Name: Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a imagem de células vivas durante estiramento mecânico usando microscopia de força atômica. Este método permite observar em tempo real as respostas celulares à tensão mecânica em células epiteliais pulmonares de camundongo.

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Os autores gostariam que agradecer Fedex Instituto de Tecnologia da Universidade de Memphis para seu apoio. Os autores gostariam de agradecer os alunos do grupo de projeto sênior de design no Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn do departamento de Universidade de Tecnologia de Engenharia de Memphis para controle de motor e Dr. Teng Bin e Ms. Charlean Luellen por sua ajuda em cultura de células. Este trabalho foi apoiado por K01 HL120912 (ER) e R01 HL123540 (CMW).

1. Construção de membrana com Bem Paredes de Retenção de celular Meios de Cultura (ver Figura 1D para o produto final) <ol><li> Usando o polidimetilsiloxano (PDMS) folhas revestidas com colagénio I, cortar o contorno da membrana flexível com um bisturi ou uma matriz. </li><li> Colocar cada membrana numa placa de 60 mm de Petri para o armazenamento. </li><li> Criação de paredes: <ol><li> Misture PDMS em uma proporção de 10: 1 em peso, de elastômero A a elastômero B (agente de cura). </li><li> Pour 5 ml de PDMS totalmente misturadas em tubos de 50 ml. </li><li> Coloque tubos de 50 ml com PDMS não curado horizontalmente num forno de hibridação. </li><li> Utilizar a função do rotor para revestir as paredes interiores dos tubos a 8 rpm durante o tempo de cura. À TA, o PDMS será totalmente curado em 2 dias. </li><li> Remover o PDMS do tubo em uma capa de cultura de células estéril. </li><li> Usando uma nova lâmina de barbear, particionar o cilindro de PDMS em seções 4 mm de altura. </li><li> Coloque as seções, que servirão de wa membranalls, para um recipiente de placa de Petri, sem permitir que as paredes se tornar vincado. </li></ol></li><li> Escolher e um centro da parede de PDMS em uma membrana, mantendo os dois na placa de Petri. </li><li> Suavemente colocar PDMS não curado (10: 1) de razão no perímetro exterior da parede a ser utilizados como cola. Evitar a formação de lacunas entre a parede ea membrana uma vez que é lá para reter líquido. </li><li> Colocar cada placa de Petri contendo a membrana e completou coberto num forno a 70 ° C durante 24 horas para curar. </li></ol> 2. Correlação de rotações do motor com braçadeira de deslocamento ou Crescimento Radial de Calibração (Figura 2) <ol><li> Inicie o software que controla o motor. </li><li> Deslocar os grampos do dispositivo usando a configuração manual no software do motor. </li><li> Medir a distância e registrar a posição do motor de contagem entre opostos grampos em ambos deslocamento mínimo e máximo dos grampos. </li><li> Calcule a variação percentual no distance entre os grampos em função da contagem do motor (~ 0-75k contagens). Isto irá indicar a tensão máxima atingida no potencial de membrana. </li></ol> 3. Aplicação de estiramento na linha celular epitelial de pulmão do rato (MLE12) <ol><li> Semente MLE12 células em 2,5 milhões de células sobre a membrana flexível (Passo 1) por cavidade a ser confluente dentro de dois dias. A densidade de sementeira pode variar para diferentes tipos de células. </li><li> Certifique-se o actuador mecânico está numa posição completamente relaxado. <ol><li> Remover o meio de cultura de células. </li><li> Usando 1,5 milímetros punções, dois furos em cada um dos seis braçadeira (ver Figura 1D) separadores de membrana. O posicionamento radial dos furos determina a quantidade de pré-tensão da membrana inicialmente as experiências. Perfurar os orifícios com um raio de 20,5 mm nas abas de membrana se sem pré-tensão é desejado. </li><li> Posicione a membrana na maca com os buracos perfurados se alinhando com os pinos dentro dos grampos.Coloque grampos superiores no lugar. Aperte os parafusos, um por vez alternando os lados. </li><li> Adicionar 1 ml de meio de cultura de células. </li></ol></li><li> Colocar o dispositivo na platina do microscópio de centragem meio da membrana com o percurso da luz. </li><li> Use fita ou ímãs (se possível) para fixar o dispositivo para o palco. Uma vez fixo, o controlo (em paralelo com a membrana) e no plano vertical (direcção z) do dispositivo mecânico com o controlador de fase do microscópio. </li><li> Aplicar estiramento com o software fornecido pelo fabricante por meio do controle manualmente a posição e velocidade de rotação do motor 20. </li></ol> 4. Medição da mitocondriais Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) <ol><li> Uma vez que as células estão confluentes, adicionar 1-2 mL de MEMD com RT indicador superóxido mitocondrial (5 uM de concentração final) directamente nas células. </li><li> Incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Lavar as células suavemente três vezes com tampão aquecido num banho de água a37 ° C. </li><li> Imediatamente coloque a membrana flexível na maca (Passo 2.2) já em vigor sob um microscópio confocal vertical. </li><li> Adicionar 1 ml de DMEM com acesso médio de vermelho de fenol e 25 mM de HEPES. </li><li> Definir filtros de excitação / emissão de 510/580 nm. </li><li> Vários campos de imagem cada 15 min para criar o curso da produção de superóxido mitocondrial tempo desejado. </li><li> A partir de imagens capturadas, a intensidade de fluorescência registro histogramas a cada intervalo de tempo usando software capaz de quantificar a intensidade de fluorescência. </li></ol> 5. Aplicação de estiramento e Microscopia de Força Atômica (AFM) Observação: Essas etapas são fornecidas para um AFM específico e combinação microscópio óptico (Figura 4 e Lista de Materiais). <ol><li> Prepare o AFM para o experimento. <ol><li> Aumentar a altura da cabeça AFM para a sua posição máxima na direcção z. </li><li> Coloque extensores sobre as pernas da AFM paralevantar o avião no qual AFM cantilever contatos da amostra. O espécime e a cabeça AFM tem de ser levantada para acomodar a altura do dispositivo mecânico. </li></ol></li><li> Prepare o microscópio óptico (se disponível). <ol><li> Remova a placa de scanner de AFM. Remova o objetivo desejado. </li><li> Adicionar um espaçador para o objectivo. A altura do espaçador dependerá do objetivo eo AFM específico set-up, mas é necessário se imageamento óptico é desejada desde avião de observação será mudança na direção z de um montante igual à maca e altura adaptador (Figura 5A). Note-se que a AFM geralmente proporciona uma baixa ampliação de imagens a partir de um trajecto óptico de cima do dispositivo. </li><li> Monte o objectivo pretendido de volta em sua localização. Coloque o scanner de volta para a AFM. </li><li> Inicie o software AFM. Comece todas as fontes luminosas necessárias, incluindo a fonte de luz para medições de fluorescência. </li><li> Montar um chip com um cantilever queÉ conveniente que as medições desejadas. 200 pN / rigidez nm ou menos é preferida quando se mede o módulo de elasticidade de células vivas. </li><li> Alinhar o laser e calibrar a rigidez cantilever de acordo com as sugestões do fabricante em uma lamela de vidro montado sobre o dispositivo. </li></ol></li><li> Prepara-se uma membrana que no Passo 1, mas com as seguintes modificações. <ol><li> Imediatamente antes da montagem da membrana no dispositivo de alongamento, cortar as paredes de cerca de 1 mm de altura. Isto evita a interferência entre as paredes experimentado membrana e a célula de carga. </li><li> Montagem da membrana no dispositivo mecânico como descrito 3.2.1-3.2.3. </li><li> Remover o meio de cultura de células, para evitar danos AFM para o scanner, no caso de um derramamento. </li><li> Acoplar o dispositivo com um adaptador (Figura 5A). Coloque o dispositivo mecânico com o adaptador no scanner. </li><li> Distender a membrana para o nível de tensão de tracção desejada. </li></ol></li><li&gt; Nano-recuo de células esticadas. <ol><li> Adicionar uma limitada (&lt;0,5 mL) de volume da mídia sobre as células para evitar scanner de AFM ou danos microscópio devido a um derrame. </li><li> Envolver o cantilever com a membrana. </li><li> Seguir o protocolo do dispositivo de AFM em particular para verificar as áreas de interesse. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+new+opportunities+in+lung+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology.</a> J Biomech. 43, 99-107 (2010).</li>
<li>Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+CM+%22Comprehensive+Physiology%22">Comprehensive Physiology</a>. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Sensitivity+and+Mechanotransduction+during+Heart+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development.</a> Current Biology. 24, R495-R501 (2014).</li>
<li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475, 316-323 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell-surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force-induced+signal+transduction+in+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical force-induced signal transduction in lung cells.</a> Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).</li>
<li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in mechanotransduction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).</li>
<li>Chapman, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cyclic+opening+and+closing+at+low-+and+high-volume+ventilation+on+bronchoalveolar+lavage+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Car+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines.</a> Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).</li>
<li>Tschumperlin, D., Margulies, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+deformation-induced+injury+of+alveolar+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro.</a> Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).</li>
<li>Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+failure+in+ventilator-injured+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular stress failure in ventilator-injured lungs.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).</li>
<li>Roan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+alters+the+mechanical+properties+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).</li>
<li>Gamerdinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+load+and+mechanical+integrity+of+lung+cells+-+Experimental+mechanostimulation+of+epithelial+cell-+and+fibroblast-monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).</li>
<li>Hayashi, K., Naiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+remodeling+of+vascular+wall%3B+biomechanical+response+to+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).</li>
<li>Villemure, I., Stokes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+mechanics+and+mechanobiology.+A+survey+of+present+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding.</a> J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).</li>
<li>Waters, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+impose+prescribed+homogenous+strains+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells.</a> J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).</li>
<li>Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+simultaneous+live+cell+imaging+during+uni-axial+mechanical+strain+or+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression.</a> J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).</li>
<li>Dassow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+measure+mechanical+properties+of+pulmonary+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).</li>
<li>SmartMotor User's Guide v523. , Animatics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf ">http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf </a> (2011).</li>
<li>Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).</li>
<li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> J Physiol. 552, 335-344 (2003).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+single+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Pouvreau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+mouse+skeletal+muscle+are+produced+by+discrete+arrays+of+active+mitochondria+operating+coherently%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Yalcin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+on+epithelial+cell+injury+during+cyclic+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).</li>
<li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+claudin+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4.</a> J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).</li>
<li>DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+magnitude+and+frequency-dependent+actin+cytoskeleton+remodeling+in+alveolar+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um dispositivo único para imagens de células vivas durante estiramento mecânico foi desenvolvido; e este dispositivo foi usado em um protocolo para estudar epiteliais do pulmão mechanobiology celular. Em estudos preliminares, verificou-se que uma única estiramento realizada estimulou a produção de superóxido mitocondrial em células epiteliais brônquicas. Além disso, foi demonstrado que o aumento dos níveis de tensão mecânica causou danos directos para a integridade de uma monocamada de células epiteliais alveolares. </p...

As células são submetidas a cargas mecânicas em muitos tecidos, e este estímulo mecânico foi mostrado para promover a alterações dos padrões de expressão de genes, a libertação de factores de crescimento, citoquinas, ou remodelação da matriz extracelular e do citoesqueleto 1-4. Os sinais intracelulares transduzidas de tais estímulos mecânicos ocorrer através do processo de mecanotransdutores 5-7. No sistema respiratório, um resultado de mecanotransdutores é o aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e 8,9 citocinas pró-inflamatórias 10 em células epiteliais pulmonares, na presença de cíclica esforço de tensão. Uma forte evidência também sugere que a tensão de tracção excessiva leva a dirigir a lesão do epitélio alveolar, para além das respostas bioquímicas das células 11-14. Embora o foco é principalmente na resposta de células pulmonares a deformação mecânica, as vias induzidas por mecanotransdutores desempenhar um papel-chave nos basic função de muitos tecidos no corpo humano, incluindo a regulação do tónus vascular e 15 o desenvolvimento da placa de crescimento 16. O interesse crescente em mecanotransdutores resultou no desenvolvimento de numerosos dispositivos para a aplicação de cargas mecânicas fisiologicamente relevantes para células cultivadas e tecidos. Em particular, dispositivos de aplicação de um esforço de tensão, que é uma forma comum de carregamento mecânico experimentado pelo tecido, são populares 11,17-19. No entanto, muitos dos dispositivos disponíveis ou são concebidos como um biorreactor para aplicações de engenharia de tecidos ou não são favoráveis ​​para imagiologia em tempo real com estiramento. Como tal, existe uma necessidade para desenvolver ferramentas e métodos que podem visualizar as células e tecidos em tensão para facilitar a investigação das vias de mecanotransdutores. Aqui, um dispositivo de estiramento mecânico no plano foi concebido e protocolos foram desenvolvidos para aplicar multiple formas de estirpe para os tecidos e células, enquanto permitindo imagiologia das respostas bioquímicas e mecânicas em tempo real (Figura 1A-D). O dispositivo utiliza seis grampos espaçados uniformemente dispostas circunferencialmente de compreender uma membrana flexível e aplicar uma no plano, a distensão radial até aproximadamente 20% (Figura 1B). O dispositivo de accionamento pode ser colocado em uma incubadora de cultura de células por um período prolongado de tempo, enquanto o motor (Figura 1C) está posicionado do lado de fora da incubadora e controlada por software proprietário fornecido pelo fornecedor do motor. O motor é ligado a um controlador linear, o qual roda um ressalto interno, conduzindo os seis grampos esticadores uniformemente em tensão e relaxamento. Em adição ao dispositivo mecânico, membranas flexíveis personalizadas foram criadas a partir de membranas de cultura de células imediata disponíveis comercialmente para serem utilizados no sistema mecânico. Em seguida, as paredes circulares (com um diâmetro de aproximadamente28 mm) foram feitos e ligados para a membrana flexível, de modo que as células podem ser cultivadas apenas na região do perfil estirpe bem descrito. A fim de determinar se o posicionamento destas membranas no interior do dispositivo de accionamento proporcionaria deformação uniforme e isotrópico no centro da membrana flexível, a análise de elementos finitos foi realizada usando o software comercialmente disponível (Figura 1E-F). A membrana flexível foi modelada com condições de contorno simétricas e utilizando todos os elementos quadrilaterais para a malha. Os anéis concêntricos visto no gráfico de contorno da estirpe principal máxima mostrada na Figura 1F indicam a distribuição isotrópica da estirpe. A tensão experimentado por a membrana foi medida por gravar imagens de marcações através de carga (Figura 2). A Figura 2D mostra que a tensão média de membrana medido em direcções radiais e axiais era aproximadamente linearno que diz respeito ao motor aplicado conta-se a uma estirpe linear máxima de 20%. Não houve diferença significativa entre os níveis de tensão medidos durante a distensão em comparação com os medidos durante a retracção de volta para a posição de repouso. Em seguida, o deslocamento de células epiteliais brônquicas humanas (16HBE) e seus núcleos cultivadas sobre a membrana flexível costume foram medidos. Marcado por fluorescência (DAPI) núcleos das células 16HBE foram visualizados utilizando uma objectiva de 20x num microscópio confocal, enquanto que o deslocamento de células inteiras foi medida com imagens de contraste de fase gravados com um microscópio digital. Como pode ser visto na Figura 3, a tensão medida pelo deslocamento de núcleos foi semelhante ao medido por deslocamento de marcações na membrana, até ~ 20% de deformação linear. Isto confirma que a estirpe aplicada às membranas foi transmitida para as células aderentes. Os protocolos que descrevem a utilização do dispositivo personalizado em um microscópio tradicional e uma força atómica microscope são fornecidos nas seguintes etapas.

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34: Série 3400</td><td>MOOG Animatics</td><td>SM3416D</td><td>Motor integrado, controlador, amplificador, codificador e barramento de comunicações</td></tr><tr><td>Membrana Flexcell (Revestida com Colágeno I)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3.5"&nbsp; x&nbsp; 5.25"&nbsp; x&nbsp; 0.020"</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>10:1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td>DAPI mancha</td></tr><tr><td>MitoSOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Tiron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7389&nbsp;</td><td>Rótulo de superóxido mitocondrial</td></tr><tr><td>Inibidor de superóxido</td> <td>DMEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td>Qualquer tubo de centrífuga pode ser usado para criar uma área para imagens.</td></tr><tr><td>Forno de Hibridização</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>Células Epiteliais de Pulmão de Camundongo&nbsp;</td></tr><tr><td>Células Epiteliais Bronquiais Humanas</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2741</td> de<td></td></tr><tr> 16HBE<td colspan="4">AFM Indentation Experiments</td></tr><tr><td>Cantilever Beams para Sensores de Orçamento de Nano-indentação</td><td></td><td>Si-Ni30</td><td></td></tr><tr><td>AFM&nbsp;</td><td>Microscópio Olympus</td><td>Olympus MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>Asylum</td> Research <td>Microscópio Olympus</td><td>IX-71</td><td>Microscópio invertido com objetivas de 20X e 40X.</td></tr><tr><td>Pesquisa do asilo</td> <td>dos prolongamentos do pé do AFM</td><td>não disponível</td> microscópio <td>do AFM</td></tr><tr><td colspan="4" análises >Finite dos elementos</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" >Software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4" >Microscópios</td></tr><tr><td>Digital microscópio</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS XL Core</td><td>Inicialmente uma empresa independente, agora propriedade da Life Technologies.</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>Microscópio vertical de 2 fótons</td></tr></tbody></table>

imagens de células vivas durante mecânica estiramento

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Atualmente, há um interesse significativo em entender como as células e tecidos respondem a estímulos mecânicos, mas as abordagens atuais são limitadas em sua capacidade de medir respostas em tempo real em células vivas ou tecidos viáveis. Um protocolo foi desenvolvido com o uso de um atuador celular para distender células vivas crescidas ou tecidos ligados a um substrato elástico durante a imagem com microscopia de força confocal e atômica (AFM). Estudos preliminares mostram que o alongamento tônico das células epiteliais brônquicas humanas causou um aumento significativo na produção de superóxido mitocondrial. Além disso, usando este protocolo, as células epiteliais alveolares foram esticadas e fotografadas, o que mostrou dano direto às células epiteliais por hiperdistensão, simulando uma forma de lesão pulmonar in vitro. Um protocolo para conduzir o nano-indentation do AFM em pilhas esticadas é fornecido igualmente.

Espécies Reativas de Oxigênio e Deformação Estudos anteriores mostraram aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS) em vias aéreas e células epiteliais alveolares em resposta ao estiramento cíclico 21. Espécies reactivas de oxigénio incluem moléculas e radicais livres derivados de oxigénio molecular com alta reactividade com lípidos, proteínas, polissacáridos, ácidos nucleicos e 22-24. ROS servir como um sinal intracelular comum para regular a função de can...

Um novo protocolo de imagem foi desenvolvido usando um atuador mecânico acionado por motor personalizado para permitir a medição de respostas em tempo real à tensão mecânica em células vivas. Relevante para a mecanobiologia, o sistema pode aplicar deformações de até 20%, permitindo imagens quase em tempo real com microscopia de força confocal ou atômica.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

O objetivo geral do seguinte experimento é observar o papel da tensão mecânica na mecanobiologia celular em tempo quase real. Isso é alcançado primeiramente construindo um sistema com membranas flexíveis nas quais as células são cultivadas e esticadas. Em um segundo passo, estica-se a membrana para calibrar as contagens do motor com a deformação da membrana.Em seguida, células epiteliais pulmonares de camundongo são estiradas e os núcleos são visualizados. Para demonstrar que a deformação da membrana é transmitida às células, os estiradores são então incorporados ao microscópio de força atômica (AFM) para nanoindentação, com o objetivo de medir a rigidez das células individuais antes e após o estiramento. Os resultados mostram dano direto nas células devido ao estiramento aplicado.Também com base na imagem de fluorescência, demonstra-se que a produção de espécies reativas de oxigênio aumenta com a distensão. Bem, este método pode responder perguntas fundamentais na área da biologia mecânica pulmonar, como por exemplo se as células epiteliais podem ser lesadas pela ventilação mecânica. Este método pode fornecer informações sobre a biologia mecânica das células pulmonares e também pode ser aplicado a outros tecidos moles, como fatias de fígado ou de placa de crescimento.De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à combinação não convencional de ferramentas utilizadas nestes experimentos, como o microscópio de força atômica. Para começar, prepare uma membrana de PDMS revestida com colágeno, modificada para uso em cultura celular conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, semeie células epiteliais pulmonares de camundongo a uma densidade de 2,5 milhões de células por poço em uma membrana flexível, estéril e revestida com colágeno.Incube as células a 37 graus Celsius e 5%CO2 por dois dias até que as células atinjam confluência. Em seguida, utilize um punch de biópsia de 1,5 milímetro para fazer dois furos em cada uma das seis abas de fixação, a 20,5 milímetros do centro do conjunto, caso não se deseje pré-tração. E remova o meio de cultura celular.Certifique-se de que o atuador mecânico esteja em uma posição de deformação zero e posicione a membrana no estirador de modo que os furos coincidam com os pinos e as braçadeiras. Coloque as braçadeiras superiores e, em seguida, aperte os parafusos um de cada vez, alternando os lados. Adicione um mililitro de meio de cultura celular antes de colocar o dispositivo na platina do microscópio.Centralize o dispositivo no trajeto da luz. Em seguida, fixe o dispositivo na platina. Foque na membrana ajustando as posições no plano e vertical do dispositivo mecânico com um controlador de platina do microscópio no bloco de entrada de destino.Insira um valor de contagem do motor, que corresponde ao nível de deformação desejado a ser aplicado. Em seguida, defina o valor no bloco de entrada de velocidade para 10 RPM ou menos para observar o mesmo campo antes e após a distensão, pois o campo pode se deslocar em relação ao objetivo do microscópio, e pode ser necessário ajustar a platina do microscópio durante a distensão. Após tudo estar configurado, clique em iniciar.Comece fazendo ajustes no microscópio de força atômica. Aumente a altura da cabeça de FM até sua posição máxima na direção Z. Em seguida, coloque extensores nas pernas para elevar o plano em que a ponteira de FM entra em contato com a amostra.Em seguida, remova a placa do scanner A FM e a objetiva desejada do microscópio. Adicione um espaçador à objetiva e, em seguida, recoloque-a no microscópio. Depois, posicione novamente a placa do scanner no A FM. A altura do espaçador dependerá da objetiva e da configuração específica do A FM, mas é necessário utilizar o espaçador se a imagem óptica for desejada, já que o plano de observação será deslocado na direção Z.Em seguida, inicie o software de MFA (microscopia de força atômica), o software do microscópio óptico e todas as fontes de luz necessárias, incluindo a fonte de luz para medições de fluorescência. Monte um chip com uma alavanca em balanço que tenha uma rigidez de 200 piconewtons por nanômetro ou menos para medir o módulo de elasticidade de células vivas no MFA. Em seguida, alinhe o laser, depois monte uma lamínula de vidro no dispositivo e utilize-a para calibrar a rigidez da alavanca de acordo com as recomendações do fabricante. Imediatamente antes de montar a membrana no dispositivo de alongamento, corte as paredes até uma altura de cerca de um milímetro.Isso reduz a interferência sofrida entre as paredes da membrana e a célula de carga. Em seguida, remova o meio de cultura celular e monte a membrana no dispositivo mecânico. Posicione o dispositivo mecânico com o adaptador no scanner utilizando o software.Estique a membrana até o nível desejado de deformação trativa antes da nanoindentaçăo. Adicione 0,5 mililitros ou menos de meio sobre as células para mantê-las hidratadas, mas tenha cuidado para evitar derramamentos que possam danificar o scanner FM ou o microscópio. Em seguida, acople a viga de cantilever à membrana.Siga o protocolo do dispositivo AFM específico para escanear áreas de interesse. Quando uma deformação de 20% foi aplicada a células semeadas na membrana, as células se deslocaram em 20%, conforme indicado aqui; o impacto das células na produção de espécies reativas de oxigênio foi medido em células epiteliais brônquicas utilizando um sensor cumulativo de superóxido mitocondrial, conforme descrito no protocolo textual complementar. Na ausência de estiramento mecânico, a produção de ERO não aumentou significativamente ao longo de 60 minutos quando um único estiramento de 17% foi aplicado e mantido.Houve um aumento nas ERO mitocondriais que persistiu por mais 60 minutos com a incorporação do alongador mecânico ao microscópio de força atômica. O módulo elástico e os mapas de células epiteliais pulmonares de camundongo antes e após 10% de deformação sob tração foram obtidos das regiões delimitadas aqui. Foram registradas 300 curvas individuais de deflexão forçada em uma área de 40 por 40 micrômetros, mostrando uma mudança na localização das regiões de alto módulo com a aplicação da deformação.Uma vez dominada, a distensão celular pode ser realizada em 15 minutos. Enquanto uma nanoindentação com FM pode consumir duas horas para ser realizada adequadamente, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manipular as células com cuidado, mas rapidamente, pois os resultados podem ser negativamente afetados pela agitação e exposição prolongada ao ar ambiente antes da obtenção dos dados. Não se esqueça de que trabalhar com um FM pode ser extremamente desafiador.Precauções, como manter todos os líquidos longe do scanner, devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

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Isolamento de Células Endoteliais da Veia Samá Humana e Exposição a Níveis Controlados de Tensão de Cisalhamento e Estiramento

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