócitos com o EIF 4G negativo dominante, no entanto, resultou em uma diminuição dramática no GVBD mesmo após a estimulação do PG. Esta figura mostra que o defeito de maturação pode ser restaurado no CRNA do tipo selvagem à medida que aumenta a proporção entre o tipo selvagem e o EIF 4G negativo dominante um CRNA.

O mesmo acontece com a porcentagem de citos que sofrem maturação conforme o esperado. Nenhuma expressão endógena de musgo é detectada na ausência de estimulação PG e a superexpressão de EIF 4G, um negativo dominante tem pouco impacto no musgo endógeno, de acordo com os resultados anteriores. Além disso, Aurora AEEG dois, que atua a montante da indução de musgo, não mostra evidências de desregulação proteica ou de sua forma fosforilada induzida após a estimulação do PG.

Por outro lado, a fosforilação irk two, que é induzida pelo musgo, é inibida na presença do EIF 4G negativo dominante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não exceder 120 nanolitros de CNA com uma concentração abaixo de certos nanogramas Após este procedimento.

Embora métodos como a análise de perfil de polissoma possam ser realizados para responder a perguntas adicionais, como definir qual RNA pode ser mal ou muito traduzido.