Name: Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Aprenda a quantificar α-sinucleína associada à doença em regiões cerebrais de camundongos transgênicos usando ELISA. Este método permite monitorar a acumulação proteica em modelos de sinucleinopatias como o Parkinson.

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Os autores gostariam de agradecer Damien Gaillard para inoculações e acompanhamento de experiências com animais. Este trabalho foi apoiado por ANSES (Agência Francesa de Alimentos, Saúde Ambiental e Ocupacional e Segurança) e por uma bolsa da Fundação France Parkinson.

Todos os procedimentos e protocolos que envolvam animais estavam em conformidade com a Directiva CE 86/609 / CEE do Conselho e ratificado pelo vem, o comitê nacional francês para a consideração de Ética em Experimentação Animal (protocolo 11-0043). Os animais foram alojados e tratados em ANSES de aprovado instalações experimentais em Lyon (aprovação B 69387 0801). 1. Preparação de Ratos <ol><li> Eutanásia ratinhos por injecção intraperitoneal de uma dose letal de pentobarbital de sódio. </li><li> Recuperar todo o cérebro do crânio do rato e colocá-lo em um 35 milímetros de plástico placa de Petri sobre gelo até a extração. </li><li> Extrai-se a medula espinal cervical. NOTA: aS Extrair quer a partir de uma das metades do cérebro após a secção sagital ou a partir de cérebros de rato dissecadas, disponível após as experiências enumeradas na Tabela 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Experiment </td><td> Ratos Inóculo (equivalente cérebro) </td><td> Período de sobrevivência (Dpi) </td><td> Median / sobrevivência máxima (dias de idade) </td><td> aS detecção d por ELISA / WB / IHC </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ratos não inoculadas </td><td> 441 ± 166 </td><td> 419/736 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Camundongos inoculados (0,2 mg) </td><td> 150 ± 52 </td><td> 140/241 </td><td> 9/9 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de experiências realizadas em ratos M83. As inoculações foram realizadas com 6 semanas de experiência 2 na área do estriato-cortical com 20 ul de um homogenato de cérebro de um rato doente (1% peso / vol em glucose a 5%), depois anestesia de seis semanas de idade ratos M83 homozigotos 3% inalação de isoflurano. dpi: dias após inoculção. 2. Extracção de aS Cérebro Metades <ol><li> Sagital cortar o cérebro para obter duas metades. Pesar cada metade em um tubo ribolysis contendo bolas de moagem. </li><li> Prepare alta Sal (SH) de tampão contendo 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 750 mM, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 1% de fosfatase e inibidores da protease cocktails. Adicionar tampão alto de sal para as metades do cérebro para se obter 20% (peso / volume) homogeneizados. </li><li> Preparar as amostras de as metades cerebrais usando um homogeneizador mecânico em 6,0 m / s durante 23 seg duas vezes. Após os primeiros 23 segundos de homogeneização, colocar os tubos que contêm os homogeneizados em gelo durante 2 min antes do segundo ciclo de 23 seg. </li><li> Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 5 minutos para eliminar fragmentos de cérebro não moídos. Recuperar os sobrenadantes, dividem-se em 200 mL alíquotas e mantê-los à temperatura de -80 ° C para análise posterior ELISA. </li></ol> 3. aS Extração de Dissecadas regiões do cérebro <ol><li> Dissecar umcérebro inteiro em um 35 milímetros de plástico placa de Petri no gelo com um ampliador de baixa potência (ampliação 8X), utilizando dois forcipes cujas extremidades são mantidos juntos, exceto quando dissecando o hipocampo. Não exceda 10 min para preservar a integridade do cérebro. Coloque o cérebro lado direito para cima e recuperar os seguintes regiões do cérebro, nesta ordem: <ol><li> Separe um dos dois bulbos olfatórios usando uma pinça colocados logo atrás do bulbo. Deslocá-lo do cérebro por um movimento para baixo. Repita esta operação para a segunda lâmpada. </li><li> Suavemente cunha a pinça entre as duas córtices e movê-lo para a frente para facilitar a dissociação das duas córtex. Mantendo o cérebro no lugar com um fórceps, utilizar outro para separar o córtex do hipocampo. </li><li> Posicionar a pinça 2 mm abaixo do córtex. Manter uma pressão suave sobre a pinça até que o topo do hipocampo é visível. Retire a primeira parte do córtex, e repita com a segunda parte. Utilizar as pinças para separar os dois córticescomeçando no hipocampo e que se deslocam para a frente do cérebro. </li><li> Posicione a pinça abertos ao redor um dos hipocampos. Fechar a pinça, na parte inferior do hipocampo, em seguida, removê-lo suavemente, recuperando-se, tanto quanto possível. Repetir o procedimento para a segunda hipocampo. </li><li> Posicionar as pinças abertas abaixo de um dos corpos estriados e separá-lo suavemente a partir do cérebro. Utilizar as pinças para remover qualquer remanescente córtex do striatum. Repita este procedimento para o segundo striatum. </li><li> Utilizar as pinças para deprimir suavemente por 2 mm, o contorno do cerebelo para facilitar a separação do cerebelo a partir do cérebro. Coloque a pinça logo atrás do cerebelo e removê-lo, movendo a pinça para a frente. </li><li> Utilizar a parte larga da pinça para elevar o mesencéfalo, a fim de ver claramente onde se junta o tronco cerebral. Adicione uma incisão vertical na junção, em seguida, remover o tronco cerebral. </li><li> Posicione a pinça atrás do mesencéfalo, que is composta por quatro estruturas arredondadas. Inciso verticalmente até o mesencéfalo foi completamente separado do restante do cérebro. </li></ol></li><li> Prepare homogenatos de variável% (peso / volume) em tampão SH, dependendo da quantidade de tecidos disponíveis, isto é, 5% homogeneizado para um peso entre 10 e 30 mg, 10% para um peso entre 30 e 80 mg, e 20% para um peso acima de 80 mg. <ol><li> Adicionar um volume adequado de tampão de HS para as regiões cerebrais dissecados para se obter o esperado% de homogenato. </li><li> Vortex e verificar que os tecidos são totalmente imersos no buffer HS. </li><li> Homogeneizar amostras preparadas a partir das regiões cerebrais dissecados ou a medula espinhal cervical com um moinho de tecido composto por um tubo de vidro de borosilicato e dois pilões, A e B. </li><li> Pour cada região do cérebro para ser esmagado directamente para dentro do tubo. Inserir um pilão para dentro do tubo e retirá-la. Repetir este movimento cerca de dez vezes para dissociar o tecido. Em seguida, use um pilão B para continue moer o tecido com mais 20 movimentos. Transferir os homogeneizados num tubo de 1,5 ml com uma pipeta de transferência de 1 ml. </li></ol></li><li> Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar quaisquer fragmentos cerebrais não moídos. Recuperar os sobrenadantes, dividi-los em 200 mL alíquotas e mantê-los à temperatura de -80 ° C para análise posterior ELISA. </li></ol> 4. Detecção de aS por ELISA <ol><li> Diluir os anticorpos de revestimento para 0,01 ng / ml. Use um anti-soro policlonal de coelho ou aS monoclonal clone de anticorpo em 42 mM de Na 2 CO / 3 tampão NaHCO 3 50 (pH 9,6). </li><li> Revestir a microplacas de 96 poços com 100 ul por poço de solução de revestimento, esta e deixar a 4 ° CO / N. Utilizar o anticorpo policlonal de coelho anti-aS na solução de revestimento para ELISA, utilizando anticorpos de detecção syn514, clone 42, LB509, AS11, 4d6 ou 8A5. Use o anti-aS anticorpo monoclonal clone 42 como uma solução de revestimentoem combinação com o anti-pSer129 aS anticorpo de detecção. NOTA: Se necessário, as placas podem ser mantidas a 4 ° C durante uma semana antes do ELISA é realizado. </li><li> Usar um lavador de placas para lavar as placas cinco vezes com 300 ul de solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de Tween 20 (PBST) por poço. A partir deste passo em diante, a incubação é a TA. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão PBS T20 por cavidade de bloqueio. Agita-se durante 1 hora a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST. </li><li> Diluir os homogenatos cerebrais (diluição 1: 100 dos homogenatos de 20%, 01:50 10% dos homogenatos e 01:25 dos homogenatos de 5% em PBST BSA a 1%), e adicionar 100 ul a cada poço. Em seguida incubar durante 2 horas enquanto se agitava a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST. </li><li> Adicione os diferentes anticorpos de detecção aS em PBST com BSA 1% nas diluições mencionados na Lista de Materiais. Incubar durante 1 hora a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST. </li><li> Adicionar tanto anti-Mouse ou anti-coelho conjugados HRP de IgG diluído 1: 8000 em PBST suplementado com BSA a 1% durante 1 hora, agitando a 150 rpm. Lavam-se as placas cinco vezes com PBST. </li><li> Adicionar 100 ul de 3,3 &#39;, 5,5&#39; solução-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço e incubar durante 15 min no escuro, com agitação a 150 rpm. </li><li> Parar a reacção por adição de 100 ul de HCl 1 N por poço, em seguida, medir a absorvência a 450 nm com um leitor de microplacas. </li><li> Para análise de dados, subtrair o valor de DO obtidos com um bem com todos os reagentes, excepto as amostras do cérebro do rato (bem em branco) a partir dos valores de DO medido para cada uma das amostras analisadas. </li></ol> 5. Mapeamento de Epitopos <ol><li> Realizar mapeamento de epítopos de acordo com o método descrito por Osman 16. Resumidamente, os péptidos da sequência no local de α-sinucleína humano contendo 12 aminoácidos de nitrocelulose com 10 aminoácidos que se sobrepõem. </li><li> Bloco com 50 mM de Tris / NaCI 150 mM, pH 10 contendo 0,05% de Tween 20 e 5% de leite em pó. Incubar o anticorpo em solução a uma concentração de 2 ug de anticorpo por ml de bloqueio a 2-10 ° CO / N. </li><li> Lava-se a membrana três vezes, utilizando Tris a 50 mM / NaCl 150 mM, pH 10, que contém 0,05% de Tween 20. Incubar, com o anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com HRP. Lava-se a membrana mais cinco vezes, utilizando o mesmo tampão, em seguida, a mancha usando um kit de coloração de Western blot de TMB. </li></ol> 6. Análise Estatística <ol><li> Use o pacote de software e R nlme para executar as regressões de efeitos mistos para modelar OD. Para cada comparação, realizar um modelo de regressão de efeitos mistos. Use um efeito fixo para distinguir sintomático de grupos assintomáticos. </li><li> Usar um efeito aleatório para reflectir a variabilidade de repetições para um dado rato. Verifique homoscedasticidade examinando os resíduos e, se necessário, use as funções de variância para modelar a estrutura de variância de erros dentro do grupo de acordo com Pinheiro e Bates 17. Defina 0,05 como limite de significância de P. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Foi demonstrada a utilização de um ELISA para detectar especificamente aS D directamente a partir de homogenatos do cérebro do rato no decorrer da doença no modelo de ratinho transgénico para M83. Na verdade, este ELISA poderia facilmente distinguir os ratos doentes M83 M83 de camundongos saudáveis ​​utilizando homogeneizados única inteiras cerebrais em tampão de alta sal. Os passos mais críticos para os resultados bem sucedidos utilizando este ELISA são: dissecting correctamente ...

A maioria dos métodos atuais para detectar α-sinucleína associada à doença (αSD) em modelos experimentais da doença de Parkinson (DP), como imunohistoquímica ou Western blot, são demorados e não quantitativos. Esta doença neurodegenerativa é caracterizada pela agregação de alfa-sinucleína principalmente na forma de inclusões contendo uma forma agregada da proteína pré-sináptica normalmente solúvel αS1,2 (corpos de Lewy e neuritos de Lewy). Normalmente apenas marginalmente fosforilada, αS é hiperfosforilada em sua serina 129 na resíduo nestas inclusões3 e pode ser monitorada por anticorpos especificamente direcionados contra αS fosforilada em Ser129, fornecendo assim um marcador confiável da patologia.
Pesquisas recentes sugerem que um mecanismo "semelhante ao prion" poderia estar envolvido na propagação da agregação de αS dentro do sistema nervoso de um paciente afetado4,5. Estes estudos relataram a aceleração de uma sinucleinopatia inoculando extratos cerebrais contendo αSD em um modelo de camundongo transgênico (M83) expressando uma proteína αS humana mutada A53T associada a um comprometimento motor severo que ocorre à medida que os camundongos envelhecem6. Da mesma forma, a inoculação intracerebral de αS recombinante agregado no mesmo modelo de camundongo M83 confirmou a aceleração da agregação5. A indução de depósitos de αS fosforilada também foi relatada após a inoculação de camundongos C57Bl/6 selvagens com αS recombinante fibrilar ou extratos cerebrais de pacientes humanos com DLB7,8. Sacino et al.9 recentemente apontaram que após a injeção de αS humano fibrilar, uma formação generalizada e progressiva de inclusões cerebrais de αS poderia ser induzida em camundongos M83, mas não em camundongos transgênicos E46K ou camundongos não transgênicos nos quais as inclusões de αS induzidas eram transitórias e principalmente restritas ao local da injeção. Estudos recentes em macacos confirmaram a propagação de agregados de αS após a inoculação de extratos derivados da DP em espécies mais próximas aos humanos10.
A ligação entre as alterações de αS e a doença de Parkinson sugere que αSD é um potencial biomarcador para a doença de Parkinson11. Um estudo recente mostrou a detecção de agregados solúveis oligoméricos de α-sinucleína no líquido cefalorraquidiano (LCR) humano e plasma como um potencial biomarcador para a doença de Parkinson baseado em um sistema sanduíche ELISA convencional usando o mesmo anticorpo para capturar e detectar αS12. Com base no mesmo método, proteínas multiméricas foram reconhecidas em amostras biológicas, incluindo o cérebro, porque existem múltiplas cópias de epítopos presentes nas formas montadas13. Muito recentemente, αS patológica no LCR de pacientes com patologia comprovada de corpos de Lewy foi detectada usando tanto um kit ELISA com um anticorpo altamente específico contra αSD (5G4) quanto um ensaio de imunoprecipitação14. Esses métodos poderiam diferenciar pacientes com DP/DLB de outros tipos de demência.
A propagação "semelhante ao prion" da agregação de αS foi estudada ainda mais no modelo de camundongo transgênico M83 usando uma abordagem ELISA que foi projetada para identificar especificamente αSD15. Neste estudo, relatamos o protocolo ELISA detalhado usado para detectar quantitativamente αSD em camundongos doentes (seja ou não inoculados com αSD de camundongos M83 doentes) e mais especialmente nas regiões cerebrais especificamente direcionadas pelo processo patológico neste modelo de camundongo transgênico M834.

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Anticorpo de detecção 1/2.000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Produzido na Anses</td><td></td><td>Anticorpo de detecção 1/1.000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Anticorpo de detecção 1/2.000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Anticorpo de detecção 1/3.000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Anticorpo de detecção 1/1.000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Anticorpo de detecção 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Anticorpo de revestimento e detecção (1/2.000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Fornecido pelo Dr. Anderson</td><td></td><td>Anticorpo de detecção 1/2.000</td></tr><tr><td>anticorpo policlonal anti-&alpha;syn</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Anticorpo de revestimento</td></tr><tr><td>Conjugado HRP anti-IgG de camundongo</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado HRP anti-IgG de coelho</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado HRP anti-IgG de cabra contra camundongo</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>Tampão HS</td><td></td><td></td><td>Ajustar a pH 7,5 e manter a 4 &#176;C</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Ajustar a pH 7,5</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Solução estoque 100 mM, tóxica</td></tr><tr><td>Cocktail de fosfatase 1%</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inibidor de protease 1%</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50x concentrado</td></tr><tr><td>Microplaca MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampão carbonato 50 mM pH 9,6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2,86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3,36 g/L, pH&nbsp;9,6</td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio Superblock T20 PBS</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10x concentrado</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Usado para ELISA</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>Usado para mapeamento de epítopos</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>manter no gelo nesta etapa</td></tr><tr><td>Tubos de moagem</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Lava-placas</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Biorad</td><td>Modelo 680</td><td></td></tr><tr><td>Lente de aumento de baixa potência</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8X ampliação</td></tr><tr><td>Pinça Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>Para etapas de dissecação</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de doença associada α-sinucleína por elisa reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam a53t humano mutante α-sinucleína

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Além dos métodos estabelecidos como Western blot, são necessários novos métodos para quantificar rapidamente e facilmente associada a doença α-sinucleína (D aS) em modelos experimentais de synucleopathies. Uma linha de ratinhos transgénicos (M83) que sobre-expressam os aS A53T humanos e o desenvolvimento de um fenótipo clínico espontaneamente dramática entre oito e 22 meses de idade, caracterizada por sintomas que incluem a perda de peso, prostração, e deficiência motora grave, foi utilizada neste estudo. Para análises moleculares de aS D (aS associada a doença) nestes ratos, um ensaio ELISA foi desenvolvido para quantificar especificamente aS D em ratinhos doentes. Análise do sistema nervoso central neste modelo de ratinho revelou a presença de D aS principalmente nas regiões do cérebro caudal e da medula espinhal. Não houve diferenças na distribuição aS D entre diferentes condições experimentais que conduzem à doença clínica, isto é, em uninoculATED e normalmente envelhecimento ratinhos transgénicos e em ratinhos inoculados com extractos de cérebro de ratinhos doentes. A detecção específica de aS D imunorreactividade usando um anticorpo contra a Ser129 fosforilada aS por ELISA essencialmente correlacionados com os valores obtidos por transferência de Western e imuno-histoquímica. Inesperadamente, resultados semelhantes foram observados com vários outros anticorpos contra a parte C-terminal de aS. A propagação de aS D, sugerindo o envolvimento de um mecanismo de &quot;prião-like&quot;, pode, assim, ser facilmente controlado e quantificado neste modelo de ratinho utilizando uma abordagem de ELISA.

Neste estudo, as ELISAs utilizados especificamente identificados aS associados à doença (D aS) em homogenatos de cérebro preparados num tampão de alto de sal a partir de ratinhos doentes M83. Usando um anticorpo que reconhece especificamente pSer129 aS (p = 0,0074), o ELISA facilmente distingue antigos, camundongos doentes (&gt; 8 meses de idade) de jovens (2-5 meses de idade), os camundongos saudáveis ​​M83 (Figura 1). Vários outros anticorpos mostraram sinais igualmente elevados (&gt; 0,6 O...

Um ELISA que oferece uma nova abordagem quantitativa é descrito. Ele detecta especificamente a α-sinucleína associada à doença (αSD) em um modelo de camundongo transgênico (M83) de sinucleinopatia usando vários anticorpos contra a forma fosforilada de αS na Ser129 ou a parte C-terminal da proteína.

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

O objetivo geral do seguinte experimento é monitorar o acúmulo da alfa-sinucleína associada à doença em um modelo de camundongo transgênico da doença de Parkinson usando uma abordagem Eliza quantitativa. Isso é realizado permitindo que camundongos não inoculados envelheçam normalmente ou inoculando camundongos por via intracerebral com um extrato cerebral de M 83 doente. Após os camundongos desenvolverem a doença clínica e serem sacrificados, as regiões cerebrais dos camundongos são dissecadas.Em seguida, homogeneizados de cada região cerebral são preparados em tampão de sal alto, e o Eliza é realizado no homogeneizado para quantificar a alfa-sinucleína associada à doença em cada região cerebral. Os resultados do Eliza mostram que a forma associada à doença da proteína alfa-sinucleína está principalmente se acumulando nas regiões cerebrais codil, incluindo o mesencéfalo e o tronco cerebral, bem como nas medulas espirais dos camundongos. A principal vantagem desta técnica Eliza em comparação com os métodos disponíveis anteriormente, como western blot ou imunohistoquímica, é que ela fornece uma quantificação rápida e confiável da alfa-sinucleína associada à doença.Neste modelo experimental, este método pode ajudar a monitorar o acúmulo e a propagação desta proteína no sistema nervoso central destes camundongos M 83. Isso sugere o envolvimento de um mecanismo semelhante ao do cérebro até o desenvolvimento da ciência clínica. Desenvolvimentos adicionais deste método podem ser considerados no futuro para o estudo de várias amostras biológicas, como o fluido cerebroespinal ou o sangue, que possivelmente também contêm formas alteradas de alfa demonstrando que este procedimento será um técnico do nosso laboratório.Todos os procedimentos e protocolos envolvendo animais estavam em conformidade com a diretiva CE 86 6 0 9 CEE e ratificados pelo comm ETH, o Comitê Nacional Francês. Para Consideração de Ética e Experimentação Animal, os animais foram abrigados e cuidados em instalações experimentais aprovadas em A e S em Leon Young após a eutanásia dos camundongos e a recuperação dos cérebros e medula espinal. De acordo com o protocolo do texto, coloque um cérebro inteiro em uma placa de Petri no gelo sob magnificação de baixo poder.Comece separando um dos dois bulbos olfativos colocando uma pinça logo atrás do bulbo. Usando um movimento descendente, desconecte-o do cérebro, em seguida, remova o segundo bulbo de maneira semelhante. Agora, usando uma pinça para manter o cérebro no lugar, gentilmente insira uma segunda pinça entre os córtices esquerdo e direito e mova-os para frente para dissociar as duas metades.Agora, continuando a manter o cérebro no lugar. Posicione a segunda pinça, dois milímetros atrás do córtex, e mantenha a pressão para cima para levantar o córtex do hipocampo. Em seguida, descole a primeira parte do córtex começando no hipocampo e movendo-se em direção à frente do cérebro.Repita com a segunda metade. Em seguida, posicione a pinça aberta ao redor de um dos hipocampos. Em seguida, gentilmente feche a pinça na parte inferior do órgão e remova-a suavemente.Repita com o segundo hipocampo. Posicione a pinça atrás de um dos estriado e gentilmente separe-o do cérebro. Use a pinça para remover qualquer córtex restante do estriado antes de remover o segundo satu para separar o cerebelo do resto do cérebro com a pinça, gentilmente pressione o contorno do cerebelo.Em seguida, coloque a pinça atrás do cerebelo e mova a pinça para frente para removê-la usando a parte larga da pinça levantada, eles como cefalão, que é composto por quatro estruturas redondas para ver claramente onde a junta se conecta ao tronco cerebral. Em seguida, faça uma incisão vertical na junção antes de remover o tronco cerebral, posicione a pinça atrás do mesencéfalo e, em tamanho vertical, para separá-lo completamente do cérebro restante. Para preparar o cérebro homogêneo, adicione um volume adequado de tampão HS às regiões cerebrais dissecadas para atingir um percentual esperado de homogeneizado, conforme mostrado na tabela abaixo.Usando um triturador de tecido composto por tubo de vidro de silicato de boro e pestinhos de tubo A e B, despeje uma região cerebral a ser esmagada no tubo. E então, com o pilão a, homogeneize o tecido 10 vezes para dissociá-lo. Em seguida, mude para o pilão B e homogeneize mais 20 vezes.Com uma pipeta de transferência, transfira o homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitros, repetindo a homogeneização com as amostras cerebrais restantes. Centrifugue as amostras a 1000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, recolha o snat e divida-os em Ali Watts de 200 microlitros. Armazene a -80 graus Celsius para análise Eliza subsequente para realizar Eliza no cérebro homogêneo.Comece usando 50 micromolar de tampão de carbonato para diluir o anticorpo anti alfa-sinucleína, coelho policlonal ou monoclonal clone 42, para 0,01 nanogramas por mililitro com 100 microlitros da solução de revestimento de anticorpos, revestindo os poços de uma microplaca de 96 poços e incubando a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Adicione 300 microlitros de PBST aos poços e use uma lavadora de placas para lavar as placas cinco vezes enquanto trabalha em temperatura ambiente.Avançando, adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio T 20 PBS a cada poço e agite as placas a 150 RPM por uma hora antes de usar PBST para lavar as placas cinco vezes usando PBST 1%BSA dilua o cérebro homogêneo usando as diretrizes listadas aqui e adicione 100 microlitros a cada um. Bem, então, incube em temperatura ambiente e 150 RPM por duas horas antes de usar PBST para lavar as placas. Cinco vezes após a lavagem final, adicione os anticorpos de detecção de alfa-sinucleína necessários, diluídos em PBS BST e 1%BSA, conforme listado na tabela dois do protocolo de texto, incube em temperatura ambiente e 150 RPM por uma hora antes de lavar as placas cinco vezes como antes.Em seguida, adicione anticorpos conjugados IgG HRP anti-rato ou anti-coelho diluídos para um para 8.000 em PBST 1%BSA e incube a 150 RPM por uma hora antes de lavar as placas cinco vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução TMB a cada poço e incube a 150 RPM por 15 minutos no escuro. Pare a reação adicionando 100 microlitros de um ácido clorídrico normal por poço.Em seguida, use um leitor de microplacas para medir a absorbância a 450 nanômetros para análise de dados. Subtraia o valor de densidade óptica obtido no poço em branco contendo apenas tampões e reagentes da densidade óptica.Os valores determinados a partir de amostras cerebrais realizam análise estatística de acordo com o protocolo de texto neste estudo, o Eliza realizado identificou especificamente a alfa-sinucleína associada à doença pser 1 29 em cérebros homogêneos de camundongos doentes M 83. Camundongos não presentes em camundongos jovens M 83. Anticorpos adicionais testados como LB 5 0 9 mostraram sinais fortes em camundongos doentes, mas não em saudáveis.A sensibilidade analítica do ELIZA descrito neste vídeo foi comparada a um método de western blot descrito anteriormente

detection-disease-associated-synuclein-enhanced-elisa-brain

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Incubar com uma enzima proteolítica para digerir os príons normais, deixando intactos os agregados resistentes.

Detecção de agregados de proteína príon mal dobrados em tecido cerebral de camundongo usando Western Blotting

Fonte: Bétemps, D., et al.,  Detecção de α-sinucleína associada à doença por ELISA aprimorado no cérebro de camundongos transgênicos que superexpressam α-sinucleína com mutação A53T humana. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra o procedimento para detectar a proteína α-sinucleína associada a doenças neurodegenerativas no tecido cerebral de camundongos transgênicos usando ELISA. As etapas incluem homogeneização tecidual, centrifugação e detecção ELISA da proteína α-sinucleína para...

Detecção de proteína associada a doenças neurodegenerativas α-sinucleína usando ELISA

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez mais insolúvel/agregada do tecido cerebral humano post-mortem. Através da utilização de tampões com aumento da força do detergente e técnicas de ultracentrifugação de alta velocidade, as propriedades variáveis da agregação de α-syn em tecidos doentes e não doentes podem ser examinadas.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Este manuscrito descreve como a entrega de genes locais mediada por vetores virais fornece uma maneira atraente de expressar transgenes no sistema nervoso central.  O protocolo descreve todas as etapas cruciais para realizar uma injeção de vetor viral na substância negra do rato para desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a doença de Parkinson.

Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado

Injecção periférica de fibrilas-sinucleína alfa no peritoneu ou língua de Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) ratos, que expressam alfa-sinucleína humana com a mutação A53T familiar e a luciferase do pirilampo, pode induzir a neuropatologia, incluindo neuroinflamao , em seu sistema nervoso central.

Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

O objetivo do presente protocolo é fornecer um sistema celular que Replica a formação do alfa-synuclein agrega na vivo. Inclusões intracelulares alfa-synuclein são semeados nos neurônios primários pela internalização e propagação de exógeno administrado agregados nativo associado microssomas alfa-synuclein, isolados de ratos transgênicos doentes alfa-synuclein.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibril pré-formado em neurônios de dopamina de cérebro médio do camundongo embrionário primário

Este trabalho analisa a dose vetorial e o tempo de exposição necessários para induzir neuroinflamação, neurodegeneração e comprometimento motor neste modelo pré-clínico da doença de Parkinson. Esses vetores que codificam a α-sinucleína humana são entregues na substantia nigra para recapitular a patologia da sinucleína associada à doença de Parkinson.

Analisando o modelo de rato da doença de Parkinson induzida por vetores virais associados à Adeno codificando α-sinucleína humana

Um método conveniente de perfusão alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato é apresentado. A detecção imunofluorescente de α-sinucleína fosfoilada é demonstrada em um modelo de camundongo da doença de Parkinson. Este trabalho também descreve de forma abrangente as etapas de perfusão transcárdia, dissecção, congelamento/incorporação de tecidos e etapas de secção congelada.

Um método de perfusão transcárvia alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato

Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.

Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado

Aprenda a quantificar α-sinucleína associada à doença em regiões cerebrais de camundongos transgênicos usando ELISA. Este método permite monitorar a acumulação proteica em modelos de sinucleinopatias como o Parkinson.

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína (Vídeo) | JoVE Journal

Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

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