Name: Rotulagem mediada por vírus e transplante de Medial ganglionar Eminence (MGE) Células para In Vivo Estudos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a transduzir viralmente células progenitoras GABAérgicas da eminência ganglionar medial (MGE) antes do transplante em córtex hospedeiro. Este método permite estudar interneurônios geneticamente modificados em ambiente mais natural.

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Este trabalho foi financiado por doações para JLRR de: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 e NIMH R37 MH049428. PRW foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan. SFS foi apoiada por F32 (MH103003).

Declaração de Ética: Os seguintes procedimentos foram aprovados pelo nosso protocolo da instituição e animal. Certifique-se de obter a aprovação de todos os procedimentos que envolvem cirurgias de sobrevivência antes de iniciar experiências e verificar todos os protocolos estão em dia. 1. Preparação Lentivirus (Passo Opcional) <ol><li> Dividir três placas de 10 cm de células HEK293T por cada lentivírus para ser feita, na presença de 10 ml de DMEM / FBS a 10%, e crescer até ~ 60-70% de confluência. Cultivar células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Transfectar as seguintes plasmídeos de ADN (10? G no total) para cada placa utilizando qualquer reagente de transfecção: 6,4 ug CAG-Flex-GFP (sequência de vector lentiviral vector de ADN fornecida na Tabela 1), 1,2 ug pMD2.G (codifica VSV-g), 1,2 ug pRSV-Rev, e 1,2 ug pMDLg / pRRE. Os três vectores lentivirais de embalagem estão disponíveis comercialmente (Tabela Nota: Esta abordagem particular utiliza lentivir 3ª geraçãovetores al mas vetores de 2ª geração e plasmídeos associados também irá funcionar. </li><li> Prepare um recipiente de resíduos contendo uma solução de água sanitária a 10% dentro de um BSL2 certificada capa de inativar quaisquer soluções ou dispositivos que contenham ou contatados lentivírus. Em seguida, remova completamente os media 4-6 horas após a transfecção para a solução de água sanitária, substitua com o mesmo volume de novas mídias, e permitir que as células a crescer. </li><li> Após 4 dias, recolher meios em tubos cónicos de 50 ml e centrifugar a 1000 xg durante 15 min para sedimentar os detritos celulares qualquer. Em seguida, filtrar o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 um. Qualquer filtro de baixa proteína de ligação, como PVDF, funciona bem. Cuidado: lugar tanto resíduos sólidos e líquidos viral na solução de água sanitária. </li><li> Carregar 30 ml de sobrenadante filtrado em tubos de ultracentrífuga e numa ultracentrífuga. Centrifuga-se a 100.000 x g durante 2,5 horas a 4 ° C. Abra os tubos de centrífuga em uma capa BSL2 e remover o sobrenadante para 10% Bleach. Adicionar ~ 100 ul de PBS para o pellet, que produz títulos de 1x10 ^ 7-8 unidades infecciosas / ml. Alíquota do dia e armazenar seguinte à -80 ° C. Alíquotas de lentivírus são estáveis ​​à temperatura de -80 ° C durante pelo menos seis meses. </li><li> Consideração importante: Muitas instituições têm agora núcleos virais. Adquirir vírus concentrado com um título mínimo de 1x10 7 infecciosas unidades / ml, para melhores resultados. </li></ol> 2. Ratos de Doadores para MGE Dissection <ol><li> Em primeiro lugar, estabelecer um acasalamento cronometrado entre uma linha Cre-expressando de interesse e quer um mouse tipo selvagem (WT) ou um rato que vai expressar um repórter após recombinação Cre-mediada. Nota: Muitas linhas de Cre-driver são transgênicos e são mantidos e criados no estado hemizygous. Assim, apenas metade dos embriões irá conter o transgene Cre. O ADN pode ser rapidamente preparados a partir dos embriões durante um curto de PCR para detectar o alelo Cre. Os embriões + Cre pode então ser colhida, de modo que apenas o tecido MGE do genótipo desejado é usado. Alternativamente, um repórter Cre-dependente pode ser usado, para selecionar os embriões para MGE dissecção e transplante. </li><li> Calcule qual dia corresponderá a E13.5. Se os animais foram pareados na noite anterior, no dia da ficha é de 0,5. Encomendar camundongos dura entrada grávidas ou uma fêmea com filhotes WT P1, a fim de ter tempo de pós-natal (P) 1 ratos no dia do tecido do doador será E13.5. Como alternativa, configurar esses acasalamentos em casa uma semana antes de emparelhar os animais doadores. Nota: A primeira estratégia de gerar tanto E13.5 e embriões P1 / filhotes para o mesmo dia é muitas vezes difícil de fazer de forma confiável. </li></ol> 3. Preparação dos meios de comunicação, ferramentas e equipamentos. <ol><li> Prepare os reagentes e ferramentas para preparação de células MGE (Tabela 2). <ol><li> Prepare uma superfície limpa e coloque forceps limpas, tesoura e uma faca ou microcirúrgica ou pinça fina (para dissecção dos tecidos preciso) na superfície. </li><li> Preparar a solução de sal equilibrada de Hank (HBSS), fou dissecação, e meio de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM) com 10% surem fetal bovino (FBS), durante a transdução. </li><li> Pré-incubar 20-30 ml de DMEM / FBS a 10% em uma temperatura de 37 ° C cultura de tecidos incubadora durante cerca de 1 h. A tampa deve ser solto para permitir a troca de gases e de equilíbrio do pH dos meios de comunicação. Nota: A pré-incubação de mídia podem ser preparadas imediatamente antes do início da dissecção. </li></ol></li></ol> 4. MGE celular Preparação <ol><li> Sacrificar o ratinho grávida de acordo com um protocolo aprovado animais e remover os embriões numa placa de Petri contendo 10 centímetros de gelo-HBSS frio. </li><li> Remover o cérebro de cada embrião usando um escopo de dissecação (fazer um de cada vez, deixando o resto dos embriões em gelada HBSS) e, em seguida, proceder para cortar o tecido MGE. Nota: detalhado abaixo, e na Figura 1, são passos importantes que mostram como remover a MGE. Além disso, a Figura 2 é um filme que mostra toda a dissecçãoprocedimento. <ol><li> Posicione o cérebro com o lado ventral para cima (Figuras 1A, A &#39;). Nota: também é bom ter o dorso virado para cima. Cortar o cérebro em metade ao longo do plano sagital para gerar duas peças. Um exemplo hemisected cérebro é mostrado (Figuras 1B, B &#39;), observe que aspectos ventrais da tampa do cérebro dorsal (o córtex sobreposta) e e cercam o tecido eminência ganglionar (GE). </li><li> Em seguida, com a mão dominante, segure o auxílio de pinças muito finas ou um stabknife (Tabela 2), enquanto que a imobilização do hemisfério com uma pinça na posse de uma mão não-dominante. (Aspecto medial do hemisfério deve ser voltada para cima). Desdobrar o dorsal e ventral de tecido com uma pinça e uma faca facada para revelar o tecido subjacente GE (Figura 1C e diagramado na Figura 1C). Nota: A remoção de alguns meios de comunicação do prato dissecção petri pode tornar mais fácil para estabilizar o tecido enquanto performing a dissecção MGE. </li><li> Faça cortes retos com o stabknife ou uma pinça fina para separar o CGE, LGE e tecidos do septo (ver exemplo cortes indicados por linhas quebradas vermelhas, as Figuras 1D e D &#39;). Estes cortes podem ser feitos em qualquer ordem. Nota: Imagine a MGE como uma &#39;caixa&#39; que é cortada para fora do tecido circundante. Fazer isso ajuda reproducibly fazer cortes semelhantes para cada dissecção, reduzindo a variabilidade nas dissecções de tecido. </li><li> Por fim, vire a MGE de lado e retire o fundo (o que foi o aspecto lateral do cérebro). Isto remove a zona do manto da MGE (descartar nas Figuras 1E e 1E &#39;) a partir do resto do MGE. O aspecto remanescente de MGE contém principalmente zona ventricular e porções zona subventricular da MGE, que contém quase todas as células progenitoras MGE. Continue com este tecido. </li></ol></li><li> Consideração importante: A adição do gel de silicone para o fundo de uma placa de Petri cAn servir como uma superfície excelente dissecação, pois protege as pontas delicadas de uma pinça e proporciona uma superfície macia para fixar o tecido com uma pinça. </li></ol> 4.3 estratégias adicionais para MGE dissecação. <ol><li> Cortar a pele do embrião utilizando fórceps como tesouras para remover rapidamente o cérebro. À medida que o embrião fixa no seu lado, manter o tecido na base da cabeça com as pinças utilizadas para fixar o tecido. Primeiro, corte anterior ventral para o cérebro e posterior ventral para o cérebro, e em seguida, conecte os dois cortes ao longo do lado do embrião. Em seguida, pegue o pedaço de pele e puxe-o sobre a parte superior do cérebro. O cérebro pode então ser rapidamente dissecado afastado do restante tecido. </li><li> Alternativamente, ancorar o aspecto posterior do cérebro inteiro atrás do córtex. Enquanto isso, segure cada hemisfério no aspecto caudal mais dorsal do córtex e rasgar o córtex longe do tecido ancorado em uma direção anterior. Desta forma, tanto cortices pode ser removido e os eminencias ganglionares bilaterais são revelados, ainda ligado ao resto do tecido preservando a anatomia medial-lateral. </li><li> Alterne para a facada-faca para fazer cortes precisos em todo o MGE em cada hemisfério. Utilize qualquer um jogo limpo separado de fórceps para recolher o MGE ou uma pipeta com uma grande ponta (ie., P1000). Nota: Mantenha o tecido coletado longe de todos os outros materiais dissecado, como alguns meios de comunicação social é inevitavelmente transferida quando a MGE é coletado. </li><li> Recolhe-se o MGE e colocar o tecido num tubo de recolha de 1,5 ml contendo DMEM / FBS a 10%, (um volume de 500 ul é suficiente para recolher os EGM). Repita para o outro hemisfério e colocar no mesmo tubo de coleta. Manter as amostras em gelo até todo o tecido é coletado. </li></ol> 5. Lentivirus rotulagem e Transplante <ol><li> Mova os tubos de tecido MGE em um BSL2 certificada capô e remova a mídia. Nota: AMGE tecido é suficientemente grande para ser visível a olho nu e vai assentar no fundo do tubo permitindo que os meios frios e poderem ser facilmente removidos cuidadosamente. </li><li> Adicionar ~ 500 ul de meio DMEM / FBS a 10%, que foi pré-incubada em um temperatura de 37 ° C incubadora de cultura de tecidos. Em seguida, adicionar polibreno para facilitar a transdução de cada tubo para uma concentração final de 8 ug / ml. Tritura-se o tecido MGE para criar uma suspensão de células simples, utilizando uma ponta de pipeta P1000. Finalmente, adicionar ~ 15-20 ul de lentivírus concentrou-se para cada tubo. </li><li> Consideração importante: A trituração de 10-12 vezes é suficiente para quebrar o tecido MGE a partir de um único embrião, mas mais triturações pode ser necessária se vários EGM são agrupados. Experimente diferentes condições de trituração para determinar o que funciona melhor. </li><li> Feche bem cada tubo, inverta para misturar, de lugar todos os tubos em um 37 ° C incubadora. Incubar as células em lentivírus durante pelo menos 30 minutos e até 1 hora. Tempos maiores resultaram em deviabilidade celular vincado. Inverta os tubos a cada 10 minutos até que o tempo acabou. </li><li> Após incubação com lentivírus, remover os tubos da incubadora e centrifugar a 700 xg durante ~ 3 min para sedimentar as células. Na capa BSL2, remover o sobrenadante e descartar em lixívia a 10%. Em seguida, adicionar 1 ml de DMEM / FBS a 10% e tritura-se o sedimento de 2-3 vezes para lavar, depois centrifugar de novo à mesma velocidade para sedimentar as células. Repita esta lavagem passo 2-3 vezes mais para remover o excesso de vírus. Nota: executar os passos de centrifugação a 4 ° C, no entanto, reduziu a viabilidade não foi observada quando rodadas curtas são realizados à temperatura ambiente. </li><li> Após a lavagem final, retire o máximo de mídia quanto possível e colocar cada tubo em gelo. Devido aos meios de comunicação residual sobre os lados do tubo, ~ 2-3 uL de meios vai terminar cobrindo o pellet celular no momento em que o procedimento de transplante começou. </li></ol> 6. Transplante e Validação <ol><li> Adquirir filhotes P1 hospedeiras e preparar o procedimentoa área por baixo de pulverização com 70% de etanol. Para manter a esterilidade durante o procedimento, recomenda-se realizar esses procedimentos em uma sala dedicada procedimento limpo. Além disso, use um instrumentos cirúrgicos autoclavada esterilizar superfícies que os filhotes estarão em contato com a utilização de 70% de etanol. Um exemplo de equipamento representativo necessário para realizar os transplantes e uma área procedimento representativo é mostrado na Figura 3. </li></ol> Nota: Embora este procedimento é uma injecção de pequenos volumes, e não um procedimento cirúrgico, que exigiria uma incisão, ferida aberta ou suturas, é ainda recomendado que um novo micropipeta é utilizado para cada rato para ser injectada. As micropipetas são esterilizada pelo calor quando puxada e chanfrado numa superfície que foi pulverizada com etanol a 70% a ser armazenado num contentor selado. <ol><li> Gerar micropipetas para ter um diâmetro na ponta entre 40-80 mm. Seguindo estas dimensões irá produzir óptimaresultados. Calor esterilizar as micropipetas quando puxado e chanfrado sobre uma superfície e spray com etanol 70% antes de guardar as micropipetas em um recipiente fechado. Observação: Como alternativa, se o acesso aos dispositivos necessários para criar estas agulhas (Tabela 2) é limitativo, utilizar qualquer outro dispositivo de injecção. No entanto, estes podem não ser tão adequados como as micropipetas devido a diferentes diâmetros. </li><li> Elaborar óleo mineral em uma seringa de 1 ml, e com uma agulha de 30 G 1/2, encher a pipeta de vidro completamente com óleo mineral. Em seguida, monte o êmbolo para o dispositivo estereotáxico, em seguida, anexar a pipeta de vidro para o dispositivo estereotáxico e carga para o êmbolo. Usando a unidade hidráulica, mover o êmbolo na metade do caminho para a pipeta de vidro, remoção de óleo mineral que sai com uma toalha de papel limpa limpa. <ol><li> Como alternativa ao uso de uma seringa, submergir a extremidade traseira da pipeta em óleo mineral, sendo preenchido por acção capilar. Para evitar bolhas de ar na pipetae, manter uma pressão positiva na seringa até completamente para fora da pipeta de vidro. Nota: Outros dispositivos podem ser utilizados para o transplante com sucesso células MGE 14. Qualquer dispositivo que pode entregar um volume menor ou perto de 100 obras nl bem para este procedimento. </li></ol></li><li> Em seguida, use uma toalha de papel estéril, ou qualquer material absorvente, com o canto torcido em uma ponta fina para remover delicadamente o excesso de mídia acima do pellet celular MGE. Este passo concentra a densidade de células, de modo que o volume de injecção mais pequenos podem ser atingidos. Em seguida, utilizar um volume baixo (P2 é o preferido) a pipeta para desenhar-se lentamente o pellet celular e tritura-se 1-2 vezes antes de passar a suspensão de células para uma superfície hidrofóbica. O volume deve ser um pouco menos de 1 ml. Mover a ponta da agulha no interior da suspensão de células e o uso da unidade hidráulica, chamar-se a suspensão de células para a pipeta. </li><li> Anestesiar um filhote P1 via hipotermia (embrulhe em uma luva de látex e colocar em gelo durante ~ 2-4 min).Verifique se há eficácia da anestesia com um estímulo nocivo. Aperte a pele entre os dedos dos pés com uma pinça fina: o filhote deve ser responder se beliscou. Em seguida, coloque o filhote em um molde que está sob o dispositivo de injecção, em seguida, fazer a pele firmemente puxando para trás a pele da cabeça e prenda com fita do laboratório padrão. Nota: Enquanto a hipotermia é muito eficaz em ratos neonatais e resulta em baixa taxa de mortalidade, os procedimentos devem ser feitos rapidamente, como filhotes começará a se recuperar em menos de 10 min. Além disso, 4 min em gelo é um limite superior do que pode ser tolerado. Tente apenas induzir hipotermia uma vez se for necessário um tempo maior para injectáveis. No entanto, se um filhote de cachorro recupera cedo, primeiro permitir que o filhote de cachorro para se recuperar totalmente antes de induzir hipotermia novamente. Além disso, só induzir hipotermia mais uma vez para efectuar injecções. Os filhotes de cachorro vai se recuperar dentro de 5-10 min de hipotermia. Isso pode ser facilitado, colocando os filhotes com maca e mãe ou colocando o filhote em um surfac quentee para se recuperar. </li><li> Usando um dispositivo estereotáxico, posicionar a ponta da pipeta de vidro sobre a superfície sobre a cabeça do filhote, perpendicular à superfície da cabeça. Quando a pipeta está em contato com o chefe, considere isso como &#39;0&#39;. Em seguida, empurrar a pipeta através da superfície da pele e do crânio para o córtex, e, em seguida, inserir retrair a pipeta ~ 2 vezes antes de parar. Para um óptimo de células alvo para o neocórtex, injecções são realizadas quando a micropipeta está a uma profundidade de 0,1 mm. No entanto, este deve ser otimizado pelo utilizador (ver nota abaixo). Nota: Enquanto esta profundidade atinge de forma confiável as camadas mais profundas neocortical com os dispositivos descritos acima, algumas profundidades devem ser testados determinada empiricamente. Além disso, uma variedade de diferentes profundidades em rostro-caudal e médio-lateral posição deveria ser testado para se determinar que profundidade é óptima em cada local. Além disso, a punção inicial deve ser rápida, pois a penetração lenta no neocórtex diminui a capacidade de cleanly penetrar no tecido. Tente diferentes velocidades quando a primeira partida este procedimento para descobrir o que funciona melhor. Além disso, para as coordenadas de teste, não há nenhum substituto real para usando células marcadas, como corantes têm sido pouco confiável para indicar posição. </li><li> Uma vez que a agulha esteja em posição, rodar o dispositivo hidráulico para fazer avançar o êmbolo para a pipeta de vidro, que empurra um volume definido da suspensão celular no córtex. Injectar 50-70 nls por site. Repita este procedimento em 3-6 locais diferentes em diferentes níveis rostral-caudal se o objetivo é a obtenção de uma ampla distribuição de células de todo o neocórtex. Nota: Volumes de 100 nl ou maior pode causar lesões e levar a grandes aglomerações de células injectadas que não migrem para fora de forma eficiente no local da injecção. Assim, o volume de injeção de menores (~ 70 nl ou menos) são ótimas, mais de mais sites se o tempo permitir. </li><li> Quando as injeções são concluída, remova o filhote do palco e marcá-lo (recorte dedo do pé é uma maneira confiável para identificar o pups mais tarde). Uma vez que o filhote se recuperou e é capaz de se mover por conta própria (o que ocorre dentro de minutos de removê-los do palco), colocá-lo de volta com a mãe e ninhada. Nota: Uma vez que este é um procedimento minimamente invasivo, não existem procedimentos pós-cirúrgicos, uma vez que o filhote está se movendo livremente e aquecido. No entanto, os filhotes devem ser verificadas, não só após o procedimento, mas também no dia seguinte para garantir que eles não têm sinais de deterioração da saúde. </li><li> Antes de iniciar o procedimento na próxima cachorro, pulverize a área com etanol 70% para manter uma estéril área de trabalho. Permitir que os filhotes injectados para desenvolver e avaliar em seguida o tecido no estádio de desenvolvimento apropriado (s). </li></ol>

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<li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O uso de GABAergic precursores Interneuron cortical das eminências ganglionares embrionárias (BEE) para terapias à base de células está mostrando a promessa para muitas condições 12 -1 4. São necessárias técnicas moleculares precisos para acompanhar e expressar genes de interesse em subgrupos Interneuron específicos. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a marcação das células embrionárias com lentivírus MGE antes do transplante e mostrar como esta técnica pode ser utilizada para expressar genes de ...

GABAergic interneurons corticais compreendem ~ 20-30% dos neurônios no neocórtex de mamíferos, enquanto o restante corresponde a excitatórios, neurônios principais glutamatérgicos. Interneurons são altamente diversificada em propriedades eletrofisiológicas, axônio e dendritos e morfologia sináptica alvo 1, e os desequilíbrios em tom excitatório / inibitória são hipoteticamente subjacentes alguns fenótipos de distúrbios neurológicos / neuropsiquiátricos, incluindo autismo, esquizofrenia e epilepsia 2. O objetivo geral do protocolo aqui descrito é o de proporcionar um meio para modificar de forma eficiente geneticamente GABAergic progenitores Interneuron corticais antes do transplante para análise in vivo. Interneurons Cortical GABAergic nascem nas eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE, respectivamente) 3,4, bem como a área pré-óptica 5. Progenitores Interneuron corticais submetidos a migração tangencial de longa distância seguidopela migração radial para alcançar os seus objectivos finais. Após a chegada ao seu destino, estes interneurônios corticais deve integrar corretamente na rede neuronal existente, e cada subgrupo interneuron única contribuirá para circuitos cortical de maneiras específicas. Quatro subgrupos principais podem ser distinguidos por meio de marcadores moleculares: MGE-derivado de somatostatina (SST) + e parvalbumina (PV) + subgrupos, e peptídeo derivado CGE-intestinal vasoactivo (VIP) e Reelin + +; - SST 6 subgrupos. Diferentes subgrupos Interneuron corticais nascem ao longo de diferentes tempos durante o desenvolvimento embrionário na CGE MGE e 7, 8. Estes e outros marcadores Interneuron GABAérgicos corticais foram usadas para gerar linhas de Cre-controlador específico para muitos destes subgrupos 9-11. O transplante de células progenitoras MGE emergiu como uma terapia baseada em células potencial para doenças que podem ser causadas por desequilíbrios tratarem excitação / inibição 12-24. Estes benefícios terapêuticos pode ser devido, em parte, à capacidade única de progenitores MGE (para dispersar, diferenciar e integrar um cérebro hospedeiro), ou potencialmente porque muitos peri-somáticas PV inibidora + células são derivadas do MGE. MGE células também podem ser rapidamente e eficientemente transduzidas com lentivírus antes do transplante 15, permitindo que as células que são geneticamente modificadas in vitro para ser estudada in vivo. A justificativa para o desenvolvimento desta abordagem foi a de superar obstáculos em estudar GABAergic desenvolvimento interneuron cortical e maturação. Em particular, o transplante MGE permitiu aos pesquisadores para estudar o desenvolvimento de células mutantes in vivo, quando o rato mutante forma teriam morrido em um ponto de tempo inicial. Além disso, através da introdução de genes de interesse antes do transplante, os efeitos de genes específicos em um fenótipo mutante pode ser avaliado em um efforma icient. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para transdução de células MGE com lentivírus antes do transplante. Além disso, mostramos como essa técnica pode ser adaptada para expressar um gene de interesse em subgrupos específicos Interneuron a partir de um grupo heterogêneo de precursores Interneuron corticais, usando uma combinação de lentivírus de expressão Cre-dependentes e disponíveis linhas de rato Cre-driver. Além disso, este protocolo introduz técnicas e uma plataforma para pesquisadores para modificar geneticamente GABAergic precursores Interneuron cortical para estudos in vivo de uma forma única. Uma vantagem desta técnica em relação a outros métodos correntes é que as células transplantadas MGE irá dispersar longe do local de injecção. Além disso, ao contrário de injecções virais focais, depois que as células MGE dispersar sua morfologia é mais fácil de avaliar. Esta abordagem pode ser utilizada para estudar o efeito da introdução de genes de interesse em células de tipo selvagem ou mutantes, a introdução de um tipo de célula específicorepórter para avaliar a morfologia, ou, potencialmente, para estudar o efeito dos alelos da doença in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentes e equipamentos para transplante de células MGE</td></tr><tr><td>seringa de 1 ml</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson e empresa</td><td></td></tr><tr><td>30 1/2 G agulha</td><td>305106</td><td>BD, Becton Dickinson e empresa</td><td></td></tr><tr><td>Furo de precisão para entregar 5 &micro; l (vem com êmbolo)</td> <td>5-000-1005</td><td>Drummond empresa</td><td></td>científica</tr><tr><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo com suporte de lança **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Digital apenas para instrumentos estereotáxicos de ratos **</td><td>51725D</td><td>Stoelting company</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador fino hidráulico de óleo de eixo único **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Chanfrador rotativo revestido de diamante</td><td>feito internamente</td><td></td>Extrator de pipetas de agulha 730 Kopf <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> instrumentos</td><td></td></tr><tr><td>Óleo</td><td></td> mineral <td>Qualquer farmácia ou farmácia</td><td></td></tr><tr><td>Qualquer pipeta e pontas que possam reliaby medida 1 &micro; l de volume</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** Estes são os modelos específicos que usamos, mas muitas outras configurações devem funcionar</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentes opcionais (para fazer Lentivírus)</td></tr><tr><td>25 mm, 0.45 &micro; Filtro m</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultra-claros (25 x 89 mm)</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 (tamanho de 1,5 ml)</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Outros suprimentos disponíveis comercialmente</td></tr><tr><td>plasmídeo pMDLg/pRRE que codifica gag/pol</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pRSV-Rev que codifica Rev</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pMD2.G que codifica VSVG</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgene</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem mediada por vírus e transplante de medial ganglionar eminence (mge) células para<em&gt; in vivo</em&gt; estudos

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

GABAergic interneurons corticais, derivados da medial embrionário e eminências ganglionares caudal (MGE e CGE), são funcionalmente e morfologicamente diverso. Incursões foram feitas na compreensão dos papéis dos diferentes subgrupos Interneuron corticais, no entanto, ainda existem muitos mecanismos a serem trabalhados que podem contribuir para o desenvolvimento e maturação de diferentes tipos de células GABAergic. Além disso, a sinalização GABAérgica alterada pode contribuir para fenótipos de autismo, esquizofrenia e epilepsia. Linhas Cre-driver específico começaram a dividir as funções de subgrupos Interneuron únicas. Apesar dos avanços em modelos de ratos, muitas vezes é difícil de estudar de forma eficiente GABAergic progenitores Interneuron cortical com abordagens moleculares in vivo. Uma técnica importante para estudar a programação autónoma celular destas células é o transplante de células MGE em córtexes hospedeiros. Estas células transplantadas migrar extensivamente, diferenciar, umand funcionalmente integrar. Além disso, as células podem ser eficientemente MGE transduzidas com lentivírus imediatamente antes do transplante, o que permite uma grande variedade de abordagens moleculares. Aqui nós detalhe de um protocolo para a transdução de forma eficiente as células MGE antes do transplante para análise in vivo, utilizando linhas de Cre-driver disponíveis e vectores de expressão Cre-dependentes. Esta abordagem é vantajosa porque combina manipulação genética precisa com a capacidade destas células para dispersar após o transplante, que permite uma maior resolução específica do tipo celular in vivo.

Como as células MGE tem a capacidade única de migrar e integrar, quando transplantadas para um neocórtex anfitrião 16, eles proporcionam um excelente sistema modelo para a manipulação genética antes de estudos in vivo. Aqui, vamos mostrar como se pode isolar o tecido MGE a partir de embriões E13.5 (Figuras 1 e 2), que, em seguida, pode ser transduzidas com lentivírus in vitro ou de forma rápida antes do transplante para estudos in vivo. MGE Labeling via lentivírus f...

GABAergic progenitores Interneuron cortical dispersar, desenvolver e synaptically integrar em um córtex hospedeiro após o transplante. Estas células podem ser facilmente transduzidas antes do transplante para estudos in vivo de precursores GABAergic geneticamente modificados. Aqui, vamos mostrar técnicas de marcação virais alvo subgrupos Interneuron específicos usando linhas Cre existentes e repórteres Cre-dependentes.

Rotulagem mediada por vírus e transplante de Medial ganglionar Eminence (MGE) Células para<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudos

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

O objetivo geral deste procedimento é transduzir rapidamente células progenitoras de neurônios GABAérgicos do MGE com vírus antes do transplante em um hospedeiro para estudos in vivo. Isso é realizado primeiramente isolando células do MGE de um embrião doador positivo para Cree. O segundo passo consiste em rotular de forma rápida e eficiente as células do MGE isoladas com um vírus modificado para um propósito específico, como rotular um tipo celular específico.Em seguida, as células trans usa são transplantadas em um hospedeiro e deixadas se desenvolverem in vivo. Em última análise, a microscopia de cheiro ou outras técnicas podem ser usadas para avaliar as células transduzidas e transplantadas no momento apropriado. Uma das principais vantagens dessa abordagem em comparação com outras técnicas, como a injeção direta de vírus, é que as células MGE migram para longas distâncias a partir do local de injeção, que é um local de lesão, tornando possível estudar as células em um ambiente mais normal.Como as células da EGM são progenitoras da córtex e de neurônios, um tipo celular envolvido em transtornos neuropsiquiátricos como autismo, esquizofrenia e epilepsia, acreditamos que as técnicas descritas aqui ajudarão a elucidar os fundamentos biológicos de algumas dessas doenças neuropsiquiátricas. Além disso, esta técnica fornece uma maneira rápida de modificar geneticamente essas células para estudos in vivo. Após preparar o lentivírus e dissecar a EGM, conforme as instruções no protocolo escrito, colete ambos os hemisférios da EGM e coloque o tecido em dois tubos de coleta de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de DMEM com 10% de FBS. Mantenha as amostras no gelo até que todo o tecido seja coletado.Em seguida, transfira os tubos para uma capela de segurança biológica nível dois certificada. Aspire cuidadosamente o meio sem perturbar o tecido MGE sedimentado no fundo do tubo. Em seguida, adicione cerca de 500 microlitros de meio DMEM pré-aquecido com 10% de FBS.Adicione poli-cérebro a uma concentração final de oito microgramas por mililitro e triture através de uma ponteira P1000 até obter uma suspensão de células únicas. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros do lentivírus concentrado a cada tubo. Depois, feche cada tubo com segurança, inverta para misturar e coloque todos os tubos em um incubador a 37 graus Celsius.Incube as células com o lentivírus por pelo menos 30 minutos, mas não por mais de uma hora, já que tempos mais longos resultaram em diminuição da viabilidade celular. Inverta os tubos a cada 10 minutos após a incubação.Retire os tubos do incubador e centrifugue a 700 vezes G a quatro graus Celsius por três minutos. Para sedimentar as células na capela BSL dois, remova o sobrenadante e descarte em água sanitária a 10%. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM com 10% de FBS e retro.Resuspenda o pellet duas a três vezes para lavar após a centrifugação. Como antes, repita essa lavagem. Repita o passo mais duas a três vezes para remover o excesso de vírus. Após a lavagem final, remova o máximo de meio possível e coloque cada tubo no gelo devido ao meio residual nas laterais do tubo.Aproximadamente dois a três microlitros de meio acabarão cobrindo o pellet celular quando o procedimento de transplante for iniciado. Enquanto se garante a técnica asséptica durante todo o processo, aspire óleo mineral para dentro de uma seringa de um mililitro e, com uma agulha de 30 e meia polegadas, preencha completamente a pipeta de vidro com o óleo mineral. Em seguida, acople a pipeta de vidro ao aparelho estereotáxico e, com auxílio de um assistente, carregue o êmbolo utilizando o drive hidráulico.Mova o êmbolo cerca de metade do caminho para dentro da pipeta de vidro, removendo o óleo mineral que derrama com uma toalha de papel limpa. Em seguida, enrole o canto de uma toalha de papel estéril em uma ponta fina e use-a para remover delicadamente o excesso de meio acima do pellet de células mge. Isso concentrará a densidade celular, permitindo alcançar volumes de injeção menores.Em seguida, use uma pipeta P2 para aspirar lentamente o pellet celular e tritar uma a duas vezes antes de dispensar sobre uma superfície hidrofóbica. O volume deve ser ligeiramente inferior a um microlitro. Mova a ponta da agulha para dentro da suspensão celular e, utilizando o sistema hidráulico, aspire a suspensão celular para dentro da pipeta.Após anestesiar um espécime por hipotermia, verifique a eficácia da anestesia. Ao pinçar a pele entre os dedos dos pés com uma pinça, nenhuma reação deve ser observada. Em seguida, posicione o espécime sobre um molde localizado abaixo do dispositivo de injeção e estique a pele puxando-a para trás na região da cabeça e, então, fixe-a.Com fita laboratorial comum, manipule rapidamente o braço do estereotáxico para posicionar a ponta da pipeta de vidro sobre a cabeça do filhote perpendicularmente à superfície da cabeça. Quando a pipeta estiver em contato com a cabeça, considere essa posição como zero. Em seguida, empurre a pipeta através da superfície da pele e do crânio até o córtex.Em seguida, insira e retire a pipeta duas vezes antes de interromper o direcionamento de células para o neocórtex. As injeções são realizadas quando a micropipeta está a 0,1 milímetro. Uma vez que a agulha esteja posicionada, gire o dispositivo hidráulico para avançar o êmbolo dentro da pipeta de vidro e injete de 50 a 70 nanolitros por local.Repita este procedimento em três a seis locais diferentes em diversos níveis cordais rostrais. Se for necessária uma ampla distribuição de células transformadas por todo o neocórtex, ao concluir as injeções, remova o filhote da plataforma e marque-o conforme os procedimentos aprovados. Assim que o filhote se recuperar e for capaz de se mover por conta própria, devolva-o à fêmea lactante e ao restante da ninhada.Verifique as crias após o procedimento e no dia seguinte para garantir que não haja sinais de saúde em deterioração neste experimento. Células do E 13,5 somatostatina iris crew positivo AI 14 rebanho mais MGE foram transplantadas ou transduzidas com o lentivírus CAG flex GFP antes do transplante em neocórtices de tipo selvagem e avaliadas sete dias após o transplante. Essas imagens de imunofluorescência de neocórtices aos sete ou 35 dias após o transplante mostram células transplantadas representativas positivas para tomate provenientes de MGE; aqui são apresentadas imagens de imunofluorescência de células MGE transduzidas com o lentivírus CAG flex GFP e avaliadas sete dias pós-transplante.Este histograma mostra a quantificação da proporção de células positivas para tomate 2D que expressaram GFP sete dias após o transplante. Para as imagens a seguir, células do MGE foram coletadas de camundongos E 13,5 positivos para somatostatina IRIS CRE e transduzidas com um lentivírus CAG flex GFP, sendo então transplantadas para o neocórtex de camundongos hospedeiros selvagens P um antes da avaliação. Aos 35 dias após o transplante, esta imagem representativa do neocórtex de hospedeiros transplantados demonstra a expressão de GFP proveniente do vetor Flex.Aqui, o tecido foi corado para somatostatina para determinar a coexpressão de GFP e neurônios GABAérgicos que expressam somatostatina, e aqui o tecido foi corado para parvalbumina. Essas imagens sobrepostas, coradas conjuntamente com DAPI, demonstram o grau de colocalização de GFP com somatostatina e parvalbumina. Por fim, este histograma mostra a quantificação da proporção de células GFP que coexpressam somatostatina ou parvalbumina. Após os métodos descritos neste procedimento, outras ferramentas moleculares, por exemplo, um vírus associado ao AAV, também podem ser usadas para marcar células para estudos in vivo. Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso; precauções de segurança, como o uso adequado de EPIs e o trabalho em uma BSL, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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