Name: Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprenda a preparar circuitos hipocampo-ventral-núcleo accumbens in vitro para imagens ao vivo de sinalização de cálcio e liberação de neurotransmissores mediada por receptores nicotínicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Yehui Qin e Mallory Myers pelo suporte técnico. Também agradecemos ao Dr. Sigismund Huck por nos fornecer o anticorpo anti-α4-ECD. Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health NS22061 a L. W. R.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications No. 80-23, revisado 2012) e estudos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use para Comitês de Pesquisa em Stony Brook University (# 1618 e # 1792). 1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturas <ol><li> Camundongos Sacrifice (pós-natal dias 0-3, a partir do tipo selvagem (WT) ou nAChRs α7 linha de camundongo transgênico) com CO 2. Decapitar cada filhote e salvar a cauda em um tubo de 1,5 ml de centrífuga para post facto genotipagem. Execute as seguintes etapas em uma capa esterilizado. </li><li> Remover o topo do crânio com tesouras e pinças para expor todo o cérebro. Começando na junção onde os córtices cerebrais em parte, de um ao outro caudalmente, obter uma secção coronal que contém os córtices posteriores incluindo o vHipp 5,21 sob um microscópio de dissecação. </li><li> Dissecar vHipp tiras de tecido contendo a região CA1-subículo de acordo com um desenvolvimento atlas de cérebro de ratinho 22 (Figura 1A). Transferir para um prato de cultura de 35 milímetros contendo meio de cultura frio (4 ° C), cortadas em pequenas fatias finas (cerca de 100 mm x 100 mm microslices). </li><li> Pré-incubar 12 milímetros poli-D-lisina / laminina revestidos por lamelas de vidro dentro de 24 placas de cultura de tecidos com meio de cultura (~ 500 mL) durante pelo menos 30 min no incubador a 37 ° C. Remova a mídia antes do plaqueamento microslices. </li><li> A placa com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo no centro da lamela com uma quantidade mínima de meio (~ 50 ul, contendo ~ 20 peças de microslices) para facilitar a fixação dos explantes. Placa microslices vHipp provenientes de um único animal (ou a + / + ou - / - genótipo da linha α7 transgênico) em cada lamela. </li><li> Após os explantes resolver sobre a lamela, adicione delicadamente mídia adicional (~ 100 mL) por the parede de modo que o nível dos meios de comunicação é alta o suficiente para cobrir completamente os explantes sobre a periferia, mas não os que estão no centro da lamela. </li><li> Depois de uma O / N de incubação em 37 ° C, 5% de CO2, dispersar NACC neurónios embrionários do dia 18 ao dia pós-natal uma ratinhos WT e adicionar aos explantes. <ol><li> Dissecar tecidos NACC de acordo com um atlas do mouse cérebro em desenvolvimento 20 (Figura 1B). </li><li> Cortar em pequenos pedaços (cerca de 500 mm × 500 mm microslices) e transferir para um tubo de 15 ml. </li><li> Trata-se com 0,25% de tripsina (2 ml) durante 15 min a 37 ° C. Lavar pedaços de tecido três vezes com meio de lavagem frio (5 ml, 4 ° C), seguido por uma lavagem em meio de cultura frio (5 ml, 4 ° C). Permitir suspensão para descansar por 5 minutos em cada etapa de lavagem e, em seguida despeje cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Separar as células por trituração suave em 2 ml de meio de cultura com uma pipeta de Pasteur polida ao fogo levemente. </li><li> Transsuspensão de células fer para outro tubo de 15 ml e centrifugar a 2000 x rpm durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meios de cultura em 1 ml por 6 filhotes. Dispersar as células com cuidado pipetando em mídia várias vezes com uma pipeta Pasteur polida-fogo. </li><li> Adicionar 0,25 ml de células NACC dispersos para cada lamela com explantes vHipp. </li><li> Manter as culturas numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2. Coloque placas de cultura de compressas de gaze estéril umedecido para estabilizar mecanicamente e manter a umidade, facilitando a formação de sinapses. </li></ol></li></ol> 2. Immunocytochemistry <ol><li> Fix culturas (5-7 dias in vitro) em paraformaldeído a 4% / 4% de sacarose / PBS (~ 500 ul por lamela, 20 min, RT). </li><li> Permeabilizar as culturas com 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 ul por lamela, 5 min, RT). </li><li> Culturas em bloco com 10% de soro de burro normal em PBS (~ 500 mL por lamela, 30 min, RT) antes de Antibody coloração. Incubar com anticorpos primários o / n a 4 ° C. Use os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti- (nAChRs α 4 -ECD 1: 500; anti-α 5 subunidades, 1: 500), anti-vesicular transportador de glutamato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100). </li><li> Lavar anticorpos primários com PBS (3 vezes / ~ 500 ul por lamela, 5 min) e depois incubar as culturas em anticorpos secundários conjugados com Alexa 488 (~ 500 mL por lamela, 1: 500) ou Alexa 594 (~ 500 mL por lamela , 1: 500) durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Incubar em culturas αBgTx conjugados com Alexa 594 (~ 500 mL por lamela, 1: 1000 em meio de cultura) durante 45 min a 37 ° C, antes da fixação para rotulagem superfície α7 * nAChRs. </li><li> Montagem e vedação lamelas. </li><li> Capturar imagens com um microscópio de fluorescência equipado com objectivos Plan-Apocromática (20X com 0,8 NA ou 63X de petróleo com 1,4 NA) e uma câmera CCD. </li></ol> 3. FM1-43 Based vesicular Fusão <ol><li> Manter culturas (5-7 dias in vitro) em uma câmara de imagem, montar a câmara no disco giratório microscópio confocal. Continuamente perfundir (1 ml / min) com HBS cocktail à TA. </li><li> Parar de perfusão e de carga culturas com 10 uM FM1-43 em 56 mM de K + ACSF (~ 500 mL) durante 90 segundos (coloração), lavar corante externo afastado durante 15 min com Ca 2+ livre HBS contendo ADVASEP-7 (0,1 mM) para eliminar FM1-43 ligada à membrana. </li><li> Estimular as culturas com 56 mM de K + ACSF (~ 500 mL) sem FM1-43, durante 120 segundos (descoloração), recarregar as culturas com FM1-43 utilizando as mesmas condições, e lava-se novamente com o Ca2 + livre de HBS contendo ADVASEP-7 para 15 min. </li><li> Adquirir FM1-43 imagens de fluorescência com disco giratório microscópio confocal equipado com uma objectiva Plan-Apochromat (60X de água com 1,4 NA, excitação 488 nm, emissão 530 nm) e capturar imagens com uma câmera CCD. </li><li> Coletar imagens FM1-43 fluorescência de base (a cada 2 s por 1 min) Como o controlo de pré-nicotina; aplicam-se a nicotina (1 uM) por perfusão rápida (2 ml / min) durante 1 min, e em seguida lavar com nicotina para fora HBS coquetel. Mantenha lapso de tempo imagens de captura antes, durante e após a aplicação de nicotina cada 2 s por 5 min. </li><li> Quantificar FM1-43 intensidade de fluorescência antes (F coloração) e depois (F descoloração) aplicação de nicotina em cada bouton sináptica. </li><li> Calcular quantidade total de fluorescência FM1-43 libertado ao longo dos axónios vHipp pela quantificação da diferença de FM1-43 intensidade de fluorescência antes e após a aplicação de nicotina (Af = F coloração -F descoloração). Analisar fração de diminuição da intensidade de fluorescência após a nicotina com a seguinte equação: F diminuição% = Af / F coloração. </li></ol> Imagem 4. Cálcio <ol><li> Enxágüe culturas (5-7 dias in vitro) rapidamente com HBS normal, em seguida, carregar culturas com 5 Indicador de Fluo-4 Ca 2+ (Éster AM) e 0,02% de Pluronic F-127 em HBS (2 ml) durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lave a Fluo-4 com solução HBS (3 vezes / 5 min). Retorno culturas para incubadora (37 ° C / 5% de CO 2) durante pelo menos 30 min. </li><li> Manter as culturas na mesma câmara de imagem e mesmas condições que as descritas na secção de fusão vesicular com base FM1-43 (veja o passo 3.1). </li><li> Coletar imagens Fluo-4 fluorescência de projeções axonais dos micro-fatias vHipp com um objectivo Plan-Apochromat (60X de água com 1,4 NA, excitação 488 nm, emissão 530 nm) e uma câmera CCD. </li><li> Recolha de linha de base de Fluo-4 imagens de fluorescência (a cada 10 segundos durante 2 minutos) como o controlo de pré-nicotina, nicotina aplica (1 uM) por perfusão rápida (2 ml / min) durante 1 min, e em seguida lavar com nicotina para fora HBS coquetel. Manter lapso de tempo de captura de imagens, antes, durante e após a aplicação da nicotina a cada 10 segundos durante 30 minutos. </li><li> Salve todas as molduras dos fluo-4 imagens de fluorescência-primas, a exportação como uma série deImagens em formato TIFF para posterior análise. </li><li> Recolha a intensidade integrada de fluo-4 fluorescência ao longo vHipp axónios antes e após a aplicação de nicotina. </li><li> Normalizar a intensidade de fluorescência integrada com a seguinte equação: Af / F 0 = (FF 0) / 0 F, em que F representa a 0 pré-nicotina intensidade de fluorescência integrada corrigida-fundo e F é a intensidade de fluorescência integrada ao longo dos axónios vHipp em cada ponto temporal após a aplicação de nicotina. Analisar e traçar normalizada intensidade de fluorescência integrada. </li></ol>

<ol><li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+nicotinic+receptors%3A+structure+and+regulation%2C+role+in+learning+and+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li>
<li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li>
<li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li>
<li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+receptors+and+depression%3A+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li>
<li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719(2013).</li>
<li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li>
<li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li>
<li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li>
<li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li>
<li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911(2011).</li>
<li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li>
<li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold%3A+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li>
<li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li>
<li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological%2C+pharmacological%2C+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li>
<li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li>
<li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+alpha4%2A+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin%3A+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li>
<li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li>
<li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobowitz%2C+DM+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+the+Developing+Mouse+Brain%22">Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain</a>. , CRC Press. New York. (1998).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li>
<li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li>
<li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li>
<li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li>
<li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2%2B+dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação de co-cultura descrito re-circuitos do hipocampo ventral cede-accumbens in vitro. Esta análise permite preparação relativamente simples e de confiança dos perfis espaciais e temporais pelo qual a activação de nAChRs pré-sinápticos eliciar melhoradas transmissão glutamatérgica 5, 21. Co-culturas são definidos como o crescimento de diferentes tipos de células específicas em um prato que pode proporcionar condições fisiológicas in vitro para demonstrar ...

Modulação do circuito colinérgico excitabilidade contribui para os aspectos fundamentais de cognição, e modulação colinérgica alterada é uma característica de distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricas incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e dependência 1-4. Um mecanismo estabelecido de facilitação de transmissão sináptica colinérgica no sistema nervoso central é, por activação directa de nAChRs localizadas em locais pré-sinápticos. A activação destes receptores pré-sinápticos leva a um aumento de Ca2 + intracelular ([Ca 2+] i) nos terminais pré-sinápticos - tanto directamente, devido à relativamente elevada condutância de cálcio de certos subtipos de nAChR, e indirectamente, por cascatas de sinalização intracelular 5, aumentando, assim, a libertação de neurotransmissores. De facto, a activação dos nAChRs pré-sinápticos tem sido associada com mudanças na libertação de uma grande variedade de neurotransmissores, incluindo glutamato, GABA, acetilcolina, umND dopamina 6-10. Embora este processo tem sido estudada usando métodos electrofisiológicos indirectamente em diversas sinapses, indicadores ópticos de [Ca2 +] i e a reciclagem das vesículas sinápticas permitir uma medição mais directa e temporalmente precisa dos fenómenos pré-sinápticos. Localização pré-sináptica dos nAChRs foi demonstrada de forma convincente com rotulagem imuno-ouro direta de nAChRs na microscopia eletrônica (EM) nível 11,12. Várias outras técnicas também têm sido utilizados para tratar a localização do nAChR indirectamente, incluindo a detecção de locais de nAChRs subunit- quimeras de proteína fluorescente em neurónios cultivados 13,14, electrofisiológico gravação de correntes de nAChR em terminais sinápticos 15,16, monitorização de nicotina induziu alterações na [Ca 2 +] i em terminais nervosos sinápticas por imagens ao vivo de células 17 e monitoramento indireto da liberação do neurotransmissor no terminal sináptico portécnicas de imagem de células vivas com indicadores fluorescentes, incluindo exocitose das vesículas sinápticas vistos por estirilo corantes anfipï¿½icos FM (FM1-43 e FM4-64) e / ou synapto-pHluorin e por repórteres fluorescentes neurotransmissores específicos, como CNiFERs para ACh e iGluSnFr para glutamato 18-20. No geral, essas abordagens atuais para identificar a localização pré-sináptica dos nAChRs são complicadas e exigem sistemas e técnicas especiais para permitir a identificação confiável e monitorização fisiológica da atividade pré-sináptica. Aqui nós descrevemos protocolos e equipamentos para um sistema in vitro de co-cultura de um hipocampo ventral (vHipp) - núcleo accumbens (NACC) circuito que fornece acesso direto para identificar e analisar os dois componentes pré e pós-sinápticos de transmissão sináptica. Mostramos exemplos de localização pré-sináptica dos nAChRs ea imagens de células vivas de nAChR mediada sinalização de Ca2 + e liberação de neurotransmissores aloaxônios ng vHipp. Uma extensão natural (e direta) do protocolo apresentado aqui é a preparação de contatos pré e pós-sinápticos composta de neurônios de diferentes genótipos. Deste modo, a contribuição de um produto de gene em particular para o pré e / ou de mecanismos pós-sinápticos de modulação pode ser avaliada directamente.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Meio de Cultura (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 Suplementos</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. meios de lavagem (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. HEPES tamponado com solução salina (HBS)&nbsp; &nbsp; pH=7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. Coquetel HBS para imagens ao vivo pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tetrodotoxina&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 &micro; M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 &micro; M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 &micro; M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Sem cálcio HBS&nbsp; &nbsp; pH=7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Potássio ACSF pH=7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1,3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26,2 mM</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo de nicotina induzida sinalização de cálcio e neurotransmitter lançamento junto ventrais do hipocampo axons

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

O aumento sustentado da sinalização axonal e o aumento da liberação de neurotransmissores pela ativação de receptores nicotínicos de acetilcolina pré-sinápticos (nAChRs) é um mecanismo importante para a neuromodulação pela acetilcolina (ACh). A dificuldade de acesso à sondagem dos mecanismos de sinalização dentro dos axônios intactos e nos terminais nervosos, tanto in vitro quanto in vivo, limitou o progresso no estudo dos componentes pré-sinápticos da plasticidade sináptica. Aqui, apresentamos uma preparação quimérica genética do circuito ventral hipocampo (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os componentes pré e pós-sinápticos da transmissão, variando seletivamente o perfil genético dos neurônios pré vs pós-sinápticos. Demonstramos que as projeções de microfatias de vHipp, como entrada axonal pré-sináptica, formam sinapses glutamatérgicas múltiplas e confiáveis com alvos pós-sinápticos, os neurônios dispersos de nAcc. A localização pré-sináptica de vários subtipos de nAChRs é detectada e a transmissão sináptica mediada por sinalização nicotínica pré-sináptica é monitorada por registro eletrofisiológico simultâneo e imagens de células vivas. Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica glutamatérgica in vitro.

A preparação utilizada consiste de gene quimérico co-culturas de circuitos vHipp-NACC in vitro. Projeções que emanam microslices vHipp, como entrada axonal pré-sináptico, pode fazer contatos sinápticos com metas pós-sinápticos, os neurônios dispersos de NACC. A nicotina induziu um (≥ 30 min) facilitação sustentado de transmissão glutamatérgica de neurônios NACC inervados por vHipp axônios sinalização ao longo vHipp axônios 5 via α7 pré-sináptica * nAChRs 21 e prolongada de cálcio. <p c...

Desenvolvemos uma preparação quimérica genética do hipocampo ventral – circuito accumbens in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os mecanismos pré-sinápticos da transmissão sináptica mediada pelos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica.

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma preparação quimérica de genes do circuito hipocampal ventral-accumbens in vitro que permita a imagem direta em tempo real para identificar e analisar os componentes pré e pós-sinápticos da transmissão sináptica. Isso é realizado primeiramente dissecando tiras de tecido hipocampal ventral contendo a região CA1 CIC. O segundo passo consiste em cortar as tiras hipocampais ventrais em fatias finas e pequenas e, em seguida, colocar essas microfatias no centro da lamínula dentro da placa de cultura de tecidos de 24 poços durante a noite.Em seguida, dissecar o núcleo accumbens a partir dos tecidos cerebrais. O passo final é dissociar as faixas do núcleo accumbens em neurônios dispersos com tripsina e adicionar os neurônios do núcleo accumbens sobre lamínulas previamente recobertas com implantes do hipocampo ventral e incubá-los por cinco a sete dias. Por fim, a localização pré-sináptica de receptores de acetilcolina nicotínicos e a sinalização de cálcio mediada por receptores de acetilcolina nicotínicos e a liberação de neurotransmissores.Ao longo dos axônios do hipocampo ventral, pode-se identificar e monitorar por meio de imagem confocal de disco giratório em tempo real. A principal vantagem dessa técnica é que a preparação de cultivo celular dissociado em microfatias permite o reconhecimento fácil de seus éxons pré-sinápticos e alvos pós-sinápticos. In vitro, a preparação de co-cultivo recria o circuito do hipocampo ventral para o accu in vitro.Isso permite a imagem direta em tempo real de um ou ambos os compartimentos pré-sináptico e pós-sináptico. Este preparo sináptico in vitro permite a obtenção de imagens com alta resolução dos efeitos espaciais e temporais da ativação de receptores pré-sinápticos na transmissão sináptica glutamatérgica. Como resultado, pode-se obter informações sobre os mecanismos pré e pós-sinápticos que contribuem para a plasticidade sináptica glutamatérgica antes da coleta do tecido.Pré-incube lâminas de vidro recobertas com poli-L-lisina laminada de 12 milímetros em placas de cultura de tecidos de 24 poços com 500 microlitros de meio de cultura a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Em seguida, remova o meio antes de semear os microfragmentos para coletar o tecido para cultura. Remova a parte superior do crânio para expor todo o cérebro de cada filhote sacrificado sob um microscópio estereoscópico.Partindo da junção onde os córtices cerebrais se separam um do outro, cauley, obtenha uma secção coronal contendo os córtices posteriores, incluindo os hipocampos ventrais. Em seguida, dissecar os tecidos do hipocampo ventral contendo as regiões do corpo estriado. Depois disso, transfira os tecidos para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo meio de cultura frio.Posteriormente, corte os tecidos em fatias finas menores. Plaque as fatias com uma pipeta Pasteur polida ao fogo no centro da lamínula. Adicione 50 microlitros de meio para facilitar a adesão dos explantes x.Em seguida, plaque os microcortes do hipocampo ventral sobre o lamínula após os explantes X se assentarem suavemente sobre o lamínula; adicione cuidadosamente 100 microlitros de meio adicional pela parede do recipiente, de modo que o nível do meio seja suficientemente alto para cobrir completamente os explantes na periferia, mas não aqueles no centro do lamínula. Incube então os explantes durante a noite em 5% CO₂ a 37 graus Celsius antes da dispersão dos neurônios do núcleo accumbens. Agora, obtenha os tecidos do núcleo accumbens de camundongos entre o dia embrionário 18 e o dia pós-natal 1, corte-os em pequenos pedaços e, em seguida, transfira-os para um tubo de 15 mililitros.Trate os tecidos com dois mililitros de tripsina a 0,25% por 15 minutos a 37 graus Celsius. Posteriormente, lave os tecidos três vezes com cinco mililitros de meio de lavagem a 4 graus Celsius e deixe a suspensão repousar por cinco minutos em cada etapa de lavagem. Em seguida, lave os tecidos em cinco mililitros de meio de cultura a 4 graus Celsius.Em seguida, dissocie as células por pipetagem suave em dois mililitros de meio de cultura com uma pipeta de Pasteur levemente flamejada. Depois, transfira a suspensão celular para outro tubo de 15 mililitros e centrifugue a 2000 RPM por cinco minutos. Após cinco minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em meio de cultura na proporção de um mililitro por seis filhotes, então disperse as células pipetando suavemente o meio várias vezes com uma pipeta de Pasteur flamejada.No final, adicione 25 mililitros das células dispersas do núcleo accumbens a cada lamínula com os explantes do hipocampo ventral. Coloque as placas de cultura sobre compressas estéreis umedecidas para estabilizar mecanicamente e manter a umidade, facilitando assim a formação de sinapses. Em seguida, incube as placas a 5%CO2 a 37 graus Celsius.Neste procedimento, transfira as culturas para uma câmara de imagem uma de cada vez. Monte a câmara no microscópio confocal de disco giratório. Perfuse continuamente a amostra com coquetel HBS a um mililitro por minuto à temperatura ambiente.Em seguida, interrompa a perfusão e marque a cultura com 10 micromolares de FM 1-43 em A CSF com 56 milimolares de potássio por 90 segundos. Depois, remova o corante externo com lavagem por 15 minutos com HBS sem cálcio contendo 0,1 milimolar de A-D-V-A-S-E-P sete. Após isso, desestimule a cultura com A CSF com 56 milimolares de potássio sem FM 1-43 por 120 segundos.Para deter. Recarregue a cultura com FM 1 43 nas mesmas condições e lave novamente com HBS sem cálcio contendo A-D-V-A-S-E-P sete por 15 minutos. Agora, adquira as imagens fluorescentes de FM 1 43 com um microscópio confocal de disco giratório equipado com uma objetiva planapocromática e capture as imagens com uma câmera CCD.Colete as imagens fluorescentes de refer&ecirc;ncia com FM 1 43 a cada dois segundos durante um minuto como controle pr&eacute;-nicotina. Em seguida, aplique um micromolar de nicotina por perfus&atilde;o r&aacute;pida a dois mililitros por minuto durante um minuto, antes de lavar a nicotina com o coquetel HBS. Continue capturando as imagens em lapso de tempo antes, durante e ap&oacute;s a aplica&ccedil;&atilde;o de nicotina a cada dois segundos durante cinco minutos.Nesta etapa, lave rapidamente as culturas com HBS normal. Em seguida, carregue as culturas com indicador de cálcio flu oh four de cinco micromolar e 0,02% F1 27 não iônico em dois mililitros de HBS durante 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% CO2. Depois disso, remova a solução de flu oh four lavando com HBS três vezes, sendo cada lavagem de cinco minutos.Retorne as culturas ao incubador por pelo menos 30 minutos. Em seguida, transfira as culturas uma a uma para a câmara de imagem. Em condições idênticas às descritas nos procedimentos de fusão vesicular baseados em FM 1 43.Colete as imagens fluorescentes de referência do flu oh quatro das projeções axonais a partir de fatias microscópicas do hipocampo ventral como controle pré-nicotina. Em seguida, aplique um micromolar de nicotina por perfusão rápida a dois mililitros por minuto durante um minuto e, depois, lave a nicotina com o coquetel HBS. Continue capturando imagens em lapso de tempo antes, durante e após a aplicação da nicotina a cada 10 segundos durante 30 minutos.Esta figura demonstra diretamente que as projeções provenientes de microfatias do hipocampo ventral são glutamatérgicas e que os contatos são estabelecidos com neurônios GABAérgicos dispersos. Foram encontrados nos axônios hipocampais ventrais tanto receptores nicotínicos de acetilcolina alfa sete quanto não alfa sete, especificamente nos locais onde as projeções do hipocampo ventral entram em contato com neurônios do núcleo accumbens. Deve-se observar que os neurônios dispersos do núcleo accumbens não expressam receptores nicotínicos de acetilcolina alfa sete, o que indica que os aglomerados de receptores nos contatos são estritamente pré-sinápticos.As imagens em lapso de tempo da fluorescência de cálcio flu oh four ao longo dos axônios hipocampais ventrais foram adquiridas com uma objetiva de água de 60 x a cada 10 segundos durante 30 minutos, utilizando um microscópio confocal de disco giratório. As imagens adquiridas foram indicadas em escala pseudocor e reproduzidas como um vídeo a duas imagens por segundo. Este vídeo mostra que a aplicação de nicotina induziu atividade sustentada de fluorescência de cálcio flu oh four ao longo de axônios hipocampais ventrais vivos de tipo selvagem.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de semear os microexplantes do hipocampo ventral em um volume mínimo de meio e manter as placas de cultura sobre caminhos estéreos úmidos. Essas etapas são fundamentais para a adesão dos microexplantes, o crescimento das projeções e a formação das sinapses. Assim, esta cocultura permite variar os genótipos das entradas pré-sinápticas separadamente dos seus alvos pós-sinápticos.Além disso, permite a expressão seletiva de genes exógenos em cada compartimento de forma independente. Isso possui grande potencial para investigar mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como gerar culturas sinápticas co-culturadas quiméricas para genes que recapitulam o circuito do hipocampo ventral para o núcleo accumbens.Você então deverá ser capaz de usar técnicas de imagemagem em tempo real para analisar neurônios pré e pós-sinápticos.

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.

Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Este vídeo demonstra o processo de preparação de tecidos ventrais, hipocampo e núcleo accumbens de cérebros de camundongos para co-cultura. Os neurônios estendem as projeções para formar conexões sinápticas entre os tecidos ventral do hipocampo e do núcleo accumbens. Este método permite estudar as interações neuronais entre essas duas regiões do cérebro, oferecendo insights sobre cognição, comportamento e distúrbios neurológicos.

Co-cultivo do hipocampo ventral e do núcleo accumbens

Este vídeo demonstra como a ativação mediada pela nicotina dos receptores nicotínicos de acetilcolina no hipocampo ventral do camundongo resulta em sinalização sustentada de cálcio ao longo dos axônios.

Imagem da sinalização de cálcio induzida por nicotina ao longo dos axônios do hipocampo ventral em co-culturas sinápticas

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/61481/quantifying-spontaneous-ca2-fluxes-and-their-downstream-effects-in-primary-mouse-midbrain-neurons'&gt;Bancroft, E. A., et al. Quantificando o estilo Ca = '-webkit-text-decoration-skip: none; font-family: Arial, sans-serif; font-size: 0.6em; font-style: normal; font-variant: normal; font-weight: 400; text-decoration-skip-ink: none; vertical-align: baseline; espaço em branco: pré-encapsulamento; '&gt; 2 + &lt; span...

Visualização do influxo de cálcio em neurônios do mesencéfalo ventral derivados de embriões de camundongos

Fonte: Lark, A. R., et. al., Abordagem de imagem cerebral funcional in vivo baseada no indicador de cálcio bioluminescente GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens em tempo real da dinâmica do cálcio usando Green bioluminescência de proteína fluorescente-aequorina em Drosophila estruturas cerebrais profundas.

Imagem de bioluminescência para estudar transientes de cálcio em estruturas cerebrais de Drosophila

Este artigo apresenta um método para estudar os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em fatias de cérebro de rato por nicotina uncaging. Quando acoplado com gravação de braçadeira do remendo simultânea e 2-fóton laser, microscopia eletrônica de varredura, nicotina uncaging conecta a função do receptor nicotínico com morfologia celular, proporcionando uma compreensão mais profunda da neurobiologia colinérgico.

Função de receptores nicotínicos de acetilcolina em fatias de cérebro de rato através de Laser Flash fotólise de nicotina Photoactivatable de sondagem

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Aqui nós apresentamos um protocolo com que o cálcio pre-e/ou pós-sináptica pode ser visualizado no contexto da aprendizagem e da memória de Drosophila . A imagem latente in vivo do cálcio que usa sensores synaptically localizados do cálcio é combinada com um paradigma olfactory clássico do condicionamento tal que a plasticidade sináptica subjacente este tipo de aprendizagem associativa possa ser determinada.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Este artigo demonstra a preparação de uma janela de imagem personalizada complementada com cânula de infusão e sua implantação na região ca1 do hipocampo em camundongos.

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a preparar circuitos hipocampo-ventral-núcleo accumbens in vitro para imagens ao vivo de sinalização de cálcio e liberação de neurotransmissores mediada por receptores nicotínicos.

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Explorar mais vídeos