In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar a dinâmica das micróglias em um modelo murino de glaucoma crônico por meio da imagem confocal in vivo da retina. Isso é alcançado por ophthalmoscopia confocal mensal não invasiva ou CSLO para visualizar as micróglias fluorescentes na retina e na cabeça do nervo óptico. A análise de imagens em tempo real utilizando segmentação do soma celular baseada em limiar e morfometria quantifica as alterações no número de células microgliais e na sua ativação.

Os resultados mostram que a imagem mensal por CSLO em camundongos vivos pode ser usada para monitorar a cinética da distribuição da densidade celular de micróglias e sua ativação morfológica durante a fase inicial da neurodegeneração crônica. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a imagem confocal de duas fótons de cérebros de camundongos com micróglias positivas para GFP, é que a imagem por CSLO da retina permite a observação e monitoramento diretos das células microgliais ao longo da progressão de distúrbios neurodegenerativos relacionados ao envelhecimento no organismo intacto. Tive pela primeira vez a ideia deste método após demonstrarmos *ex vivo* que as micróglias apresentavam intensa ativação e agrupamento na região central da retina de camundongos DBA/2J jovens em idades anteriores à neurodegeneração detectável.

Para investigar se essas alterações precoces do sistema imunológico inato que precederam o glaucoma detectável causaram sua neurodegeneração, precisávamos estabelecer uma abordagem in vivo para acompanhar as alterações microgliais. O procedimento para a aquisição de imagens em tempo real será demonstrado por Caesar Romero, um técnico do meu laboratório. Para iniciar os procedimentos, ligue o sistema CSLO e insira as informações da sessão. Em seguida, prepare-se adequadamente para a aquisição de imagens.

Acople uma lente objetiva limpa de campo amplo de 55 graus. Coloque um camundongo sobre a plataforma de imagem dois minutos após a administração do anestésico e dilate ambas as pupilas usando colírios miotáticos. Cinco minutos depois, confirme que o camundongo está anestesiado.

Em seguida, com pressão mínima, cubra cada olho com lentes de contato. Oriente o camundongo de modo que o olho direito fique alinhado com a lente objetiva e a órbita esteja paralela à lente. O animal não precisa ser imobilizado, mas deve ser mantido a uma distância constante da lente objetiva.

Com o olho alinhado por 10 a 15 minutos, o camundongo não se moverá nem piscará enquanto seus movimentos oculares forem rastreados pelo sistema de imagem em tempo real CSLO. Inicie a sessão de imagem coletando uma visão do fundo do olho da retina interna. Para isso.

Selecione o modo infravermelho, que corresponde a um comprimento de onda de excitação de 820 nanômetros. Em seguida, ajuste a potência do laser para 100% e a sensibilidade entre 40 e 60%. Depois, trabalhando em alta velocidade, localize o olho utilizando o joystick para orientar o oftalmoscópio e prepare-se para capturar uma imagem do fundo do olho do disco óptico e da vasculatura retiniana. Inspecione a córnea e o cristalino em busca de lesões ou opacidades.

Exclua do estudo olhos com defeitos ou lesões que possam afetar a aquisição de imagens. Agora, aproximando a objetiva do olho, localize a região do disco óptico, que é a superfície da cabeça do nervo óptico ou ONH. Em seguida, centralize a imagem na ONH.

O posicionamento correto da papila óptica é fundamental para obter um foco uniforme e uma emissão constante ao longo da imagem. O próximo passo é visualizar os planos internos da retina, bem como a papila óptica. Como plano focal de referência, utilize os vasos sanguíneos principais localizados na superfície vítrea da retina, o que corresponde a 59 e 60 dioptrias, ou ainda mais profundamente a 55 dioptrias em áreas de escavação do disco óptico.

Em seguida, ajuste a saturação da imagem utilizando o botão no painel sensível ao toque até que um halo branco de iluminação cubra a maior parte do fundo do olho ao redor do disco óptico. Em seguida, selecione a saturação mais baixa que produza um halo uniforme, indicativo de um contraste ideal para aquele olho. Pode ser necessário realinhar a câmera se áreas escuras persistirem.

Agora, colete uma imagem de fundo de alta resolução da retina central, fazendo a média de 30 quadros capturados em tempo real para melhorar a relação sinal-ruído. Isso corresponde a 4,7 quadros por segundo, normalizados imediatamente e na mesma posição preparada para coletar uma imagem de fluorescência das células positivas para GFP. Alterne para o modo de imagem de fluorescência no painel de tela sensível ao toque, que seleciona o laser azul com excitação a laser de 488 nanômetros e um conjunto de filtro de barreira de 460 a 490 nanômetros, e configure a aquisição para 100% da potência do laser e 100 a 125% de sensibilidade.

Agora, colete uma única imagem de fluorescência bidimensional no ponto XY, com média de 100 x varreduras. Em seguida, capture uma imagem de múltiplos pontos da retina ao redor do ONH: selecione "composto" no painel de controle e, então, mova com o oftalmoscópio ao longo do eixo nasal-temporal. O software automaticamente faz a média das áreas recém-varridas e as costura em tempo real.

Se a qualidade da imagem de áreas da retina for insuficiente para permitir a média, o círculo verde que identifica uma área sendo escaneada ficará vermelho. A imagem composta resultante cobre uma área de até 1,7 por quatro milímetros. Deve-se ter cuidado durante a aquisição da imagem composta.

Imagens de alta resolução podem ser perdidas ao mover a objetiva muito rapidamente antes da conclusão da média de varredura e da montagem de imagens. Quando a anestesia começa a passar, a sessão de imagem deve ser encerrada porque o camundongo começa a respirar com dificuldade e a aquisição de imagens se torna inviável. Comece alinhando sequencialmente as imagens do fundo do olho para uma série temporal, utilizando a vasculatura e o disco óptico como pontos de referência.

Utilizando um software convencional de edição de imagens, alinhe todas as imagens até que os O hs coincidam. A imagem superior ficará semitransparente durante o arrasto. Em seguida, rotacione cada imagem da sequência até que seus vasos sanguíneos principais coincidam com a vasculatura da imagem anterior e salve o arranjo para referência futura.

Registre o ângulo corrigido para cada imagem e aplique-o à imagem de fluorescência correspondente do ponto XY único. Agora é possível identificar células individuais de micróglia positivas para GFP localizadas na retina central abrindo os arquivos TIFF alinhados no Fluor render. Para visualizar todas as células, preencha a tela com a imagem e defina a composição da visualização de renderização como ortogonal e interpolada.

Em seguida, defina as propriedades gama 0,58, ponto de saturação 255, luminância 195, alfa em 1,00 e sombreamento. Finalize as seleções escolhendo os dois canais RG como visíveis. Oculte o canal B clicando duas vezes nele no quadro da área de trabalho para segmentar células individuais.

Selecione e limiarize o canal vermelho aumentando o limiar inferior até que a maioria das células seja mascarada com sobreposição mínima, excluindo os prolongamentos celulares, mantendo constante o limiar superior. Por fim, salve o arquivo com as células mascaradas utilizando o comando de captura. Abra a imagem com as células mascaradas no editor de gráficos matriciais ali.

Inverta a escala de cinza para observação direta e ajuste a resolução para 300 DPI ou mais. A imagem RGB é salva como um arquivo TIF. O próximo passo da análise de imagem em tempo real é das micróglias, portanto, segmentação e morfologia para identificar SATA para quantificação da área.

Utilize um software capaz de realizar medições de intensidade e contagem de objetos com base em limiar. Abra o arquivo TIFF com células segmentadas e selecione a reescalação por spline para resolução máxima e o canal vermelho em preto e branco para melhor visualização. Em seguida, calibre a imagem definindo seu diâmetro horizontal como 1,4 a 1,7 milímetros, dependendo da idade, para segmentar células individuais.

Então MA, aplique limiarização de intensidade no canal vermelho. Abra a função de limiar de intensidade no comando de contagem de objetos e atualização de registros. Use esta função para acompanhar parâmetros bidimensionais para cada limiar da região de interesse que representa o indivíduo.

Em seguida, defina o limiar de intensidade no histograma de intensidade. Selecione os 50 a 60% mais baixos dos 255 níveis e refine o valor final do limiar para as células individuais. Avalie visualmente a sobreposição entre a máscara de cor do limiar em azul e o perímetro do corpo celular em cinza utilizando os controles da barra de ferramentas binária ou o catálogo de objetos.

Identifique manualmente as regiões de interesse somáticas com múltiplas células. Separe esses elementos delimitando as regiões de interesse. Ao fazer isso, use a alternância para visualizar diretamente as células agora, utilizando a restrição de área.

Classifique as células microgliais como ativadas se suas áreas dos somas forem maiores que 50 a 60 micrômetros quadrados. Classifique as microglias como desativadas se tiverem somas menores.

Por fim, verifique o processo e analise a complexidade da ramificação em cada célula microglial ativada sobrepondo a máscara somática e a imagem do único ponto XY com o contraste aumentado em 50%. O protocolo descrito foi utilizado para visualizar células microgliais em uma grande área da retina central. Em camundongos DBA/2J jovens heterozigotos que expressam CX3CR1-GFP, a alta resolução celular combinada à imagem viva, limiarização e análise morfométrica permitiu a segmentação automática de células individuais positivas para GFP, permitindo assim discriminar as células com base na área. O modelo de camundongos DBA/2J apresenta glaucoma crônico e foi submetido a imagens mensais para monitorar o desenvolvimento de microgliose local e ativação da microglia em idades anteriores à neurodegeneração detectável, consistente com a progressão variável da neurodegeneração em olhos individuais. Essa análise revelou alterações na ativação da microglia retiniana e na microgliose ao longo do tempo.

A análise também detectou mudanças dinâmicas na densidade de micróglias totais e ativadas dentro de retinas individuais. A densidade populacional de micróglias não foi associada a alterações na densidade de células que expressam GFP, o que é consistente com outras descobertas. Assim, a análise por CSLO poderia ser utilizada como um indicador de progressão precoce da doença.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de otimizar cuidadosamente os níveis de saturação da imagem fluorescente de GFP mais micróglias, localizadas na retina interna, pois a reprodutibilidade das imagens de CSLO da retina central, bem como os detalhes celulares consistentes detectados ao longo da retina central, dependem criticamente desta etapa após seu desenvolvimento. Este protocolo de imagem in vivo está sendo aplicado em nosso laboratório, possibilitando investigar verdadeiramente a ligação potencial entre alterações precoces nas micróglias da retina e do nervo óptico, e a progressão posterior do glaucoma em modelos DBA/2J e em outros modelos de degeneração retiniana crônica. Essa estratégia de imagem in vivo também pode permitir a detecção precoce de outras patologias crônicas que acometem a retina e o nervo óptico na degeneração, como esclerose múltipla, doença de Alzheimer e doença de Parkinson.