In Vivo Imaging and Rastreamento de Tecnécio-99m Rotulado de Medula Óssea Células-Tronco Mesenquimais em Equine Tendinopatia

O objetivo geral deste protocolo é acompanhar de forma não invasiva a distribuição e o destino de células-tronco mesenquimais da medula óssea marcadas após sua injeção por meio de cintilografia gama. O destino das células-tronco após a injeção ainda não é bem compreendido. As principais vantagens desta técnica são a possibilidade de rastrear de forma não invasiva as células-tronco em múltiplos órgãos após a administração e o fato de que a meia-vida curta do A osteo garante sua eliminação em até 48 horas.

Embora isso tenha proporcionado uma compreensão sobre o uso de células-tronco no tratamento de tendinopatias naturalmente ocorrentes, também poderia ser utilizado para a investigação de terapias para doenças ósseas e cardíacas. Geralmente, os desafios para indivíduos novos neste método são a coordenação das células e o conjunto necessário para a marcação e para a preparação do paciente. Para aplicação imediata das células, comece aplicando gel acoplador acústico na região do membro depilada e utilize um transdutor linear para escanear metodicamente toda a região metacarpal palmar, obtendo imagens seriadas transversais e longitudinais, a fim de identificar a zona de lesão máxima.

Após a administração do anestésico local, limpe o local da implantação com uma solução cirúrgica de clorexidina por pelo menos cinco minutos, seguido por uma passagem com gaze embebida em etanol. Primeiro, vista um par de luvas quando o animal já estiver preparado, e pelote uma alíquota de células-tronco mesenquimais da medula óssea equivalente a 1 vez 10 da sétima célula em um mililitro do sobrenadante da medula óssea por centrifugação. Em seguida, aspire o sobrenadante com uma seringa de dois mililitros, equipada com uma agulha de calibre 18 ou 19, deixando aproximadamente 100 microlitros de solução no tubo.

Transfira o sobrenatante para um tubo de microcentrífuga sobre gelo e, em seguida, use movimentos suaves com o dedo para ressuspender as células nos 100 microlitros residuais de sobrenatante. Tenha o cuidado de garantir que as células sejam completamente ressuspensas e de que não haja grumos visíveis de tecido. Em seguida, mantenha as células em temperatura ambiente.

Agora, misture um mililitro do Protec de tecnécio com agitação suave em um frasco de H-M-P-A-O. Após cinco minutos, utilize uma seringa e agulha de um mililitro para tratar as células-tronco mesenquimais com toda a alíquota de TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Em seguida, tampe o tubo, misture as células com movimentos suaves e coloque o tubo à temperatura ambiente atrás de um escudo de chumbo.

Após 30 minutos, abra o tubo com uma pinça e use uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 21 graus para adicionar um mililitro de PBS às células. Tampe novamente o tubo e misture as células. Em seguida, centrifugue as células e use a seringa de dois mililitros para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo supostamente protegido rotulado como lavagem um.

Em seguida, lave o pellet em mais um mililitro de PBS, conforme acabou de ser demonstrado. Transfira a segunda lavagem para o tubo rotulado como protegido, identificado como W2, após a segunda lavagem. Re-suspenda completamente as células no PBS residual e na alíquota de sobrenadante de medula óssea gelada, mantendo o transdutor em paralelo com a agulha.

Introduza lentamente uma agulha de calibre 20 com 1,5 ou duas polegadas na zona de maior lesão, no centro da lesão, em orientação longitudinal. Em seguida, utilizando o blindagem apropriada, aspire as células para dentro de uma seringa de dois mililitros com sistema de trava, equipada com uma agulha de calibre 20, e descarte a agulha, tomando cuidado para não perder nenhum fluido. Após acoplar a seringa à agulha previamente posicionada no tendão, posicione o transdutor de ultrassom sob a agulha de forma que a trajetória da agulha no tecido seja claramente visível e injete as células em ritmo lento, porém constante, na lesão.

Confirme que o fluido que é injetado na lesão seja visível na imagem de ultrassom como líquido coico contendo bolhas de ar hiper-ecogênicas; quando todas as células tiverem sido administradas, retire a agulha. Utilize as opções de seleção de estudo e imagem estática óssea no software de processamento para obter imagens estáticas durante 60 segundos cada. Em seguida, obtenha imagens laterais da região da lesão, desde o carpo até a extremidade distal, da área equivalente do membro contralateral, do campo pulmonar esquerdo e da tireoide esquerda nos momentos indicados.

Em seguida, selecione a ferramenta de região de interesse e a ferramenta de elipse e remodelar a máscara de seleção sobre a área da lesão conforme apropriado. Por fim, escolha a opção de adicionar duas estatísticas para obter as contagens na região de interesse. Cuidando para que regiões de interesse de tamanho idêntico sejam registradas para cada animal nos diferentes pontos de tempo.

Após a administração intralesional, as células serão observadas como uma área focal de sinal com uma disseminação limitada para o tecido tendíneo circundante ao longo do tempo. Em contraste, quando as células são administradas por perfusão regional através da veia palmar digital, observa-se uma redução gradual do sinal no local da injeção. Ao longo do tempo, os campos pulmonares geralmente são negativos após injeção intralesional, mas ocasionalmente pode ser detectado, em pontos iniciais, um sinal muito focal que se torna mais generalizado com o tempo.

A tireoide permanece negativa por essa via de administração também. A perfusão regional também demonstra um sinal focal nos pulmões, que se torna mais difuso ao longo do tempo, embora o sinal seja significativamente mais intenso em comparação com o observado com a via intralesional. Com a tireoide também frequentemente exibindo um sinal focal, a contagem total inicial de radioisótopos das células nos momentos zero pré-injeção e as contagens do gramagama inicial na região de interesse.

Às vezes, o tempo zero pós-injeção pode ser usado para calcular a porcentagem de diminuição nas contagens em cada ponto temporal após a injeção, a fim de determinar a decadência prevista do TC 99 M a partir das contagens iniciais. A persistência das células remanescentes no local da injeção em cada momento após a injeção também pode então ser calculada. Após este procedimento, outras vias de administração celular podem ser aplicadas para responder perguntas adicionais sobre a capacidade de homing das células-tronco mesenquimais após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de medicina regional explorarem métodos para melhorar a retenção celular em lesões tendíneas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular células e registrar sua distribuição e concentração em diferentes sistemas orgânicos. Não se esqueça de que trabalhar com radiação ionizante pode ser extremamente perigoso e que precauções, como equipamento de proteção individual, monitores de radiação, blindagem com chumbo e a correta disposição de resíduos contaminados, são essenciais durante a realização deste procedimento.