Name: Medição de resistência de Estresse Oxidativo Caenorhabditis elegans Em placas de 96 poços de microtitulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a medir resistência ao estresse oxidativo em Caenorhabditis elegans usando ensaios em fase líquida em placas de 96 poços. Este protocolo permite avaliar taxas de sobrevivência de nematoides sob condições de estresse oxidativo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos o Centro de Genética Caenorhabditis para C. estirpes elegans. Suporte O financiamento foi fornecido pelo Instituto de Pesquisa Fox Terry. Agradecemos também o apoio concedido à EP da Rolande e Marcel Gosselin Graduate Studentship ea bolsa de formação CIHR / FRSQ em FRN53888 do Programa Integrado de Formação McGill Cancer Research investigação do cancro.

1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Preparação da mídia para C. crescimento elegans (neste caso, os animais selvagens e animais flcn-1 (ok975) mutantes). <ol><li> Prepare modificado apenas de Bacto-peptona (BOYM) mistura seca do Youngren contendo 5,5 g de Tris-HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl e 0,08 g de colesterol. Misture bem com agitação. NOTA: Esta mistura é suficiente para preparar 10 L de meio de MYOB. NOTA: placas normais meio de crescimento (NGM) poderia ser usado em vez de MYOB placas 27. No entanto, o mesmo tipo de placas deve ser utilizada para comparações válidas entre estirpes e entre as repetições independentes. Neste protocolo, nós só usamos placas MYOB. </li><li> Prepare 1 L de meio BOYM por adição de 6 g de BOYM mistura seca, 17 g de ágar e perfazer o volume de 1 litro com H 2 O e autoclave durante 45 min a 122 ° C. Verter em placas e deixar secar à temperatura ambiente durante 2 dias. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, inocular 100 ml de culture de meio de caldo LB com E. bactérias coli OP50 e crescer O / N a 37 ° C. </li><li> Placas MYOB semente com E. bactérias coli OP50. Deixe-a crescer à temperatura ambiente durante 48 horas. </li></ol></li><li> Preparação para a regulação negativa do gene usando RNAi <ol><li> Prepare MYOB placas RNAi-alimentação. Proceder como em passos 1.1.1 e 1.1.2. Após autoclavagem, permitir que o meio arrefeça até cerca de 55 ° C e adiciona-se 1 ml de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 1 ml de 100 mM de ampicilina. </li><li> Streak E. coli HT115 bactérias transformadas com um plasmídeo que exprime ou EV ou controlo RNAi flcn-1 específico em ampicilina (50 ug / mL) / tetraciclina (15 ug / ml) em placas de agar. Crescer a cultura O / N a 37 ° C. </li><li> Escolha colônias e inocular E. coli HT115 bactérias transformadas com um plasmídeo que exprime ou EV ou controlo flcn-1 RNAi específico e crescer a cultura em LB / ampicilina (50 ug / ml) e meio O / N a 37 &amp; #176; C. </li><li> Placas de sementes com E. coli HT115 EV bactérias ou HT115 flcn-1 bactérias de ARNi. NOTA: Manter placas de 48 horas à temperatura ambiente antes do uso. Se RNAi knockdown por alimentação é eficaz em, utilizar outros métodos de entrega da ARN-DS 28. </li></ol></li><li> Induzir o estresse oxidativo utilizando paraquat (PQ): <ol><li> Preparar tampão M9 por mistura de 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl e 0,25 g de MgSO 4 7 · H2O Traga até 1 L com água destilada. Solução em autoclave durante 45 min a 122 ° C e armazenar garrafas à TA. </li><li> No dia do ensaio, preparar a solução de M9 / PQ contendo. Para este protocolo, utilizar PQ 100 mM (0,1028 g de PQ dissolvido em 4 ml de tampão M9 preenche toda uma placas de 96 poços com 40 ul de M9 / PQ por poço). CUIDADO: PQ é um composto altamente tóxico e perigoso. Manusear de acordo com as orientações adequadas. NOTA: Quando a primeira a executar um novo scomboio ou de uma nova condição, recomenda-se a ensaio de sobrevivência em concentrações crescentes de PQ para determinar a melhor concentração de usar, a fim de matar os animais dentro de 7-10 horas. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Age-sincronizado L4 População <ol><li> Transferir 20 hermafroditas adultas grávidas a uma placa de MYOB fresco semeado com E. bactérias coli OP50. Prepare várias placas com base no número de vermes necessários durante o ensaio. </li><li> Permitir-lhes a pôr ovos durante 6 horas e em seguida, usando um worm fio de platina picareta remover as mães. Verificar as placas sob o microscópio para avaliar o número de ovos postos. </li><li> Permitir que os ovos para chocar e crescer a 20 ° C durante 48 h. Neste momento, os animais estão em um L4 / estágio final adulto jovem. Escolha mesmos animais de palco e transferir para os poços contendo a solução PQ. Observação: Uma vez que 48 horas de incubação só se aplica aos mutantes que crescem de forma semelhante aos animais de tipo selvagem, que é importante monitorizar de desenvolvimentotaxa de mutações recentemente testados para garantir que está de acordo com a taxa de desenvolvimento de tipo selvagem, de outra forma, outras linhas de tempo deve ser utilizado. </li><li> Alternativamente, a utilização de técnicas de sincronização. Gerar população sincronizada de vermes larvas L1 utilizando solução de hipoclorito (25 ml de água, 125 ml de hipoclorito de sódio a 5,25%, 50 ml de NaOH 4 M; embrulhar garrafa com folha de alumínio para isolar da luz). No entanto, para este ensaio, não é recomendável, uma vez que o branqueamento intenso pode afectar o comportamento dos animais durante o ensaio. CUIDADO: Manusear solução de hipoclorito de acordo com as diretrizes. NOTA: Ao usar o RNAi para regular para baixo o gene de interesse, sincronizar os hermafroditas, como descrito na seção 2, com excepção da transferência das mães para placas de RNAi semeados com as bactérias específicas de RNAi. Quando o knockdown com o RNAi é fraca, recomenda alimentação para várias gerações. </li></ol> 3. Realização do Estresse Oxidativo Resistência Ensaio &lt;/ P&gt; <ol><li> Pipetar 40 ml da solução de 100 mM de PQ (preparada) a cada poço de uma placa de 96 poços. Utilize pelo menos 12 poços com réplicas de todas as condições (tratamento, mutante, etc.). Usando um verme picareta fio de platina, transferir 5-8 animais larvas L4 para cada bem indicando o horário de início e fim do tempo. </li><li> Ao iniciar uma outra condição, anote o horário de início e fim do tempo. Colocar a placa a 20 ° C no tempo de incubação entre transferindo os vermes e marcando animais mortos uma hora mais tarde a partir da hora de início. </li><li> Utilizando o microscópio de dissecação, a contagem de sobrevivência a cada hora. Agite ligeiramente a placa antes de iniciar a contagem. Indique vermes que não se movem, mesmo após avistar uma luz de alta intensidade, como animais mortos. Além disso, indique o número de animais vivos. NOTA: Olhando forma verme, caudas e movimento da cabeça em alta ampliação, ajudar a determinar de vermes mortos vivos. </li><li> Repita este passo a cada hora até que a maioria dos worms estão mortos. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Determinação da Sobrevivência Percentagem em cada tempo de Ponto <ol><li> Calcular o número total de animais por estado somando o número total de animais transferidas para cada poço. Ignore os animais que estão danificados ou mortos após a transferência. </li><li> Para cada ponto de tempo, calcular o número total de animais mortos por condição (soma de animais mortos nos 12 poços). Para cada ponto de tempo, calcular a percentagem de morte (número de animais mortos, dividido pelo número total de animais e multiplicado por 100) e percentagem de sobrevivência (100 menos a morte por cento). </li><li> Repetir este ensaio pelo menos três vezes independentes. </li></ol>

<ol><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).</li>
<li>Alfadda, A. A., Sallam, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in health and disease.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 936486(2012).</li>
<li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidants%2C+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li>
<li>Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+the+key+players+in+the+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases.</a> Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).</li>
<li>Gandhi, S., Abramov, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+oxidative+stress+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration.</a> Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010(2012).</li>
<li>Trushina, E., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases.</a> Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).</li>
<li>Touyz, R. M., Briones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+vascular+biology%3A+implications+in+human+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension.</a> Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Sosa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+cancer%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and cancer: an overview.</a> Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+Causal+or+Casual+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).</li>
<li>Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+controls+stress+response+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity.</a> J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).</li>
<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).</li>
<li>Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+under+stress%3A+C.+elegans+stress+response+and+its+relevance+to+complex+human+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging.</a> Trends Genet. 29, 367-374 (2013).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22Practical+approach+series%22">Practical approach series</a>. , Oxford University Press. 282(1999).</li>
<li>C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn+to+the+worm%21%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Turn to the worm!</a> Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).</li>
<li>Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+nematode+orthologs--lessons+from+the+analysis+of+1800+human+genes+and+the+proteome+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 238, 163-170 (1999).</li>
<li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+in+Caenorhabditis+elegans%3A+impact+on+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research.</a> Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).</li>
<li>Moreno-Arriola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+A+Useful+Model+for+Studying+Metabolic+Disorders+in+Which+Oxidative+Stress+Is+a+Contributing+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor.</a> Oxid Med Cell Longev. , 705253(2014).</li>
<li>Possik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folliculin+regulates+ampk-dependent+autophagy+and+metabolic+stress+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival.</a> PLoS Genet. 10, e1004273(2014).</li>
<li>Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+cytotoxicity+of+paraquat%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Prev+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanism of cytotoxicity of paraquat.</a> Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+is+dispensable+for+normal+animal+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metab. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Timmons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+methods+for+RNA+interference+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Delivery methods for RNA interference in.</a> C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).</li>
<li>Wang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Eyes+Absent+Ortholog+EYA-1+Is+Required+for+Stress+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance.</a> Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).</li>
<li>Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAD+Box+RNA+helicase+VBH-1+is+a+new+player+in+the+stress+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans.</a> PLoS One. 9, 97924(2014).</li>
<li>Ward, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+the+C.+elegans+acyl-CoA+synthase%2C+acs-3%2C+and+nuclear+hormone+receptor%2C+nhr-25%2C+cause+sensitivity+to+distinct%2C+but+overlapping+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses.</a> PLoS One. 9, 92552(2014).</li>
<li>Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+synaptic+nlg-1%2Fneuroligin+abundance+by+the+skn-1%2FNrf+stress+response+pathway+protects+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress.</a> PLoS Genet. 10, e1004100(2014).</li>
<li>Greer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in.</a> C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
<li>Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brivanib%2C+a+dual+FGF%2FVEGF+inhibitor%2C+is+active+both+first+and+second+line+against+mouse+pancreatic+neuroendocrine+tumors+developing+adaptive%2Fevasive+resistance+to+VEGF+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition.</a> Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).</li>
<li>Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+links+energy+levels+and+insulin-like+signals+to+lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans.</a> Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+AMP-activated+protein+kinase+AAK-2+is+phosphorylated+by+LKB1+and+is+required+for+resistance+to+oxidative+stress+and+for+normal+motility+and+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior.</a> J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).</li>
<li>Honda, Y., Honda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+daf-2+gene+network+for+longevity+regulates+oxidative+stress+resistance+and+Mn-superoxide+dismutase+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans.</a> FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).</li>
<li>Restif, C., Metaxas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+swimming+motions+of+C.+elegans+worms+with+applications+in+aging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Comput+Comput+Assist+Interv%22%5BJournal%5D)">Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies.</a> Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).</li>
<li>Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+automated+measurement+of+nematode+swimming+%28thrashing%29+without+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry.</a> BMC Neurosci. 10, 84(2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

C. elegans é um organismo modelo atractivo para estudar a resistência ao estresse oxidativo geneticamente in vivo, uma vez que podem ser facilmente cultivadas e rapidamente leva a um grande número de descendentes geneticamente idênticos. Vários métodos para medir a resistência de stress oxidativo têm sido anteriormente descrita e que se baseiam na suplementação de placas de cultura com várias fontes de ROS, como a PQ, rotenona, H 2 O 2, e juglona 25,26,29-32. Aqui nós d...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Em eucariotas, fosforilação oxidativa ocorrendo na cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria é o principal motor da produção de energia na forma de ATP. Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um subproduto natural do processo. Apesar do seu importante papel como moléculas de sinalização, excessiva de ROS pode levar a danos no ADN, carbonilação de proteínas, e a oxidação de lípidos. Um desequilíbrio entre a produção de ROS e desintoxicação faz com que o stress oxidativo, o que conduz à depleção da energia, lesão celular, e provoca a morte celular 1,2. O estresse oxidativo contribui para o envelhecimento e para o desenvolvimento de muitas doenças potencialmente fatais, incluindo câncer, diabetes, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas 3-9. As células desenvolveram estratégias de defesa enzimáticos e não enzimáticos para manter os níveis de ROS adequadas e proteger os seus constituintes contra dano oxidativo 1,2. Superóxido dismutase (SOD) enzimas agem primeiro a convert superóxido a H 2 O 2, que é posteriormente convertida em água pela catalase ou enzimas peroxidase. Estratégias de defesa não enzimáticas incluem principalmente moléculas que reagem mais rapidamente com ROS, em comparação com macromoléculas celulares, protegendo os componentes celulares essenciais. Apesar do papel protetor da ROS desintoxicação enzimas, algumas moléculas ROS escapar dos mecanismos de defesa antioxidante e levar a danos oxidativos. Detecção, reparação e degradação dos componentes celulares danificados são estratégias essenciais da defesa durante o estresse oxidativo 1,2. Vias de sinalização envolvidas na resistência ao estresse e estresse oxidativo especificamente são altamente evolutivamente conservada 10,11. Ao contrário de experimentos de cultura de células, onde as condições organismal são apenas parcialmente reproduzido, o estudo do estresse oxidativo em organismos modelo 12,13 tem um grande significado. C. elegans é um nematóide de vida livre que pode ser fácil e barata cultured em um gramado bacteriana no meio de ágar. É pequeno no tamanho (cerca de 1 mm de comprimento) e, normalmente, cresce como um hermafrodita auto-fertilizar, o que facilita as manipulações genéticas. Tem um ciclo de vida rápido e uma alta capacidade reprodutiva, produzindo cerca de 300 descendentes por geração, tornando-se uma ferramenta poderosa para executar telas genéticos de larga escala 14. A C. elegans genoma está completamente sequenciado e 40-50% dos genes é previsível que sejam homólogos de genes associados a doenças humanas 15-18. O knockdown de genes de interesse utilizando RNAi é rápida e fácil em C. elegans. Gene para baixo regulamento poderia ser alcançado através da alimentação de animais a E. bactérias coli que abrigam um plasmídeo que expressa o ARN de cadeia dupla que tem como alvo o mRNA de interesse 19. Portanto, a determinação da função do gene usando telas de RNAi em grande escala tem um grande impacto na compreensão das doenças humanas, incluindo câncer 20,21. Estudos de Oresistência ao estresse xidative em C. elegans levaram à identificação de mecanismos conservadas de resistência ao stress oxidativo 13,22. Algumas vias são identificadas vias comuns que modulam a longevidade e resistência a outros tipos de stress, bem como a hipóxia, calor, e stress osmótico. Estas vias incluem a sinalização de insulina, a sinalização TOR, e autofagia. Outras vias importantes envolvem desintoxicação de ROS como enzimas superóxido dismutase e enzimas catalase, ou na reparação de danos, tais como proteínas de choque térmico e acompanhar 11,13,22. Este protocolo descreve como para determinar a resistência ao stress oxidativo de C. elegans em líquido. Nós usamos flcn-1 (ok975) e animais de tipo selvagem para demonstrar o protocolo já que mostramos anteriormente um aumento da resistência ao estresse oxidativo após a perda de flcn-1 (ok975) em C. elegans 23. Também mostraram que este aumento da resistência dependeem AMPK e autofagia, um eixo de sinalização que melhora bioenergética celular e promove a resistência ao estresse 23. PQ é um estressor oxidativo que interfere com a cadeia de transporte de elétrons para produzir espécies reativas de oxigênio 24. O mesmo ensaio pode ser adaptado e outras fontes de ROS ou compostos que geram ROS poderia ser utilizado tal como H 2 O 2 e rotenona. Ensaios semelhantes foram desenvolvidas em placas onde as baixas concentrações de PQ são utilizados 25,26. A vantagem deste teste é que ele é muito rápido, e os resultados podem ser obtidos em apenas um dia. Além disso, o volume total de líquido utilizado para realizar o ensaio de resistência ao estresse oxidativo em placas de 96 poços é baixo quando comparado com o volume utilizado para preparar-PQ contendo placas. Portanto, a quantidade de PQ usado é no ensaio de líquido é baixa, o que torna o ensaio pouco dispendioso e limita a produção de resíduos tóxicos. No entanto, limitações deste ensaio em comparação com ensaios em placa incluem o lack de alimento no líquido de ensaio e a menor concentração de oxigénio no líquido, em comparação com o ar. Estes são factores importantes que, em alguns casos, podem influenciar os resultados. Portanto, confirmando a reprodutibilidade utilizando outros métodos de resistência ao estresse oxidativo é recomendado para suportar os resultados obtidos neste ensaio.

<table><tbody><tr><td>Ágar grau bacteriológico</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Peptona bacteriológica</td><td>Oxóide</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio grau</td><td>biotecnológico Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de tris UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminometano</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Dicloreto de metil viologênio hidratado</td><td>Química de Aldrich</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 microscópio</td><td></td><td></td><td></td>zeiss estéreo</tr><tr><td>96 placa de microtitulação clara de 96 poços</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flcn-1 fonte de RNAi</td><td>Biblioteca</td><td></td><td></td> Ahringer</tr></tbody></table>

medição de resistência de estresse oxidativo<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; em placas de 96 poços de microtitulação

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

O stress oxidativo, que é o resultado de um desequilíbrio entre a produção e a desintoxicação de espécies reactivas de oxigénio, é um dos principais contribuintes para doenças humanas crónicas, incluindo doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, diabetes, envelhecimento e cancro. Portanto, é importante para estudar o stress oxidativo, não só em sistemas de células, mas também utilizando organismos inteiros. C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar a genética de vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que são altamente conservadas evolutivamente. Aqui, nós fornecemos um protocolo para medir a resistência ao estresse oxidativo em C. elegans em líquido. Reagentes Resumidamente, ROS-indutores, tais como paraquato (PQ) e H 2 O 2 são dissolvidos em tampão M9, e soluções são aliquotadas em cavidades de uma placa de microtitulação de 96 poços. L4 sincronizado / adulto jovem C. elegans animais são transferidos para os poços (5-8 animais / poço) e é medida a sobrevivênciaa cada hora até que a maioria dos worms estão mortos. Ao realizar um ensaio de resistência ao estresse oxidativo utilizando uma baixa concentração de estressores em placas, o envelhecimento pode influenciar o comportamento dos animais sobre o estresse oxidativo, o que poderia levar a uma interpretação incorrecta dos dados. No entanto, no ensaio aqui descrito, este problema é improvável de ocorrer uma vez que apenas L4 / animais adultos, jovens estão sendo usados. Além disso, este protocolo é barato e resultados são obtidos em um dia, o que torna esta técnica atraente para telas genéticos. No geral, isso irá ajudar a compreender vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que poderia ser traduzido em melhor caracterização de doenças humanas associadas a estresse oxidativo.

Comparando-tipo selvagem C. elegans para flcn-1 (ok975) animais mutantes Aqui utilizou-se 100 mM de PQ para determinar a resistência de tipo selvagem C. elegans animais em comparação com flcn-1 (ok975), que foi mostrado para resistir ao estresse oxidativo, calor e anoxia 23. Após 4 h de tratamento, 48,3% da do tipo selvagem sobreviveram, em comparação com 77,8% de sobrevivência em-um (flcn ok975) animais. Como esperado, flcn-1 (ok97...

C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar vias de transdução de sinal envolvidas na resistência ao estresse oxidativo. Aqui fornecemos um protocolo para medir a resistência ao estresse oxidativo de animais C. elegans em fase líquida, usando vários agentes oxidantes em placas de 96 poços.

Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em placas de 96 poços de microtitulação

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

O objetivo geral deste procedimento é medir o estresse oxidativo e a resistência de nematoides Caenorhabditis elegans em meio líquido. Isso é realizado primeiramente dissolvendo agentes indutores de ESP, como paraquat, em tampão M9 e distribuindo a solução em uma placa de microtitulação de 96 poços. O segundo passo consiste em transferir de cinco a oito nematoides sincronizados na fase final L4 para cada poço, utilizando pelo menos 12 poços por condição.Em seguida, utilizando um microscópio estereoscópico, o número de animais vivos e mortos é determinado a cada hora até que a maioria dos animais esteja morta. O passo final é calcular a porcentagem de animais que sobreviveram em cada ponto temporal para cada condição, pelo menos seis dias antes de realizar o ensaio de resistência ao estresse oxidativo. Prepare a mistura seca modificada young grins only bact PEPIN ou MYOB apenas para preparar o meio MYOB, misturando bem com agitação.Para preparar um litro de meio MYOB, combine seis gramas da mistura seca MYOB com 17 gramas de ágar e complete o volume para um litro com H2O. Autoclave por 45 minutos a 122 graus Celsius. Despeje o meio MYOB em placas e deixe as placas secarem à temperat

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste protocolo, apresentamos um método para...

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Este vídeo apresenta um ensaio de sobrevivência de curto prazo que testa um tratamento para toxicidade aguda ou testa uma cepa genética para resistência a uma condição tóxica. O protocolo de exemplo mostra um exemplo de ensaio de sobrevivência no qual os vermes são testados quanto à sua capacidade de resistir ao estresse oxidativo induzido pelo paraquat (PQ).

C. elegans Ensaio de sobrevivência: um teste de toxicidade de curto prazo

Este vídeo demonstra um ensaio de placa pontual adaptado para avaliar as respostas ao estresse oxidativo de cepas bacterianas. Algumas cepas produzem piomelanina, um pigmento antioxidante. Por outro lado, as cepas tratadas com um agente de teste, levando à redução da produção de piomelanina, exibem maior suscetibilidade ao estresse oxidativo, resultando em diminuição da viabilidade celular em comparação com as cepas produtoras de piomelanina.

Um ensaio de placa pontual para avaliar as respostas ao estresse oxidativo em cepas bacterianas

Aqui descrevemos um protocolo simples para produzir rapidamente centenas de ágar de mídia de crescimento nematoide, placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de Caenorhhabditis elegans por bem. Estas culturas são úteis para a seleção fenotípica de organismos toda. Nós focamos usando essas culturas para produtos químicos de tela para efeitos de pro-longevidade.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

O nemátodo Caenorhabditis elegans é um excelente modelo para dissecar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui descrito é um protocolo para infectar o verme com membros dos estreptococos do grupo mitis e determinar a ativação da resposta stress oxidativo contra H2O2 , produzido por este grupo de organismos.

Estudando estresse oxidativo causado pelo estreptococos grupo Mitis em Caenorhabditis elegans

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Aqui, protocolos padronizados são apresentados para avaliar a indução da resposta ao choque térmico (HSR) em elegans de Caenorhabditis usando RT-qPCR no nível molecular, repórteres fluorescentes no nível celular e a maioridade no nível do organismo.

Métodos padronizados para medir a indução da resposta de choque térmico em elegans caenorhabditis

Os micróbios intestinais podem impactar positiva ou negativamente a saúde de seu hospedeiro por meio de mecanismos específicos ou conservados. Caenorhabditis elegans é uma plataforma conveniente para rastrear esses micróbios. O presente protocolo descreve a triagem de alto rendimento de 48 isolados bacterianos quanto ao impacto na resistência ao estresse dos nematoides, usados como um proxy para a saúde dos vermes.

Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans servem como um excelente sistema de modelos com métodos robustos e de baixo custo para levantamento da vida saudável, vida útil e resiliência ao estresse.

Pesquisando métodos de baixo custo para medir a expectativa de vida e a saúde em Caenorhabditis elegans

Aprenda a medir resistência ao estresse oxidativo em Caenorhabditis elegans usando ensaios em fase líquida em placas de 96 poços. Este protocolo permite avaliar taxas de sobrevivência de nematoides sob condições de estresse oxidativo.

Medição de resistência de Estresse Oxidativo

Explorar mais vídeos