Name: In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprenda a rastrear células-tronco mesenquimais de medula óssea marcadas com tecnécio-99m em tendinopatia equina usando gama cintilografia. Este método permite monitorar a distribuição e sobrevivência celular de forma não invasiva.

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Os autores gostariam de agradecer o financiamento do Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) e VetCell BioScience Ltd, Reino Unido e da Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Espanha.

Os casos aqui descritos foram realizados seguinte permissão de Ética concedidas pelo Comité de animal Ética e Bem-Estar da Colegio de Veterinarios de Málaga, em Espanha, e do Royal Veterinary College, North Mymms, Reino Unido Os procedimentos utilizados nos cavalos são baseados em protocolos aprovados que são utilizado na clínica em cavalos que recebem terapias baseadas células-tronco que inclui sedação, aspiração de medula óssea, a injeção intra-tendinosa, perfusão regional, injecção intravenosa, pós-tratamento processual e dor gestão e monitorização após a implantação. 1. As modalidades-chave a ser feitas com antecedência <ol><li> Procure ética institucionais e bem-estar dos animais aprovação e aderir aos requisitos legais locais antes de iniciar o trabalho. </li><li> Buscar a aprovação institucional para trabalhar com radiação ionizante, como ditado pelos regulamentos locais e legais, incluindo o nível adequado de protecção do pessoal e do ambiente e à eliminação dos CONTAMnados resíduos. </li><li> Utilize os seguintes critérios de inclusão: cavalos presentes com uma lesão overstrain não traumática (tendinopatia ou desmopathy) para o tendão flexor digital superficial do membro torácico e lesões resultantes de um defeito dentro do tendão eo defeito é cercado por tendão e / ou paratenon intacta . Nota: O exame e diagnóstico para tais lesões ea preparação clínica dos cavalos para implante de células foi detalhado em outros lugares 6,15. Nota: O isolamento e expansão em cultura de BMMSC derivada da medula óssea de cavalos tem sido descrito anteriormente 6,16. O protocolo atual para injetar BMMSC para lesões TFDS no cavalo usa 10 milhões de células por ml de sobrenadante 4 autólogo de medula óssea (BMS) 16. </li><li> Use células que sofreram não mais de 4 passagens para implantação in vivo, para evitar potenciais fenótipo celular ou alterações genéticas associadas com o número elevado passagem cells. </li><li> Entregar o número necessário de células do BMS (dentro de 24 horas numa caixa fria a 4 - 8 ° C) para a clínica veterinária, onde o implante de células é para ser realizado. Nota: O uso clínico de células-tronco mesenquimais em sobrenadante de medula óssea é um processo patenteado de propriedade de ReCellerate Inc (EUA) e sua utilização pode exigir autorização. Nota: Tc-99m é um emissor gama (140 KeV), com uma meia-vida relativamente curta (6,0058 h, por conseguinte, cerca de 94% de ele decai para a sua forma estável de 99 Tc em 24 horas). A energia gamma o torna adequado para a detecção através de câmaras gama (cintilografia) e os resultados a curto meia-vida em tempo muito limitado exposição à radiação para o cavalo eo pessoal de manipulação animal. Este protocolo descreve a rotulagem no local de células usando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcado com Tc-99m (como pertecnetato de sódio)]. </li><li> Ordenar a Tc-99m fresco do fornecedor de tal forma que é entregue e usado para rotular a sagacidade célulashin 2 horas de eluição a partir do gerador de Tc-99m. Assegurar que o Tc-99m é fornecido como 1 GBq em (tampão padrão do fornecedor) a 1 ml de solução. </li><li> Use todos os buffers em RT. Realizar o processo de rotulagem, a implantação das células e imagiologia (cintigrafia gama) em um quarto de contenção isótopo com todo o equipamento limpa com álcool limpa antes do início do trabalho. </li></ol> 2. Preparação do Cavalo e ultra-sonografia do membro anterior Tendão <ol><li> Varreduras ficha de ultra-som na primeira admissão de lesão (quando é aspirado de medula óssea) e, em seguida, no ponto de tempo quando as células marcadas radioactivamente são injectados. </li><li> Execute ultra-sonografia e implante de células com o cavalo carrega o peso uniformemente em uma tenda e sob sedação pé (ao invés de anestesia geral). Administrar sedação utilizando uma mistura de HCl a detomidina e tartarato de butorfanol, cada um na concentração de 0,01 para 0,02 mg / kg IV. Nota: A recuperação é rápida e pós-cirúrgico não requer nenhum tratamentoconsiderações especiais. </li><li> Após anestesia perineural é aplicada (passo 2.6) no membro afectado, manter o cavalo na estação sob sedação para reduzir o movimento do cavalo durante o tratamento. Verifique visualmente o nível adequado de sedação julgados a partir da posição de cabeça baixa eo comportamento do cavalo e que o cavalo é confortável durante a injeção de células e os movimentos da câmara gama durante a aquisição das imagens cintilográficas. Nota: Não é necessário aplicar a pomada veterinário em olhos (para evitar a secura) porque sob sedação piscar não é afectado e o cavalo é capaz de manter a hidratação dos olhos. O acompanhamento após a implantação das células é não-invasiva (ultra-som e cintigrafia gama). </li><li> Clipe de perto o cabelo que cobre o tendão (com cortar cabelo cavalo), em seguida, limpar a área cortada usando uma combinação de um matagal cirúrgica clorexidina e finalmente álcool. </li><li> Aplique o gel de acoplamento acústico para a área emetodicamente varredura para gravar scans da região palmar metacarpo completo, níveis rotulados sequencialmente 1 - 7 17, com um transdutor linear (12 MHz ou similar) para obter série transversal on-incidência e imagens longitudinais. Armazenar as imagens digitalmente de modo a que a área de secção transversal e a zona de lesão máxima 4 pode ser obtida com o auxílio do software de análise de imagem. </li><li> Preparar a área que se sobrepõe à nervos palmares imediatamente distal ao carpo por injecção asséptica de anestésico local para assegurar a dessensibilização completa da pele que recobre o tendão e o tendão flexor digital superficial. Injectar 2 ml de mepivicaine tanto por via subcutânea e adjacentes aos nervos palmares (na sua localização sub-fascial) entre os tendões flexores e o ligamento suspensor imediatamente distai ao carpo em ambos os lados do membro. </li><li> Quando a verificação preliminar foi realizada preparar o local de implantação por esfregar a área com clorexidina s cirúrgicossolução crub por pelo menos 5 minutos e finalmente álcool com gaze embebida. Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica. </li></ol> 3. Tc-99m-rotulagem de Equine Células-Tronco Mesenquimais Nota: As etapas de rotulagem de células pode ser realizada durante a ultrassonografia do membro anterior como isso vai minimizar o decaimento do isótopo entre marcação celular e implantação de células marcadas no tendão. <ol><li> Remova a BMS a partir das células, uma vez que interfere com a absorção de isótopos. Para fazer isso, recuperar o frasco de BMMSC (10 milhões de células em 1 ml de BMS) da caixa de frio e sedimentar as células numa microcentrífuga a 350 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante cuidadosamente com uma agulha de 18G ou 19G (ligada a uma seringa de 2 ml), deixando uma pequena gota (≤0.1 ml) no tubo para ajudar a ressuspensão célula. Guardar o sobrenadante (BMS) num tubo de microcentrífuga estéril e manter em gelo para reutilização posterior. </li><li> Ressuspender as células em a gota residual do sobrenadante por FLIcking o tubo suavemente com os dedos (ao invés de vórtice) e deixar o tubo num suporte à temperatura ambiente. Assegurar que as células são completamente ressuspenso e que não existem aglomerados de células visíveis. </li><li> Prepara-se o Tc-99m como se segue. Transferir 1 ml de pertecnetato de tecnécio para um frasco de HMPAO utilizando uma seringa de 1 ml e agulha. Misture delicadamente mas completamente e deixe por 5 minutos atrás chumbo blindagem. Nota: Esta etapa pode ser feito enquanto as células estão girando no passo 2.1. </li><li> Adicionar toda a mistura Tc-99m-HMPAO utilizando uma seringa de 1 ml e agulha para as células e misturar suavemente. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente por trás protecção de chumbo. </li><li> Para os passos seguintes, utilizar uma pinça (ou um pedaço de papel de tecido) para abrir a tampa do tubo de microcentrífuga para minimizar a contaminação isotópica do polegar (enluvada) e subsequentemente outro equipamento. Use uma seringa de 2 ml e 21 G agulha para adicionar ou remover o tampão de lavagem. Nota: O uso de um monitor de campo isótopo é estimulado para monitorar a contaminação das superfícies e equipamentos. </li&gt; <li> Adicionar 1 mL de PBS à mistura-99m-HMPAO-célula Tc, fechar a tampa, agitar suavemente e centrifugação para sedimentar as células como no passo 3.1. </li><li> Retire cuidadosamente o PBS para um novo tubo (salvar esta atrás de blindagem de chumbo e etiqueta como W1). Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS fresco. Centrifugar o tubo e remover o sobrenadante como acima (e salvar este rótulo como W2). </li><li> Calcula-se a eficiência de marcação medindo as contagens em tubos de W1 e W2 e no sedimento celular. Fazer isso colocando cada tubos em uma dose isótopo instrumento calibrador Bem e gravar a radioactividade em contagens por minuto (CPM). Calcula-se a eficiência de marcação como (A radioactividade como CPM de células) / (A radioactividade das células sobrenadante +) x 100. </li><li> Volte a suspender as células completamente na PBS residual e, em seguida, adicione o BMS salvos a partir do passo 3.1. As células estão prontas para implantação intralesional. </li></ol> 4. Implantação de células Tc-99m-HMPAO-rotulados <ol><li> Implantação Intralesionalno tendão sob a orientação de ultra-som <ol><li> Lentamente introduzir uma polegada de 1,5 ou 2 (50 mm) de agulha de 20 G para a zona de máxima lesão da lesão numa orientação longitudinal, com o transdutor de ultra-sons, coberto de um campo estéril, em linha com a agulha de modo a que o comprimento da agulha pode ser identificados ultrassonografia e a ponta se a agulha está localizada com precisão no centro da lesão. </li><li> Usando blindagem apropriado, recolher as células em uma seringa de 2 ml (de bloqueio Luer, para minimizar o risco de contaminação externa e uma tampa na seringa de blindagem de chumbo), utilizando uma agulha de 20 G. Deite fora a agulha com cuidado para não perder nenhum fluido. Agora fixar a seringa com as células marcadas para a agulha pré-localizado no tendão. </li><li> Coloque a sonda de ultra-sons sob a agulha de modo que a agulha do aparelho no tecido é claramente visível. Injetar as células em um ritmo lento mas constante na lesão. Assegure-se que não há resistência à injecção. Se este for encontradocuidadosamente reposicionar a agulha sob a orientação de ultra-som. Verifique se o ejetando fluido na lesão é visível a imagem de ultra-som como fluido anecóica contendo bolhas de ar no hiperecogênicas. </li><li> Retirar a agulha e colocar imediatamente a pressão por cima do buraco da agulha para evitar perda de células injectadas e para minimizar a propagação de isótopo através da superfície externa do membro. Vestir imediatamente o membro com uma camada de atadura autoadhesive. O cavalo está pronto para cintigrafia gama. Execute este imediatamente. Nota: Após a injecção das células no tendão, adquirir uma contagem da seringa vazia e agulha para avaliar a possível perda directa de células que podem permanecer na seringa. </li></ol></li><li> Perfusão de células Tc-99m-HMPAO-rotulados Regional <ol><li> Siga o passo 2.4. </li><li> Aplique uma 100 milímetros torniquete de borracha bandagem no metacarpo proximal com dois 100 milímetros rolo de algodão gaze posicionada medial e lateralmente. </li><li> Assepticamente preparar the a pele sobre a veia digitais palmar lateral ao nível da sesamóides proximais laterais esfregando a área com uma solução de limpeza cirúrgica clorexidina durante pelo menos 5 minutos e, finalmente, com gaze embebida em álcool. Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica. </li><li> Prepara-se uma extensão de 100 mm ajustada com uma 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) para a agulha de borboleta punção venosa de enchimento com soro fisiológico estéril heparinizado e, em seguida, introduzir a agulha na veia digitais palmar lateral. Uma vez que o sangue da veia é inserido irá preencher parcialmente o conjunto de extensão. Ao conector de bloqueio Luer anexar uma tampa de borracha de bloqueio Luer para facilitar subsequente injecção de células marcadas. </li><li> Diluir as MSCs em 19 ml de PBS, recolhendo as células em uma seringa de 20 ml pré-carregado com o PBS. Aplicar as células através da taça de borracha utilizando um 18 g (1,2 x 40 mm) agulha hipodérmica a um ritmo lento mas constante (30 - 40 segundos). Limpar o cateter com 1 ml de PBS, pré-carregado num syringe. </li><li> Remover a agulha e imediatamente aplicar pressão na pele sobre o orifio de agulha com uma camada de cinco 4 x 4 gazes de algodão. Em seguida, colocar uma ligadura elástica da luz com adesivo sobre a área sesamoid proximal e deixar o torniquete no lugar durante 30 minutos após a injecção. </li><li> Solte o torniquete após 30 min. O cavalo está pronto para cintigrafia gama. Nota: Depois de injetar as células, adquirir uma contagem da seringa vazia e agulha para avaliar possível perda direta de células que podem permanecer na seringa. </li></ol></li></ol> 5. Gamma Cintilografia <ol><li> Imagens cintilografia <ol><li> Adquirir imagens planar cintilografia com uma câmara gama (fixado em 140 KeV pico fotoelétrico usando uma janela simétrica 20%), equipado com uma baixa energia, colimador buraco paralelo. <ol><li> Obter todas as imagens após o tempo 0 em cavalos sedados como no passo 2.2 em pé. Após o tempo de 0 scintigram, substituir a bandagem luz sobre a implantação site com uma bandagem acolchoada. Remover esta bandagem antes de cada exame de cintilografia. </li><li> Adquirir imagens estáticas durante 60 segundos cada (matriz de 256 por 256), utilizando o software de processamento com a &quot;adquirir&quot; - &quot;seleção do estudo&quot; - opções &quot;ósseos estáticos&quot;. É essencial que o cavalo não se mover durante o período de aquisição de imagem, porque a opção de modo estático não tem um módulo para a correcção de movimento. </li><li> Para injecção intralesional, obter imagens laterais da área de lesão do carpo até a extremidade distal, a área equivalente do membro contralateral, o campo pulmão esquerdo eo esquerdo da tireóide. Durante a aquisição de membros dianteiros imagens, posicione a tela de liderança entre as pernas para evitar a formação de imagens do contralateral membro. Adquirir as imagens em 5 min após a injecção (tempo 0), e, em seguida, com 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 h. </li><li> Para perfusão regional, obter imagens gama laterais e dorsal como por 5.1.1.3. Obter imagens 5 min afliberação do torniquete ter. Este será o tempo 0. Pode ser útil para a imagem do membro imediatamente após a injecção das células para avaliar as contagens de libertação antes de torniquete. Obtenção de imagens gama com 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 horas após a administração das células. </li></ol></li><li> Depois que as imagens tenham sido adquiridos, processar as imagens manualmente usando a opção &quot;transformação&quot; do software com opções selecionadas para cor &quot;Sokoloff&quot; e &quot;Inverter&quot; cor. Em seguida, selecione a &quot;região de interesse&quot; (ROI) e &quot;elipse&quot;, pois isso permite reformulação da máscara de seleção e movimento sobre a área da lesão. Obter as contagens sobre o ROI, escolhendo a opção &quot;adicionar as estatísticas&quot;. Certifique-se de que as regiões de tamanho idêntico de interesse (ROI) são gravadas para cada animal nos diferentes pontos de tempo. </li><li> Em seguida, as contagens para corrigir o decaimento prevista do tecnécio em cada ponto de tempo. Use a seguinte equação para corrigir a decadência:A = O e - (0.693t / T 1/2), em que A é O a actividade inicial do isótopo, A é ​​o decaimento da radioactividade corrigida no tempo zero, t é o tempo decorrido e o t 1/2 representa a metade -life do isótopo. Em seguida, expressar as contagens corrigidas em cada ponto de tempo como uma percentagem do ROI no tempo 0 para trabalhar a percentagem de células restantes, utilizando a seguinte fórmula: </li></ol></li></ol> % restantes células (t) = 100 - {[(decaimento previsto (T) - de decaimento (t)) / previu decaimento (t)]} x 100 decaimento (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

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<li>Heckl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+contrast+agents+for+molecular+imaging+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Future contrast agents for molecular imaging in stroke.</a> Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).</li>
</ol>

JD e RKS são membros do Conselho Consultivo Científico da ReCellerate Inc.

Além de medula óssea, as células estaminais isoladas a partir de fontes tais como o tecido adiposo são adequados para marcação com este protocolo. Além disso, as células de um estado congelado pode ser revivido e expandidas em cultura para os números desejados para estudos de rotulagem 12. Um factor crítico que determina a eficiência de marcação do BMMSC é o tempo entre a eluição do Tc-99m a partir do gerador de molibdénio no radiopharmacy, Preparação de Tc-99m-HMPAO e uso do radi...

Estratégias regenerativos para a reparação dos tecidos doentes ou danificados são baseados em células estaminais multipotentes derivadas de uma variedade de tecidos e implantados na área afectada. Os recentes avanços na aplicação das autólogo BMMSC para o tratamento do tendão e lesões ligamentares no cavalo têm mostrado melhorar as medidas de resultado, tanto experimental 1-5 e estudos clínicos 6. O cavalo é um modelo particularmente atraente para avaliar a eficácia de células-tronco tratamentos relacionados porque ele sofre de idade e overstrain lesões relacionadas com os tendões do membro anterior distal, é um animal atlético, e é uma facilitando a recuperação grande, medula óssea e implantação precisa. Lesões do tendão de curar naturalmente com fibrose mas o tendão curado é funcionalmente inferior 7 e tem um alto risco de nova lesão 8. O tendão flexor digital superficial (TFDS) é mais comumente afetados como tem evoluído a agir como uma energia elásticaloja e experiências de alta carga salienta a alcançar eficiência energética e locomoção de alta velocidade. Restaurar a função após a lesão é, portanto, fundamental. Estas lesões são semelhantes às que ocorrem no tendão de Aquiles em seres humanos, que desempenha uma função semelhante 9. Não existem opções boas de tratamento para tratar ou alcançar bom estado de conservação para essas lesões, as estratégias regenerativas, portanto, com base nas células oferecem uma oportunidade atraente para melhorar os resultados e reduzir a re-ferimento. Na maioria dos estudos de 5 - 20 milhões de BMMSC autólogo são injectados directamente na lesão, que normalmente ocorrem no interior do núcleo do corpo que, por conseguinte, tendão actua como um receptáculo para as células. O destino das células injetadas uma vez não é métodos claros e diferentes de rotulagem celular para rastrear as células foram descritos recentemente. As células marcadas com um marcador de fluorescência foram mostrados para sobreviver apenas em quantidades relativamente pequenas (&lt;10%) 10,11. Etiquetas de fluorescência exigirextracção de tecidos e para análise histológica de corte, que é moroso e não prontamente facilitar a análise temporal em um modelo animal grande ou nos casos clínicos. Em trabalhos mais recentes que temos usado o radioisótopo 99m Tc para rotular células e seguir seu destino por cintigrafia gama 1. Este método permite comparações rápidas para ser feita entre diferentes vias de administração de células, incluindo por via intravenosa, intralesional através da veia jugular 1 ou perfusão regional via intra-arterial ou intravenosa, 12 1,12 injecções. A persistência e distribuição de células podem então ser trabalhada por cintigrafia gama de vários órgãos. Isto demonstrou que apenas 24% das células injectadas intralesionalmente permaneceu na lesão por 1 h 24 e este é suportado por um outro estudo usando lesões criados experimentalmente e usando o mesmo marcador radioactivo 5. Além disso, as células apresentam capacidade limitada para casa em lesões tendíneas quando delivered por perfusão regional ou por via intravenosa, mas são dispersos nos pulmões pelas últimas vias 4. BMMSC marcadas com nanopartículas de ferro é um método alternativo para controlar células implantadas em tendões 13 membros anteriores. Embora as células marcadas de nanopartículas de ferro permitir o rastreamento de células in vivo por ressonância magnética, os estudos temporais em um animal de grande porte são limitados pelo número de vezes que a anestesia pode ser administrada em cada ponto de tempo para realizar as imagens de ressonância magnética. Além disso, as nanopartículas de ferro são hipointensa em MRI que limita a informação sobre a migração de células marcadas no corpo do tendão. Outros isótopos radioactivos que podem ser utilizados incluem Índio-111, mas esta tem a desvantagem de uma meia-vida mais longa do que o Tc-99m (2,8 dias vs 6,0 h) e uma energia mais elevada de emissão de raios gama. Além disso, a viabilidade celular foi relatado para ser reduzida quando marcados com índio-111 14. Tc-99m, por outro lado, é rotineiramente utilizada em ambos nuclear equina e humanamedicina para rotular células mononucleares do sangue periférico e siga sua distribuição in vivo pela cintilografia. Ele pode ser relativamente facilmente absorvidos pelas células utilizando HMPAO como uma molécula de ligação para ligar o tecnécio, como Tc-99m-HMPAO, às células. Tc-99m-HMPAO marcado BMMSC mostrar boa viabilidade e podem proliferar in vitro 4. Este protocolo detalha a rotulagem e rastreamento de BMMSC autólogo eqüino implantados em lesões que ocorrem naturalmente no TFDS membro anterior. É importante notar que o protocolo destina-se apenas a ser utilizado como uma ferramenta de pesquisa. A sua utilização como uma modalidade terapêutica clínica não é recomendada como o efeito do marcador radioactivo no fenótipo celular não foi totalmente elucidado.

<table><tbody><tr><td>Tecnécio99m&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Por favor, pergunte ao fornecedor local de radiação de ionização de acordo com os requisitos legais.&nbsp; O isótopo deve ser usado dentro de 2 horas após a eluição do gerador de molibdênio-99</td></tr><tr><td>Ceretec - Hexametilpropilenoamina oxima (HMPAO)&nbsp;</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td>Informe-se diretamente com GE HealthCare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td><td>Ependorf</td><td>22620100</td><td></td></tr><tr><td>18 G e 19 G Needles</td><td>Terumo Medical</td><td>NN-1838R (18 G); &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NN1938R (19 G)</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1 ml e 2 ml</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One Ltd</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Solução salina tamponada com fosfato</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze estéril</td><td>Shermond Ltd</td><td>UNG602</td><td></td></tr><tr><td>Bandagem autoaderente CoflexVet</td><td>Andover Healthcare, Inc.</td><td>3540RB-018</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem de ultrassom</td><td>Scion Image, Scion Corporation, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicasXplus Software de processamento de cintilagem</td><td>Bartec Technologies Ltd</td><td></td><td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td></tr><tr><td>Contador de isótopos de campo para monitoramento de isótopos</td><td>John Caunt Reino Unido</td><td>GMS1800a</td><td>http://www.johncaunt.com/</td></tr> <tr><td>Contador de poços para medições de isótopos, calibrador de dose</td><td>Capintec Southern Scientific</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging and rastreamento de tecnécio-99m rotulado de medula Óssea células-tronco mesenquimais em equine tendinopatia

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recentes avanços na aplicação de células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMMSC) para o tratamento de lesões de tendões e ligamentos no cavalo sugerem melhorou medidas de resultados em ambos os estudos experimentais e clínicos. Embora o BMMSC está implantado no interior da lesão do tendão em grandes números (geralmente 10 - 20 milhões de células), apenas um número relativamente pequeno sobrevivência (&lt;10%), embora estes podem persistir por até 5 meses após a implantação. Esta parece ser uma observação comum em outras espécies onde BMMSC foram implantados em outros tecidos e é importante para entender quando ocorre esta perda, quantas sobreviver ao processo de implantação inicial e se as células são apagadas em outros órgãos. Acompanhando o destino das células pode ser conseguida por radiomarcação do BMMSC antes da implantação que permite não invasiva in vivo de imagens de localização da célula e a quantificação do número de células. Este protocolo descreve uma célula labeling procedimento que usa Tecnécio-99m (Tc-99m), e acompanhamento destas células após a implantação em tendões flexores de feridos em cavalos. Tc-99m é uma (t 1/2 de 6,01 h) do isótopo de vida curta que emite raios gama e podem ser internalizados pelas células na presença do composto lipofílico hexametilpropilenoamina oxima (HMPAO). Essas propriedades tornam ideal para uso em clínicas de medicina nuclear para o diagnóstico de muitas doenças diferentes. O destino das células marcadas podem ser seguidas no curto prazo (até 36 horas) por cintigrafia gama para quantificar tanto o número de células retidos na lesão e distribuição das células nos pulmões, tireóide e outros órgãos. Esta técnica é uma adaptação da rotulagem dos leucócitos do sangue e pode ser utilizado para imagem BMMSC implantado em outros órgãos.

Tc-99m-HMPAO incorporação BMMSs não afeta negativamente a sua capacidade de aderir à cultura de tecidos de plástico e enquanto eles mostram capacidade de proliferação para formar monocamadas (Figura 1) que não tem completamente determinado se as taxas de proliferação ou outros fenótipos celulares são afetados. A sua morfologia é semelhante às células não marcadas com uma forma típica de fuso. A eficiência de marcação celular (isto é., A captação do marcador) tipicamente varia desde cerca de 1,5...

Este protocolo descreve a radiomarcação de células-tronco mesenquimais equinas e sua implantação em lesões tendinosas no cavalo, a fim de determinar a sobrevivência celular e a distribuição tecidual usando cintilografia gama.

In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

O objetivo geral deste protocolo é acompanhar de forma não invasiva a distribuição e o destino de células-tronco mesenquimais da medula óssea marcadas após sua injeção por meio de cintilografia gama. O destino das células-tronco após a injeção ainda não é bem compreendido. As principais vantagens desta técnica são a possibilidade de rastrear de forma não invasiva as células-tronco em múltiplos órgãos após a administração e o fato de que a meia-vida curta do A osteo garante sua eliminação em até 48 horas.Embora isso tenha proporcionado uma compreensão sobre o uso de células-tronco no tratamento de tendinopatias naturalmente ocorrentes, também poderia ser utilizado para a investigação de terapias para doenças ósseas e cardíacas. Geralmente, os desafios para indivíduos novos neste método são a coordenação das células e o conjunto necessário para a marcação e para a preparação do paciente. Para aplicação imediata das células, comece aplicando gel acoplador acústico na região do membro depilada e utilize um transdutor linear para escanear metodicamente toda a região metacarpal palmar, obtendo imagens seriadas transversais e longitudinais, a fim de identificar a zona de lesão máxima.Após a administração do anestésico local, limpe o local da implantação com uma solução cirúrgica de clorexidina por pelo menos cinco minutos, seguido por uma passagem com gaze embebida em etanol. Primeiro, vista um par de luvas quando o animal já estiver preparado, e pelote uma alíquota de células-tronco mesenquimais da medula óssea equivalente a 1 vez 10 da sétima célula em um mililitro do sobrenadante da medula óssea por centrifugação. Em seguida, aspire o sobrenadante com uma seringa de dois mililitros, equipada com uma agulha de calibre 18 ou 19, deixando aproximadamente 100 microlitros de solução no tubo.Transfira o sobrenatante para um tubo de microcentrífuga sobre gelo e, em seguida, use movimentos suaves com o dedo para ressuspender as células nos 100 microlitros residuais de sobrenatante. Tenha o cuidado de garantir que as células sejam completamente ressuspensas e de que não haja grumos visíveis de tecido. Em seguida, mantenha as células em temperatura ambiente.Agora, misture um mililitro do Protec de tecnécio com agitação suave em um frasco de H-M-P-A-O. Após cinco minutos, utilize uma seringa e agulha de um mililitro para tratar as células-tronco mesenquimais com toda a alíquota de TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Em seguida, tampe o tubo, misture as células com movimentos suaves e coloque o tubo à temperatura ambiente atrás de um escudo de chumbo.Após 30 minutos, abra o tubo com uma pinça e use uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 21 graus para adicionar um mililitro de PBS às células. Tampe novamente o tubo e misture as células. Em seguida, centrifugue as células e use a seringa de dois mililitros para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo supostamente protegido rotulado como lavagem um.Em seguida, lave o pellet em mais um mililitro de PBS, conforme acabou de ser demonstrado. Transfira a segunda lavagem para o tubo rotulado como protegido, identificado como W2, após a segunda lavagem. Re-suspenda completamente as células no PBS residual e na alíquota de sobrenadante de medula óssea gelada, mantendo o transdutor em paralelo com a agulha.Introduza lentamente uma agulha de calibre 20 com 1,5 ou duas polegadas na zona de maior lesão, no centro da lesão, em orientação longitudinal. Em seguida, utilizando o blindagem apropriada, aspire as células para dentro de uma seringa de dois mililitros com sistema de trava, equipada com uma agulha de calibre 20, e descarte a agulha, tomando cuidado para não perder nenhum fluido. Após acoplar a seringa à agulha previamente posicionada no tendão, posicione o transdutor de ultrassom sob a agulha de forma que a trajetória da agulha no tecido seja claramente visível e injete as células em ritmo lento, porém constante, na lesão.Confirme que o fluido que é injetado na lesão seja visível na imagem de ultrassom como líquido coico contendo bolhas de ar hiper-ecogênicas; quando todas as células tiverem sido administradas, retire a agulha. Utilize as opções de seleção de estudo e imagem estática óssea no software de processamento para obter imagens estáticas durante 60 segundos cada. Em seguida, obtenha imagens laterais da região da lesão, desde o carpo até a extremidade distal, da área equivalente do membro contralateral, do campo pulmonar esquerdo e da tireoide esquerda nos momentos indicados.Em seguida, selecione a ferramenta de região de interesse e a ferramenta de elipse e remodelar a máscara de seleção sobre a área da lesão conforme apropriado. Por fim, escolha a opção de adicionar duas estatísticas para obter as contagens na região de interesse. Cuidando para que regiões de interesse de tamanho idêntico sejam registradas para cada animal nos diferentes pontos de tempo.Após a administração intralesional, as células serão observadas como uma área focal de sinal com uma disseminação limitada para o tecido tendíneo circundante ao longo do tempo. Em contraste, quando as células são administradas por perfusão regional através da veia palmar digital, observa-se uma redução gradual do sinal no local da injeção. Ao longo do tempo, os campos pulmonares geralmente são negativos após injeção intralesional, mas ocasionalmente pode ser detectado, em pontos iniciais, um sinal muito focal que se torna mais generalizado com o tempo.A tireoide permanece negativa por essa via de administração também. A perfusão regional também demonstra um sinal focal nos pulmões, que se torna mais difuso ao longo do tempo, embora o sinal seja significativamente mais intenso em comparação com o observado com a via intralesional. Com a tireoide também frequentemente exibindo um sinal focal, a contagem total inicial de radioisótopos das células nos momentos zero pré-injeção e as contagens do gramagama inicial na região de interesse.Às vezes, o tempo zero pós-injeção pode ser usado para calcular a porcentagem de diminuição nas contagens em cada ponto temporal após a injeção, a fim de determinar a decadência prevista do TC 99 M a partir das contagens iniciais. A persistência das células remanescentes no local da injeção em cada momento após a injeção também pode então ser calculada. Após este procedimento, outras vias de administração celular podem ser aplicadas para responder perguntas adicionais sobre a capacidade de homing das células-tronco mesenquimais após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de medicina regional explorarem métodos para melhorar a retenção celular em lesões tendíneas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular células e registrar sua distribuição e concentração em diferentes sistemas orgânicos. Não se esqueça de que trabalhar com radiação ionizante pode ser extremamente perigoso e que precauções, como equipamento de proteção individual, monitores de radiação, blindagem com chumbo e a correta disposição de resíduos contaminados, são essenciais durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Um modelo de camundongo experimental de metástase óssea foi estabelecido após a entrega intracardíaca da luciferase expressando células tumorais mamárias. Desenvolvimento do tumor e resultou lesão osteolítica foram monitorados longitudinalmente, com a bioluminescência e CT micro imagem.

Monitoramento metástases tumorais e lesões osteolíticas com bioluminescência e CT Micro Imagem

A medida quantitativa da função progenitor óssea na consolidação da fratura requer alta resolução tecnologia de imagens em série. Aqui, os protocolos são fornecidos para o uso de microscopia intravital e rastreamento osteo-linhagem sequencialmente imagem e quantificar a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco / progenitoras osteogênicas endógenos no processo de reparação de fratura óssea.

Seqüente<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de osteogênicas células-tronco / progenitoras durante o reparo de fratura

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.

Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG

Apresentado aqui é um protocolo para a entrega e o seguimento não invasores da pilha de haste do mesenchymal (MSC) em um modelo do rato de ferimento de cérebro traumático. As nanopartículas superparamagnéticas do óxido de ferro são empregadas como uma ponta de prova da imagem latente da ressonância magnética (MRI) para a rotulagem de MSC e o seguimento in vivo não invasor após a entrega intranasal usando mri em tempo real.

Rastreamento de células-tronco mesenchymal rotuladas por óxido de ferro superparamagnético usando ressonância magnética após parto intranasal em um modelo de urina de urina de lesão cerebral traumática

Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Injeções locais de um corante mitocondrial marcando mitocôndrias da célula terminal de Schwann in vivo para microscopia confocal. Esse método utiliza prova de conceito demonstrada em tecido muscular esquelético de camundongos com músculo saudável ou doente para fornecer visualização mitocondrial de alta resolução.

Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Aprenda a rastrear células-tronco mesenquimais de medula óssea marcadas com tecnécio-99m em tendinopatia equina usando gama cintilografia. Este método permite monitorar a distribuição e sobrevivência celular de forma não invasiva.

In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

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