Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

O objetivo geral do experimento a seguir é observar o papel da deformação mecânica na mecanobiologia celular quase em tempo real. Isso é conseguido primeiro construindo um sistema com membranas flexíveis nas quais as células são cultivadas e esticadas. Como segunda etapa, estique a membrana para calibrar as contagens do motor com a tensão da membrana.

Em seguida, as células epiteliais do pulmão do camundongo são esticadas e os núcleos são visualizados. Para mostrar que a tensão da membrana é transmitida às células, as macas então incorporadas ao A FM para nano indentação, a fim de medir a rigidez das células individuais antes e depois do alongamento. Os resultados mostram danos diretos nas células devido ao estiramento aplicado.

Também com base em imagens de fluorescência, a produção de espécies reativas de oxigênio aumenta com o estiramento. Bem, esse método pode responder a questões-chave no campo da biologia mecânica pulmonar, como se as células epiteliais podem ou não ser lesadas com ventilação mecânica. Este método pode fornecer informações sobre células pulmonares, biologia mecânica e também pode ser aplicado a outros tecidos moles, como fígado ou fatias de placas de crescimento.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades por causa da combinação não convencional de ferramentas usadas nesses experimentos, como o microscópio de força atômica. Para começar, prepare uma membrana PDMS revestida com colágeno modificada para uso em cultura de células, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, semeie células epiteliais do pulmão de camundongo a 2,5 milhões de células por poço em uma membrana revestida de colágeno estéril e flexível.

Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por dois dias até que as células atinjam a confluência. Em seguida, use um punção de biópsia de 1,5 milímetro para fazer dois furos em cada uma das seis abas de fixação, a 20,5 milímetros do centro da construção, se nenhuma pretensão for desejada. E remova os meios de cultura de células.

Certifique-se de que o atuador mecânico esteja em uma posição de tensão zero e posicione a membrana na maca de forma que os orifícios perfurados se alinhem com os pinos e os clamps. Coloque os grampos superiores no lugar e, em seguida, aperte os parafusos um de cada vez, alternando lados diferentes. Adicione um mililitro de meio de cultura de células antes de colocar o dispositivo no microscópio stage.

Centralize o dispositivo no caminho da luz. Em seguida, fixe o dispositivo no palco. Foque na membrana ajustando as posições plana e vertical do dispositivo mecânico com um controlador de platina do microscópio no bloco de entrada de destino.

Insira um valor de contagem de motores, que corresponde ao nível de deformação desejado a ser aplicado. Em seguida, defina o valor no bloco de entrada de velocidade para 10 RPM ou menos para observar o mesmo campo antes e depois do alongamento, pois o campo pode mudar em relação à objetiva do microscópio e pode ser necessário ajustar o microscópio stage durante o alongamento. Quando tudo estiver definido, clique em ir.

Comece fazendo ajustes no microscópio de força atômica. Aumente a altura da cabeça de um FM para sua posição máxima na direção Z. Em seguida, coloque extensores nas pernas para levantar o plano no qual um cantilever FM entra em contato com a amostra.

Em seguida, remova a placa do scanner A FM e a objetiva desejada do microscópio. Adicione um espaçador à objetiva e monte-o de volta no microscópio. Em seguida, coloque a placa do scanner de volta no A FM. A altura do espaçador dependerá da objetiva e da configuração específica de um FM, mas é necessário usar o espaçador se a imagem óptica for desejada, pois o plano de observação será deslocado na direção Z.

Em seguida, inicie o software A FM, o software do microscópio óptico e todas as fontes de luz necessárias, incluindo a fonte de luz para medições de fluorescência. Monte um chip com um feixe cantilever que tenha uma rigidez de 200 pico newtons por nanômetros ou menos para medir o módulo de elasticidade de células vivas no A FM. Em seguida, alinhe o laser em seguida, monte uma lamínula de vidro no dispositivo e use-a para calibrar a rigidez do cantilever de acordo com as sugestões do fabricante. Imediatamente antes de montar a membrana no dispositivo de alongamento, corte as paredes com cerca de um milímetro de altura.

Isso reduz a interferência experimentada entre as paredes da membrana e a célula de carga. Em seguida, remova o meio de cultura de células e monte a membrana no dispositivo mecânico. Coloque o dispositivo mecânico com o adaptador no scanner usando o software.

Estique a membrana até o nível de deformação de tração desejado antes da nano indentação. Adicione 0,5 mililitros ou menos de mídia nas células para mantê-las hidratadas, mas também tome cuidado para evitar derramamentos que possam danificar o scanner ou microscópio FM. Em seguida, engate a viga cantilever com a membrana.

Siga o protocolo do dispositivo A FM específico para escanear áreas de interesse. Quando uma cepa de 20% foi aplicada às células semeadas na membrana, as células deslocaram 20% conforme indicado aqui, o impacto das células na produção de espécies reativas de oxigênio foi medido em células epiteliais brônquicas usando um sensor de superóxido mitocondrial cumulativo, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Na ausência de estiramento mecânico, a produção de ROS não aumentou significativamente ao longo de 60 minutos quando um único trecho de 17% foi aplicado e mantido.

Houve um aumento de ROS mitocondrial que persistiu por mais 60 minutos com a incorporação da maca mecânica ao microscópio de força atômica. Módulo de elasticidade, mapas de células epiteliais pulmonares de camundongos antes e depois de 10% de tensão de tração foram obtidos das regiões descritas aqui. 300 curvas individuais de deflexão forçada foram registradas em uma área de 40 por 40 micrômetros, mostrando uma mudança na localização de regiões de alto módulo com a aplicação de deformação.

Uma vez dominado, o alongamento celular pode ser feito em 15 minutos. Embora um recuo nano FM possa consumir duas horas de execução adequada Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as células com cuidado, mas rapidamente, pois os resultados podem ser afetados adversamente pela agitação e exposição prolongada ao ar ambiente antes que os dados sejam relatados. Não se esqueça de que trabalhar com um FM pode ser extremamente desafiador.

Precauções como manter todos os líquidos longe do scanner devem ser tomadas durante a execução deste procedimento.