Rato Naïve CD4 ⁺ Isolamento de células T e In vitro Diferenciação em subpopulações de células T

O objetivo geral do procedimento a seguir é polarizar quatro células T positivas para CD virgens isoladas de linfonodos de camundongos e baços em subconjuntos distintos de T auxiliares. In vitro, isso é feito primeiro processando baços e linfonodos colhidos de camundongos adultos do tipo selvagem. Na segunda etapa, a população de células positivas para CD quatro é enriquecida pela separação de esferas magnéticas e, em seguida, classificada por sua expressão de marcador de células T ingênua.

Na etapa final, as células são tratadas com fatores ativadores de receptores de células T e citocinas polarizadoras para induzir sua diferenciação em várias linhagens T auxiliares. Em última análise, citometria de fluxo. Elis A e PCR em tempo real são usados para avaliar a eficiência da diferenciação de células T auxiliares.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células T auxiliares, como a expressão de moléculas específicas ou o tratamento com drogas específicas influenciam a natureza da resposta de uma célula T. Comece prendendo os membros de um camundongo C 57 preto de cinco a 10 semanas de idade na placa de dissecação e, em seguida, corte a pele longitudinalmente do ânus ao queixo, tomando cuidado para não perfurar o tecido peritoneal subjacente. Em seguida, prenda a pele e use uma pinça para agarrar o linfonodo e outra para separar o tecido de cada um dos locais indicados na imagem.

À medida que cada linfonodo é colhido, coloque-o em um prato de coleta contendo PBS suplementado com 1% de FBS ou PBS plus e, em seguida, abra cuidadosamente o peritônio e remova o baço. Coloque o baço no prato de coleta também e transfira o prato para um balde de gelo para enriquecer para o CD quatro células positivas. Divida os gânglios linfáticos do baço em dois pratos separados de 60 milímetros contendo três mililitros de PBS mais cada um usando uma pinça estéril.

Em seguida, coloque um quadrado de malha de náilon estéril sobre os baços e use o lado do polegar de um êmbolo de seringa para esmagá-los suavemente contra a malha até que quase todo o tecido entre em suspensão. Picare-a a suspensão algumas vezes para quebrar os aglomerados solúveis restantes e, em seguida, coloque um novo pedaço de malha de náilon sobre a abertura de um tubo cônico de 15 mililitros. Filtre a suspensão no tubo para remover quaisquer detritos restantes.

Agora repita a dissociação mecânica para os gânglios linfáticos e encha os dois tubos de células filtradas com PBS plus. Em seguida, inverta os tubos algumas vezes e gire as células. Suspenda novamente o grânulo linfático em dois mililitros de PBS.

Adicione um mililitro de gelado, uma solução de CK por camundongo ao pellet de células do baço. Após um minuto, pare a lise dos glóbulos vermelhos com 10 mililitros de PBS plus. Inverta o tubo e gire as células novamente.

Em seguida, ressuspenda o pellet do baço em mais 10 mililitros de PBS plus, adicione as células dos gânglios linfáticos e gire a suspensão de células agrupadas. Desta vez, ressuspenda o pellet em 15 microlitros de CD quatro esferas magnéticas diluídas em 85 microlitros de PBS plus por camundongo por 15 a 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, dilua as células em 10 mililitros de PBS plus.

Filtre a suspensão através de um filtro de náilon em um novo tubo de 15 mililitros e gire as células. Novamente, gire novamente o pellet em 100 microlitros de PBS plus por mouse e selecione positivamente para o CD quatro células positivas por seleção de esferas magnéticas de acordo com as instruções do fabricante. Depois de obter a fração de células positivas positivas do CD quatro, lave as células em 10 mililitros de PBS plus para separar a fração de células T positivas do CD quatro.

Em seguida, rotule as células com os anticorpos fluorescentes apropriados por 15 a 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro após a lavagem. Filtre as células rotuladas para remover quaisquer detritos e transfira-os para um tubo de fax no gelo e proteja-o da luz, classifique a população de CD quatro positivos, CD 25 negativos 62 L, CD 44 positivos em meio RPMI completo. Quando todas as células tiverem sido coletadas.

Lave as células T virgens em meio fresco e completo. Em seguida, ressuspenda o pellet e complete o RPMI, conte as células T virgens e ajuste a concentração para uma vez 10 elevado a seis células por mililitro para induzir a diferenciação in vitro do subconjunto T auxiliar. Em seguida, lave cada poço de placas de cultura de células previamente revestidas com anti CD três e anti CD 28 em um mililitro de PBS e placa estéreis sem FBS.

As células finalmente suplementam os meios de cultura com as citocinas apropriadas e anticorpos bloqueadores, conforme descrito na tabela, e incubam as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por quatro a cinco dias após quatro a cinco dias em cultura. A coloração intracelular de citocinas das quatro células T positivas CD das culturas diferenciadas in vitro de TH um, TH dois treg induzíveis e TH 17 pode ser realizada. Confirmar que cada subconjunto de células T exibe o perfil de citocinas esperado.

De fato, após 24 horas de reestimulação com anti CD três EISs, A mostra que os subconjuntos também exibem a produção extracelular correspondente das proteínas de citocinas expressas intracelularmente. A PCR em tempo real para fatores de transcrição específicos da linhagem verifica ainda mais os perfis de fatores de transcrição apropriados dos quatro subconjuntos de células T positivas para CD diferenciados in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e processar células espelhadas de linfonodos e baços para obter quatro células T auxiliares positivas para CD virgens.

Além disso, você poderá diferenciar essas células T em células TH um, TH dois TH 17 ou ireg.