Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

O objetivo geral do seguinte experimento é observar o papel da tensão mecânica na mecanobiologia celular em tempo quase real. Isso é alcançado primeiramente construindo um sistema com membranas flexíveis nas quais as células são cultivadas e esticadas. Em um segundo passo, estica-se a membrana para calibrar as contagens do motor com a deformação da membrana.

Em seguida, células epiteliais pulmonares de camundongo são estiradas e os núcleos são visualizados. Para demonstrar que a deformação da membrana é transmitida às células, os estiradores são então incorporados ao microscópio de força atômica (AFM) para nanoindentação, com o objetivo de medir a rigidez das células individuais antes e após o estiramento. Os resultados mostram dano direto nas células devido ao estiramento aplicado.

Também com base na imagem de fluorescência, demonstra-se que a produção de espécies reativas de oxigênio aumenta com a distensão. Bem, este método pode responder perguntas fundamentais na área da biologia mecânica pulmonar, como por exemplo se as células epiteliais podem ser lesadas pela ventilação mecânica. Este método pode fornecer informações sobre a biologia mecânica das células pulmonares e também pode ser aplicado a outros tecidos moles, como fatias de fígado ou de placa de crescimento.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à combinação não convencional de ferramentas utilizadas nestes experimentos, como o microscópio de força atômica. Para começar, prepare uma membrana de PDMS revestida com colágeno, modificada para uso em cultura celular conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, semeie células epiteliais pulmonares de camundongo a uma densidade de 2,5 milhões de células por poço em uma membrana flexível, estéril e revestida com colágeno.

Incube as células a 37 graus Celsius e 5%CO2 por dois dias até que as células atinjam confluência. Em seguida, utilize um punch de biópsia de 1,5 milímetro para fazer dois furos em cada uma das seis abas de fixação, a 20,5 milímetros do centro do conjunto, caso não se deseje pré-tração. E remova o meio de cultura celular.

Certifique-se de que o atuador mecânico esteja em uma posição de deformação zero e posicione a membrana no estirador de modo que os furos coincidam com os pinos e as braçadeiras. Coloque as braçadeiras superiores e, em seguida, aperte os parafusos um de cada vez, alternando os lados. Adicione um mililitro de meio de cultura celular antes de colocar o dispositivo na platina do microscópio.

Centralize o dispositivo no trajeto da luz. Em seguida, fixe o dispositivo na platina. Foque na membrana ajustando as posições no plano e vertical do dispositivo mecânico com um controlador de platina do microscópio no bloco de entrada de destino.

Insira um valor de contagem do motor, que corresponde ao nível de deformação desejado a ser aplicado. Em seguida, defina o valor no bloco de entrada de velocidade para 10 RPM ou menos para observar o mesmo campo antes e após a distensão, pois o campo pode se deslocar em relação ao objetivo do microscópio, e pode ser necessário ajustar a platina do microscópio durante a distensão. Após tudo estar configurado, clique em iniciar.

Comece fazendo ajustes no microscópio de força atômica. Aumente a altura da cabeça de FM até sua posição máxima na direção Z. Em seguida, coloque extensores nas pernas para elevar o plano em que a ponteira de FM entra em contato com a amostra.

Em seguida, remova a placa do scanner A FM e a objetiva desejada do microscópio. Adicione um espaçador à objetiva e, em seguida, recoloque-a no microscópio. Depois, posicione novamente a placa do scanner no A FM. A altura do espaçador dependerá da objetiva e da configuração específica do A FM, mas é necessário utilizar o espaçador se a imagem óptica for desejada, já que o plano de observação será deslocado na direção Z.

Em seguida, inicie o software de MFA (microscopia de força atômica), o software do microscópio óptico e todas as fontes de luz necessárias, incluindo a fonte de luz para medições de fluorescência. Monte um chip com uma alavanca em balanço que tenha uma rigidez de 200 piconewtons por nanômetro ou menos para medir o módulo de elasticidade de células vivas no MFA. Em seguida, alinhe o laser, depois monte uma lamínula de vidro no dispositivo e utilize-a para calibrar a rigidez da alavanca de acordo com as recomendações do fabricante. Imediatamente antes de montar a membrana no dispositivo de alongamento, corte as paredes até uma altura de cerca de um milímetro.

Isso reduz a interferência sofrida entre as paredes da membrana e a célula de carga. Em seguida, remova o meio de cultura celular e monte a membrana no dispositivo mecânico. Posicione o dispositivo mecânico com o adaptador no scanner utilizando o software.

Estique a membrana até o nível desejado de deformação trativa antes da nanoindentaçăo. Adicione 0,5 mililitros ou menos de meio sobre as células para mantê-las hidratadas, mas tenha cuidado para evitar derramamentos que possam danificar o scanner FM ou o microscópio. Em seguida, acople a viga de cantilever à membrana.

Siga o protocolo do dispositivo AFM específico para escanear áreas de interesse. Quando uma deformação de 20% foi aplicada a células semeadas na membrana, as células se deslocaram em 20%, conforme indicado aqui; o impacto das células na produção de espécies reativas de oxigênio foi medido em células epiteliais brônquicas utilizando um sensor cumulativo de superóxido mitocondrial, conforme descrito no protocolo textual complementar. Na ausência de estiramento mecânico, a produção de ERO não aumentou significativamente ao longo de 60 minutos quando um único estiramento de 17% foi aplicado e mantido.

Houve um aumento nas ERO mitocondriais que persistiu por mais 60 minutos com a incorporação do alongador mecânico ao microscópio de força atômica. O módulo elástico e os mapas de células epiteliais pulmonares de camundongo antes e após 10% de deformação sob tração foram obtidos das regiões delimitadas aqui. Foram registradas 300 curvas individuais de deflexão forçada em uma área de 40 por 40 micrômetros, mostrando uma mudança na localização das regiões de alto módulo com a aplicação da deformação.

Uma vez dominada, a distensão celular pode ser realizada em 15 minutos. Enquanto uma nanoindentação com FM pode consumir duas horas para ser realizada adequadamente, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manipular as células com cuidado, mas rapidamente, pois os resultados podem ser negativamente afetados pela agitação e exposição prolongada ao ar ambiente antes da obtenção dos dados. Não se esqueça de que trabalhar com um FM pode ser extremamente desafiador.

Precauções, como manter todos os líquidos longe do scanner, devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.