Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

O objetivo geral deste procedimento é estudar as características de migração das células em ambientes 3D fisiologicamente relevantes. Isso é feito primeiro semeando células em um gel de colágeno interno que é então colocado em um gel de colágeno externo sem células com as propriedades de matriz desejadas. Em seguida, as células podem invadir e migrar no gel externo, durante o qual podem ser monitoradas e analisadas quantitativamente.

Em última análise, este ensaio de gel concêntrico é usado para mostrar como o comportamento da migração celular é afetado pelas propriedades biofísicas da matriz extracelular. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de transferência ou o ensaio de risco, é que a migração da célula ocorre em um ambiente de tratado fisiologicamente relevante, cujas propriedades estruturais e biofísicas são muito fáceis de controlar. A demonstração visual deste método é bastante essencial porque a formação do sistema de gel do roteador interno concentrado é bastante delicada.

Uma interface de gel adequada é muito importante para o sucesso deste experimento, que às vezes pode ser um pouco desafiador de alcançar. Comece com uma cultura de MD MBA 2 31 células prontas para serem colhidas de frascos T 25 com fluência de 80%co. A primeira tripsina são as células usando um mililitro de solução por frasco.

Em seguida, colete as células como um pellet usando 200 Gs de força por quatro minutos, descarte o snat e ressuspenda as células em cinco mililitros de cultura. Mídia. Agora meça a densidade celular usando um hemocitômetro e determine o volume necessário para 100 milhões de células por mililitro. Em seguida, gire as células a 200 G por quatro minutos.

Remover o sobrenadante e ressuspender completamente o sedimento no volume necessário de meio de cultura isento de soro. Esta suspensão é 10 vezes a concentração final do assento. Para começar a reunir as soluções de estoque necessárias em um balde de gelo, elas incluem 10 XPBS milq de água e hidróxido de sódio 0,1 molar.

Também resfrie vários tubos de microcentrífuga sob um capô, mantendo a técnica estéril, alíquota a quantidade de colágeno desejada para 50 microlitros de 2,4 miligramas por mililitro de solução de gel interno. Em seguida, adicione lentamente cinco microlitros de 10 XPBS ao colágeno medido. Gire o tubo à medida que o PBS é adicionado, mas evite fazer bolhas.

Em seguida, ajuste o pH da mistura para 7,4 com a solução base. Normalmente, cinco microlitros farão o trabalho. Um guia de solução de problemas é fornecido no protocolo de texto.

Por fim, aumente o volume para 45 microlitros com meio de cultura livre de soro, deixando espaço para a suspensão de 10 células. Para começar, adicione cinco microlitros de suspensão de 10 células à solução de colágeno e ressuspenda as células completamente na solução sem formar bolhas de ar. Agora, para pré-aquecer a placa de fundo de vidro, adicione 20 microlitros da suspensão ao centro.

Bem, formando uma gota em forma de cúpula, se uma bolha se formar rapidamente, rompa-a ou sugue-a sem fazer bagunça. Moldar o gel da maneira certa pode ser muito complicado, especialmente com soluções muito viscosas como o colágeno. Tente evitar ao máximo a produção de bolhas e não agite a solução quando estiver pronta para polimerizar, pois o inchaço pode resultar no alinhamento da fibra artificial.

Agora retorne o prato à incubadora por 45 minutos para deixar a camada interna polimerizar 15 minutos antes do término da incubação. Prepare 200 microlitros de solução externa de gel de colágeno no gelo. Primeiro, alíquota o volume necessário de colágeno estoque.

Em segundo lugar, adicione lentamente 20 microlitros de 10 XPBS com um giro suave. Em seguida, ajuste o pH para 7,4 como antes e leve a solução até 200 microlitros com água Milli Q. Agora remova o prato da incubadora e adicione suavemente 180 microlitros da solução de gel externa em cima da cúpula de gel interna.

Isso deve cobrir completamente a solução interna e encher o poço. Não mexa a solução e evite tocar na solução de gel interna. Se uma bolha se formar durante a ejeção da solução externa, seja rápido para rompê-la ou sugar de volta para a pipeta.

Outro passo importante é garantir que uma interface de gel adequada seja obtida. A chave para esta etapa é adicionar a solução de gel externo. Quando o gel interno ainda não foi certificado.

A cinética de gelificação pode variar com a condição de polimerização e é essencial otimizar essa condição de antemão: Para deixar o gel externo polimerizar, retorne o prato à incubadora por 45 minutos. Após 45 minutos, o gel deve estar bastante sólido, mas ainda pode ser desalojado com cuidado, adicione dois mililitros de meio quente para submergir totalmente o gel. Isso completa a cultura de gel concêntrica fornecida em meio fresco a cada dois ou três dias.

Em poucos dias, as células começarão a migrar para a matriz externa para observar sua migração, corar as células com um rastreador fluorescente. Substitua os dois mililitros de meio por meio fresco contendo cinco microlitros de corante e incube por 30 minutos após o período de incubação, lave a cultura usando um mililitro de PB S3 vezes por dois a três minutos por lavagem. Após as lavagens, encha novamente o prato com mídia normal.

Em seguida, coloque o prato em um microscópio ambientalmente controlado. Agora use uma configuração de volume de uso para verificar as regiões externas do gel ao lado da interface do gel. Normalmente, digitalize em visualizações quadradas de 647 mícrons com 100 mícrons de espessura, usando intervalos de cinco mícrons na pilha ZS.

Em seguida, escaneie as regiões intermediárias e, finalmente, escaneie os arredores do gel. Exclua regiões dentro de 50 mícrons das superfícies inferior, superior ou lateral para evitar células que possam estar sofrendo um efeito de borda. Para analisar o movimento das células a partir dos dados coletados, primeiro abra os arquivos de imagem em um software de análise de dados, como o imas.

Comece selecionando o comando superar e, em seguida, a superfície de comando. Isso abre a opção de rastrear superfícies. Com o tempo, selecione a região de interesse no conjunto de dados, ou seja, as coordenadas cartesianas e o período de tempo.

Em seguida, subtraia o plano de fundo da região de interesse. Para evitar a perda de uma célula para a eliminação do plano de fundo, selecione a maior esfera que se encaixa no objeto. Agora, divida os objetos conectados selecionando o diâmetro do ponto inicial e prossiga para classificar todos os pontos iniciais.

O próximo passo é classificar a superfície agora manualmente. Agrupe pontos de semente que apontam para o mesmo objeto. Faça isso entre todos os pontos de tempo na região de interesse.

Por fim, rastreie os objetos quando o rastreamento for concluído, classifique as trilhas do objeto e, em seguida, gere o conjunto de dados quantitativos para analisar usando uma planilha. Após alguns dias de culturas de gel concêntricas, as células romperam a interface interna do gel externo e começaram a invadir o gel externo. A população de células se espalhou para fora em uma direção predominantemente radial.

O movimento das células no gel externo de várias densidades de colágeno foi comparado. A imagem foi realizada durante um período de oito horas e cerca de 200 trajetórias celulares foram calculadas a partir de cada amostra. As células da matriz mais fina se moveram a menor distância.

Esse cálculo levou em consideração todas as células, não apenas as células que migram radialmente para fora. Em todos os casos, a distância total percorrida foi maior do que o deslocamento líquido. Como persistência esperada foi calculada como uma razão entre deslocamento e distância.

O valor de persistência de 0,4 sugere que essas células tiveram uma migração direcional intrinsecamente fraca. Os cálculos da velocidade média mostraram que a densidade de colágeno não afetou a velocidade das células. É possível que o tamanho dos poros da matriz e a densidade do colágeno, que estão inversamente relacionados, tenham tido o efeito oposto na velocidade de migração e, portanto, se compensam.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir um sistema de gel concêntrico e como estudar essa migração de células em ambiente 3D. Seguindo este procedimento, você pode fazer muitas outras coisas, como extração de células, análise de microarray, onde você pode tentar responder a perguntas adicionais, como o quanto certas proteínas são expressas durante diferentes pontos de tempo na migração.