Detecção de doença associada α-sinucleína por ELISA reforçada no cérebro de ratinhos transgénicos que sobre-expressam A53T Humano Mutante α-sinucleína

O objetivo geral do seguinte experimento é monitorar o acúmulo da alfa-sinucleína associada à doença em um modelo de camundongo transgênico da doença de Parkinson usando uma abordagem Eliza quantitativa. Isso é realizado permitindo que camundongos não inoculados envelheçam normalmente ou inoculando camundongos por via intracerebral com um extrato cerebral de M 83 doente. Após os camundongos desenvolverem a doença clínica e serem sacrificados, as regiões cerebrais dos camundongos são dissecadas.

Em seguida, homogeneizados de cada região cerebral são preparados em tampão de sal alto, e o Eliza é realizado no homogeneizado para quantificar a alfa-sinucleína associada à doença em cada região cerebral. Os resultados do Eliza mostram que a forma associada à doença da proteína alfa-sinucleína está principalmente se acumulando nas regiões cerebrais codil, incluindo o mesencéfalo e o tronco cerebral, bem como nas medulas espirais dos camundongos. A principal vantagem desta técnica Eliza em comparação com os métodos disponíveis anteriormente, como western blot ou imunohistoquímica, é que ela fornece uma quantificação rápida e confiável da alfa-sinucleína associada à doença.

Neste modelo experimental, este método pode ajudar a monitorar o acúmulo e a propagação desta proteína no sistema nervoso central destes camundongos M 83. Isso sugere o envolvimento de um mecanismo semelhante ao do cérebro até o desenvolvimento da ciência clínica. Desenvolvimentos adicionais deste método podem ser considerados no futuro para o estudo de várias amostras biológicas, como o fluido cerebroespinal ou o sangue, que possivelmente também contêm formas alteradas de alfa demonstrando que este procedimento será um técnico do nosso laboratório.

Todos os procedimentos e protocolos envolvendo animais estavam em conformidade com a diretiva CE 86 6 0 9 CEE e ratificados pelo comm ETH, o Comitê Nacional Francês. Para Consideração de Ética e Experimentação Animal, os animais foram abrigados e cuidados em instalações experimentais aprovadas em A e S em Leon Young após a eutanásia dos camundongos e a recuperação dos cérebros e medula espinal. De acordo com o protocolo do texto, coloque um cérebro inteiro em uma placa de Petri no gelo sob magnificação de baixo poder.

Comece separando um dos dois bulbos olfativos colocando uma pinça logo atrás do bulbo. Usando um movimento descendente, desconecte-o do cérebro, em seguida, remova o segundo bulbo de maneira semelhante. Agora, usando uma pinça para manter o cérebro no lugar, gentilmente insira uma segunda pinça entre os córtices esquerdo e direito e mova-os para frente para dissociar as duas metades.

Agora, continuando a manter o cérebro no lugar. Posicione a segunda pinça, dois milímetros atrás do córtex, e mantenha a pressão para cima para levantar o córtex do hipocampo. Em seguida, descole a primeira parte do córtex começando no hipocampo e movendo-se em direção à frente do cérebro.

Repita com a segunda metade. Em seguida, posicione a pinça aberta ao redor de um dos hipocampos. Em seguida, gentilmente feche a pinça na parte inferior do órgão e remova-a suavemente.

Repita com o segundo hipocampo. Posicione a pinça atrás de um dos estriado e gentilmente separe-o do cérebro. Use a pinça para remover qualquer córtex restante do estriado antes de remover o segundo satu para separar o cerebelo do resto do cérebro com a pinça, gentilmente pressione o contorno do cerebelo.

Em seguida, coloque a pinça atrás do cerebelo e mova a pinça para frente para removê-la usando a parte larga da pinça levantada, eles como cefalão, que é composto por quatro estruturas redondas para ver claramente onde a junta se conecta ao tronco cerebral. Em seguida, faça uma incisão vertical na junção antes de remover o tronco cerebral, posicione a pinça atrás do mesencéfalo e, em tamanho vertical, para separá-lo completamente do cérebro restante. Para preparar o cérebro homogêneo, adicione um volume adequado de tampão HS às regiões cerebrais dissecadas para atingir um percentual esperado de homogeneizado, conforme mostrado na tabela abaixo.

Usando um triturador de tecido composto por tubo de vidro de silicato de boro e pestinhos de tubo A e B, despeje uma região cerebral a ser esmagada no tubo. E então, com o pilão a, homogeneize o tecido 10 vezes para dissociá-lo. Em seguida, mude para o pilão B e homogeneize mais 20 vezes.

Com uma pipeta de transferência, transfira o homogeneizado para um tubo de 1,5 mililitros, repetindo a homogeneização com as amostras cerebrais restantes. Centrifugue as amostras a 1000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, recolha o snat e divida-os em Ali Watts de 200 microlitros. Armazene a -80 graus Celsius para análise Eliza subsequente para realizar Eliza no cérebro homogêneo.

Comece usando 50 micromolar de tampão de carbonato para diluir o anticorpo anti alfa-sinucleína, coelho policlonal ou monoclonal clone 42, para 0,01 nanogramas por mililitro com 100 microlitros da solução de revestimento de anticorpos, revestindo os poços de uma microplaca de 96 poços e incubando a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Adicione 300 microlitros de PBST aos poços e use uma lavadora de placas para lavar as placas cinco vezes enquanto trabalha em temperatura ambiente.

Avançando, adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio T 20 PBS a cada poço e agite as placas a 150 RPM por uma hora antes de usar PBST para lavar as placas cinco vezes usando PBST 1%BSA dilua o cérebro homogêneo usando as diretrizes listadas aqui e adicione 100 microlitros a cada um. Bem, então, incube em temperatura ambiente e 150 RPM por duas horas antes de usar PBST para lavar as placas. Cinco vezes após a lavagem final, adicione os anticorpos de detecção de alfa-sinucleína necessários, diluídos em PBS BST e 1%BSA, conforme listado na tabela dois do protocolo de texto, incube em temperatura ambiente e 150 RPM por uma hora antes de lavar as placas cinco vezes como antes.

Em seguida, adicione anticorpos conjugados IgG HRP anti-rato ou anti-coelho diluídos para um para 8.000 em PBST 1%BSA e incube a 150 RPM por uma hora antes de lavar as placas cinco vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros da solução TMB a cada poço e incube a 150 RPM por 15 minutos no escuro. Pare a reação adicionando 100 microlitros de um ácido clorídrico normal por poço.

Em seguida, use um leitor de microplacas para medir a absorbância a 450 nanômetros para análise de dados. Subtraia o valor de densidade óptica obtido no poço em branco contendo apenas tampões e reagentes da densidade óptica.

Os valores determinados a partir de amostras cerebrais realizam análise estatística de acordo com o protocolo de texto neste estudo, o Eliza realizado identificou especificamente a alfa-sinucleína associada à doença pser 1 29 em cérebros homogêneos de camundongos doentes M 83. Camundongos não presentes em camundongos jovens M 83. Anticorpos adicionais testados como LB 5 0 9 mostraram sinais fortes em camundongos doentes, mas não em saudáveis.

A sensibilidade analítica do ELIZA descrito neste vídeo foi comparada a um método de western blot descrito anteriormente