Name: Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a produzir esferoides de células cancerosas em formato de alta vazão usando um sistema aquoso bifásico com polietilenoglicol e dextrano. Este método robótico permite testes eficientes de drogas anticâncer em placas de 96 poços.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores reconhecem o financiamento do National Institutes of Health R21CA182333.

1. Preparação de polimérica aquosa sistema de duas fases (SADF) <ol><li> Pesar 0,5 g de polietileno glicol (PEG) (PM: 35.000) e adicioná-lo a 9,5 ml de meio de crescimento completo numa cónico de 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) de PEG fase aquosa. Nota: A adição de metade do meio com o primeiro cónica seguido pela adição do polímero e, em seguida, a quantidade remanescente de forma minimiza a adesão do polímero às paredes cónicas e ajuda o polímero dissolver-se mais rapidamente. </li><li> Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) e adicioná-lo a 0,872 ml de meio de crescimento completo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar a 1 ml de 12.8% (w / v) de fase aquosa DEX. </li><li> Vortex tanto soluções durante cerca de 1 min para dissolver os polímeros na forma. </li><li> Mantenha as duas soluções num banho de água a 37 ° C durante 1 hora para assegurar a dissolução e misturas homogéneas. Manter as tampas acima do nível de água para evitar a possibilidade de contaminação das soluções do banhoágua. </li><li> Carregar a solução em uma fase de PEG estéril, uma seringa de plástico e passá-la através de um filtro de seringa de 0,2 um de tamanho dos poros para remover as impurezas. Nota: Encher a seringa com a solução de PEG, colocá-lo na inserção do filtro no topo de um tubo cónico e utilizar a força, empurrar lentamente a solução através do filtro. É normal a ocorrência de resistência contra o movimento do êmbolo da seringa. Menor perda da solução de polímero ocorre como parte da solução permanece no filtro, mas a concentração de polímero não irá mudar. </li><li> Pipetar 10 ml da solução da fase de DEX e dilui-lo em 10 ul de meio em um tubo separado para resultar em 6,4% (w / v) de fase DEX. Aspirar 100 ul da solução da fase de PEG e fornecê-las a uma placa de Petri. <ol><li> Dispensar a 0,5 ul de 6,4% (w / v) de fase DEX na solução de fase de PEG. Confirme visualmente formação ATPS sucesso observando uma queda DEX sob um microscópio. O limite gotadeve permanecer visível, indicando presença de duas fases aquosas estáveis, separados. </li></ol></li><li> Guarde o estoque aquoso PEG e soluções fase DEX em 4 ° C até o uso. Nota: Recomenda-se que as soluções de polímeros são preparados fresco antes de cada experiência e utilizada dentro de 24 horas de armazenamento. </li></ol> 2. Preparação para a Impressão de Câncer Spheroids Celulares <ol><li> Crescer as células cancerosas de interesse (por exemplo, células MDA-MB-157 de cancro da mama) com um 90% -100% monocamada confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar um meio composto por DMEM contendo 10% de FBS, 1% de glutamina, e 1% de antibiótico. <ol><li> Células colheita, usando um tampão de dissociação celular (de acordo com o protocolo do fabricante) e carregar a suspensão para um cónico de 15 ml. Centrifuga-se que durante 5 min a 173,3 xg, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de crescimento completo. </li></ol></li><li> As células de carga em um hemocitômetro e contá-los para calcular o número necessáriode células para uma densidade de células desejada esferóide. Uma monocamada confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas em um frasco T75 geralmente dá ~ 7 x 10 6 células. Recomenda-se a densidade celular Requerida para um volume de gota para gerar um único esferóide dependerá do tipo de célula 22 Por exemplo, uma densidade de 1,5 x 10 4 ou maior para MDA-MB-157 células por 0,3 ul de fase gota a DEX: Nota. assegurar a formação de um único esferóide. </li><li> Centrifugar células para uma segunda vez durante 5 min a 173,3 x g e ressuspender-los num volume apropriado de meio de crescimento para concentrar a suspensão até uma densidade de células desejada. Nota: Por exemplo, se 7 x 10 6 células cancerosas foram colhidas, o volume total de suspensão de células necessário para formar um esferóide de densidade de 1,5 x 10 células em 4 ul de 0,3 DEX gota fase será de 140 ul. No entanto, devido à diluição com a solução da fase de DEX no passo seguinte, utilizar apenas 70 ul de meio de cultura celular para ressuspender as células. </li><li&gt; Adicionar a suspensão de células resultante num volume igual de 12,8% (w / v) de solução aquosa de fase DEX preparado em 1.2. Para o exemplo de densidade esferóide 1,5 x 10 4 células, 70 ul da solução da fase de DEX é adicionado a 70 uL de suspensão de células. </li><li> Misture bem a suspensão de células para garantir a distribuição uniforme de células e mistura de solução DEX. A pipetagem para cima e para baixo deve ser feito com cuidado para evitar a formação de bolhas. </li></ol> 3. Preparação para a Impressão de Spheroids Co-cultura <ol><li> Crescer as células cancerosas (por exemplo, MDA-MB-157 células de cancro da mama humano) e células de suporte (por exemplo, fibroblastos humanos) para um de 90% -100% monocamada confluente. Colheita de cada tipo celular utilizando um tampão de dissociação de células (de acordo com o protocolo do fabricante). <ol><li> Carregar cada suspensão numa cónico de 15 ml e centrifugar para clarificação durante 5 min a 173,3 x g, e a partir de cada sobrenadante aspirado cónica. Ressuspender as células de cada cónica em 1 ml de completa gmédio rescimento. Nota: corantes fluorescentes tais como Calceina AM (mancha de células vivas) e corantes nucleares (Hoechst) pode ser utilizada para distinguir os dois tipos de células. </li></ol></li><li> Carregar cada tipo de célula separadamente para um hemocitómetro e contá-las para calcular o número necessário de cada tipo de célula para uma proporção desejada de células cancerosas para células de suporte em esferóides co-cultivadas. As monocamadas confluentes de células MDA-MB-157 e as células fibroblastos cultivadas em frascos T75 geralmente dar 7 x 10 ~ 6 e 10 ~ 6 x 6 células, respectivamente. </li><li> Adicionar o volume correcto a partir da suspensão de células de suporte para as células cancerosas suspensão para dar uma proporção desejada dos dois o número de tipos de células. Por exemplo, usar uma proporção de 50 células cancerosas para 1 célula de fibroblasto. </li><li> Centrifugar a cónico contendo a suspensão celular misturada durante 5 min a 173,3 xg células e ressuspender em um volume apropriado para resultar na densidade final compreendendo de volumes iguais de meio de crescimento e a 12,8% (w / v) aquosa DEXem fase de solução (preparado em 1.2). </li><li> Pipeta suavemente a suspensão de células resultante para cima e para baixo para assegurar a homogeneidade da suspensão. </li></ol> 4. Impressão de esferóides de Tumor em uma placa de 96 poços <ol><li> Um dia antes das experiências, revestimento, de fundo redondo de placas de 96 poços não tratados com 1% (w / v) de Pluronic a 37 ° C durante 24 horas. Este revestimento impede a fixação das células durante o período de cultura. </li><li> Dispensar a 50 ul de filtrado 5% (w / v) de fase aquosa de PEG em cada poço de uma placa de 96 poços (placa de destino). </li><li> Usando uma pipeta, mistura da suspensão de células (preparado no passo 2 passo 3 ou para mono- e co-cultura, respectivamente) e adicionar 20 ul da suspensão a cada poço de uma outra coluna de uma placa de 384 poços (placa de fonte) . </li><li> Ligue o manipulador de líquidos e &quot;casa&quot; a cabeça de pipetagem para registrar as coordenadas. Em seguida, elaborar um protocolo previamente definido (abaixo de 4.6) para garantir material de laboratório e os parâmetros são definidos corretaly. Este &quot;homing&quot; passo pode ser diferente para manipuladores de líquidos diferentes. Nota: O fluxo do protocolo, mostrado passo-a-passo abaixo em 4.6, será semelhante independentemente do manipulador de líquidos robótico usado; no entanto, a interface de programação podem ser diferentes, devido à utilização de software diferente. </li><li> Colocar a placa de fonte, a placa de destino, e caixas de ponta da pipeta em posições definidas na estação de trabalho do manipulador de líquidos, tal como mostrado na Figura 1. </li><li> Executar o protocolo que inclui os seguintes passos: <ol><li> Coloque uma coluna de barris de cabeça pipetagem do manipulador líquido com mistura pontas de pipeta (8 pontas) da estação de trabalho (Figura 1). </li><li> Misture a suspensão de células em cavidades da placa de fonte (Figura 1). Escolher um volume de mistura menor do que o volume de suspensão de células em poços para evitar a formação de bolhas. </li><li> Ejetar dicas em uma caixa de aterros vazio (Figura 1). </li&gt; <li> Carregar uma coluna de barris de a cabeça de pipetagem com 10 ul de distribuição de pontas de pipetas (Figura 1). </li><li> Aspirar 0,3 ul da suspensão de células a partir da placa de fonte (Figura 1) em cada ponta de pipeta. </li><li> Dispensar a suspensão de células em cavidades de uma coluna da placa de destino (Figura 1). Utilize uma altura de distribuição de 0,5 mm e um caudal de distribuição de menores do que 1? L / seg. </li><li> Repita os passos 4.6.1 4.6.6 através de impressão até a coluna-a-coluna para a totalidade da placa de destino é completa. </li></ol></li><li> Remover cuidadosamente a placa de destino a partir da superfície da estação de trabalho e colocá-lo numa incubadora húmida a 37 ° C e 5% de CO 2. Manter a placa horizontal quando o levar para a incubadora para evitar prejudicar o de gotas de fase DEX contendo células. </li><li> Incubar a placa durante 24 h, para permitir a agregação de células num esferóide dentro da gota fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Drug Treatment of Cancer Spheroids Celulares Note-se que o protocolo seguinte é para um tratamento medicamentoso de 4 dias e inclui uma renovação com droga fresca após dia 2. Ela pode ser modificado para outros períodos de tratamento. <ol><li> Confirmar visualmente a formação de esferóides, em placas de 96 poços depois de 24 horas. Se necessário, poços de imagem para medição do tamanho de esferóides pela média das menores e maiores diâmetros de cada esferóide. </li><li> Preparar a solução de stock de um medicamento desejado, dissolvendo-o num solvente recomendado pelo fabricante, a uma concentração pré-determinada a solubilidade. Por exemplo, dissolve-se a cisplatina em água a 2 mg / ml. Nota: Proteja a solução estoque da droga da luz, se a droga é sensível à luz. </li><li> Usando a técnica de diluição em série, preparar as concentrações de droga diluídas com meio de cultura de células a partir da solução preparada no passo anterior. Cada diluição deve ser feita duas vezes a concentração desejada. Dilrácios ution irá variar dependendo da concentração do material de partida desejado e concentrações de trabalho. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de droga foi preparada na etapa anterior a cada poço. Isto pode ser realizado roboticamente ou por pipetagem manual. Nota: Cada concentração de droga será diluído para metade, para a concentração desejada por 50 ul da fase aquosa PEG já em cada poço. <ol><li> Use esferóides de duas colunas de uma placa de 96 poços (n = 16) para cada concentração. </li><li> Em cavidades de controlo, adicionar apenas 50 ul de meio de cultura fresco aos 50 ul existentes da fase aquosa PEG. </li></ol></li><li> Incubar esferóides com o fármaco durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, protegido da luz. </li><li> Após 48 horas de incubação, preparar diluições frescas de droga em concentrações desejadas e renovar droga por adição de 50 uL de solução de droga fresco a cada poço. Nota: Os poços já conter a concentração da droga desejada a partir da primeira droga tratamento. Por conseguinte, nesta fase renovação, cada concentração é preparada na concentração desejada, desde que não irá ocorrer a diluição. </li><li> Incubar esferóides com a droga durante mais 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, protegido da luz. </li></ol> 6. Análise de Viabilidade Celular em esferóides <ol><li> Após 48 horas de incubação com renovada droga (isto é, o tempo total de tratamento de esferóides com um fármaco é de 4 dias), medir o volume total do meio de um bem por pipetagem manual. Nota: O volume típica em um poço é de ~ 140 mL (uma pequena diminuição ocorre devido à evaporação). </li><li> Calcular o volume de reagente a viabilidade das células (por exemplo, PrestoBlue) como a concentração de 10% do volume total do bem. Adicionar o volume de reagente a viabilidade das células para cada poço. Nota: Com um volume de suporte existente de 140 pi de um poço, num volume de 15,6 uL é necessária para dar uma concentração de 10% do total bem. Este valor é calculadodividindo o volume de mídia existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 ul). </li><li> Incubar a placa, com o reagente de viabilidade celular adicionada a cada poço, durante 6 h a 37 ° C, protegida da luz. </li><li> Colocar a placa num leitor de micro-placa e ler o sinal de fluorescência a 560 nm e 590 nm de excitação e de emissão de comprimentos de onda, respectivamente. </li><li> Calcula-se a percentagem de viabilidade de células em esferóides com a normalização do sinal fluorescente de poços tratados para os poços de controlo de que a média dos valores depois de as mesmas condições de tratamento. </li></ol>

<ol><li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li>
<li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+new+drug+launches%3A+myth+or+reality%3F+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+the+other+face+of+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Rec.+Results+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li>
<li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li>
<li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation%2C+culture%2C+harvesting+and+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).</li>
<li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250(2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures%3A+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li>
<li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tension-mediated%2C+concave-microwell+arrays+for+large-scale%2C+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li>
<li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+imaging%2C+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li>
<li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput%2C+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li>
<li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li>
<li>Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li>
<li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878(2014).</li>
<li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li>
<li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells%3A+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444(2010).</li>
<li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cance%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+tumours+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Spheroids apresentar um modelo realista para compreender melhor a fisiologia tumor e eficácia da droga e fornecer uma ferramenta útil para anti-câncer de descoberta de drogas. Tais aplicações iria beneficiar muito de técnicas simples de geração e manutenção esferóide que exigem apenas o material de laboratório padrão, ferramentas de manipulação de líquidos e equipamentos de rastreio. O uso de um sistema aquoso de duas fases nas células cancerosas, espontaneamente agregados dentro da fase gota permite a produção eficient...

Ensaios baseados em células fornecer uma ferramenta importante para o desenvolvimento e descoberta de novos fármacos anti-cancro. 1,2 Historicamente, culturas em monocamada de células de cancro têm sido utilizados para investigar a eficácia dos compostos candidatos em relação a determinados tipos de células cancerosas. A facilidade de manutenção das culturas em monocamada em placas de cultura padrão, o grau de compatibilidade de placas padrão com ferramentas comerciais robóticos para a adição de reagentes, e com equipamentos de controlo para análise de respostas celulares a jusante para os compostos químicos são os principais benefícios que tornam culturas 2D uma ferramenta atraente para testes de drogas 3. Infelizmente, os ensaios em monocamada de células muitas vezes não conseguem prever a eficácia de compostos in vivo, tornando o desenvolvimento de drogas e descoberta de um processo extremamente caro. 4,5 Apesar de investimento e esforço significativo por empresas farmacêuticas e unidades acadêmicas, apenas cerca de 1% de anti-câncer drogas em ensaios clínicos foram aprovadospelo FDA nos últimos duas décadas. 6 Disparidade entre as culturas em 2D e 3D ambiente complexo de células cancerosas in vivo é uma grande falha dos sistemas de cultura em monocamada. 7 Portanto, a triagem de compostos candidatos contra células tumorais em um cenário que mais se assemelha o ambiente tumor 3D pode acelerar o desenvolvimento de novas drogas de quimioterapia. 8 Esferóides de células de cancro apresentar um modelo de tumor in vitro 3D relevante. 9,10 esferóides compactos são aglomerados que se formam através da montagem espontânea ou induzida de células cancerosas em superfícies não-aderentes ou em suspensão, utilizando técnicas tais como balão giratório, sobreposição de líquido, microbiologia microfabricado . bem arrays, microfluídica, e gotas de suspensão 11-16 Spheroids imitar características-chave de tumores sólidos, incluindo geometria e limitado de transporte de oxigênio, nutrientes e compostos de drogas na zona central; Assim, eles se regenerar mais de perto respon drogase de tumores sólidos, em comparação com as culturas de monocamada 17-19 Apesar deste benefício marcado., esferóides não são rotineiramente utilizados para o rastreio de compostos químicos contra as células cancerosas. Dificuldade de produzir esferóides tamanho uniforme em um cenário de alta taxa de transferência padrão que é compatível com a robótica comercialmente disponíveis e ferramentas de triagem / imagem impede a incorporação da cultura esferóide em pipeline de desenvolvimento de medicamentos. Embora os materiais e placas personalizadas tornaram-se recentemente disponível no mercado para atender a essa necessidade, considerações de custo dissuadir a sua utilização generalizada. Duas importantes técnicas com a capacidade de produzir esferóides porte consistentes em alto rendimento utilizar uma nova plataforma de gota suspensa e micro-poços microfabricados 13,16,20. No entanto, ambas as abordagens requerem placas e dispositivos que são caros para fabricar e inconveniente para os usuários de endpoint especiais em centros de pesquisa do núcleo e indústrias farmacêuticas, onde o mais importante de effortes para a descoberta de novas drogas anti-cancerosas são feitos. Apesar de algumas melhorias na estabilidade de gotas contendo células com um projeto recente de pendurar placas de queda, apenas um ou outro buraco da placa ainda é usado durante a cultura para evitar a propagação / fusão de gotas. 16 Isto diminui significativamente o rendimento experimental. Adição da droga e de renovação é difícil com o manual ou pipetagem robotizada esferóides e precisam de ser transferidos para uma placa padrão para a análise bioquímica porque esta configuração placa não é facilmente compatível com o equipamento de rastreio convencionais, tais como leitores de placas. 21 As micro-poços fabricados utilizando litografia macia também permitir tamanho controlado produção esferóide. 13,20 No entanto, a incompatibilidade desta plataforma com ferramentas de pipetagem padrão impede o tratamento de esferóides individuais com diferentes compostos de drogas / concentrações, expondo todos os esferóides a uma condição de tratamento individual. Assim, este método não é apropriado para elevadorastreio de compostos caudal que requer o teste simultâneo de vários compostos / concentrações. Para superar estes obstáculos, uma nova técnica de alto rendimento de produção de esferóides de células de cancro tamanho consistente em placas de 96 poços padrão foi desenvolvido. 22,23 A abordagem baseia-se num sistema de duas fases aquosa polimérica (SAB) com polietileno-glicol ( PEG) e dextrano (DEX) como polímeros de formação de fases. 24 ATPSs foram recentemente utilizado em uma variedade de aplicações biológicas romance celulares que permitam micropatterning célula e entrega localizada de reagentes biológicos para as células em meios aquosos altamente 25-32. Para formar uma esferóide, as células cancerosas são misturados com a fase aquosa DEX e uma gota de sub-microlitros da suspensão resultante é pipetada para dentro de uma solução aquosa de fase de PEG contendo a imersão bem. A queda continua a fase imiscível de imersão e confina células para facilitar a formação de um esferóide. Diabinhoortantly, a fase de imersão altamente aquoso fornece os nutrientes para as células do esferóide e minimiza o problema bem conhecido de evaporação meios comum para alguns outros ensaios que causa mudanças na osmolalidade meios e flutuações de concentrações de droga. Esta técnica permite a produção esferóide e tratamento de drogas só utilizando reagentes comercialmente disponíveis e as ferramentas de pipetagem em placas de 96 poços convencionais. É importante notar que a análise de respostas celulares de esferóides é realizada na mesma placa por meio de ensaios bioquímicos convencionais e leitores de placas. A facilidade de trabalhar com ATPS e adaptabilidade da abordagem para manipulação de líquidos robótico faz geração de alto rendimento de ambos mono-cultura e co-cultura esferóides uma técnica de laboratório simples. Esta nova abordagem será um grande passo à frente em direção à integração de esferóides de células cancerosas em processos de desenvolvimento de drogas e de descoberta com melhor rendimento testes e custo-efetividade (aumento do número de compostos testados e reduconsumo ced reagente) e eficiência (reduzindo mãos no tempo). Um protocolo detalhado para produção robótico de esferóides de células de cancro em placas de 96 poços utilizando a abordagem APTS é descrito abaixo. Além disso, os detalhes do tratamento medicamentoso de esferóides resultantes e análise de respostas celulares a jusante utilizando um ensaio bioquímico comercial são apresentados.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentes e consumíveis</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol, MW: 35.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500.000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatina</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Pontas Descartáveis (10 &micro; l)</td> <td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Pontas Descartáveis (70 &micro; l)</td> <td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços de fundo redondo</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4 ">Equipment</td></tr><tr><td>Liquid Handler Agilent</td><td>Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

produção robotic da cancer cell spheroids com um sistema aquoso bifásico para drug testing

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Os esferoides de células cancerígenas apresentam um modelo in vitro relevante de tumores avasculares para aplicações de testes de drogas anticâncer. Um protocolo detalhado para a produção de esferoides de monocultura e cocultura em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento é descrito neste trabalho. Essa abordagem utiliza um sistema aquoso de duas fases para confinar as células em uma gota da fase aquosa mais densa imersa na segunda fase aquosa. A gota repousa na superfície do poço e mantém as células próximas para formar um único esferóide. Essa tecnologia foi adaptada a um manipulador robótico de líquidos para produzir esferoides com tamanho controlado e agilizar o processo de produção de esferoides para aplicações de triagem de compostos. Os esferoides tratados com um medicamento de uso clínico apresentam viabilidade celular reduzida com o aumento da dose do medicamento. O uso de uma placa de micropoço padrão para geração de esferoides facilita a análise da viabilidade de células cancerígenas de esferoides tratados com medicamentos com um leitor de microplacas. Essa tecnologia é simples de implementar roboticamente e com outras ferramentas de manuseio de líquidos, como pipetas manuais.

A estação de trabalho do manipulador de líquidos robótico é mostrado na Figura 1. A cabeça de pipetagem e todas as estações utilizadas na impressão robótico de esferóides na secção 4.6 são rotulados. A imagem mostra a utilização de duas estações diferentes para caixas de ponta (um conjunto de dicas para a mistura e o segundo conjunto para aspiração / dispensação de mistura fase DEX suspensão aquosa de células). Toda a configuração está alojado dentro de um armário de norma de segurança biológica para ma...

Um protocolo para impressão robótica de esferoides de células cancerígenas em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento usando um sistema aquoso de duas fases é apresentado.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

O objetivo geral deste procedimento é formar células cancerígenas em pH padrão em um formato de alto rendimento, com o fim de utilizá-las em testes de fármacos anticancerígenos. Isso é realizado primeiramente dissolvendo dois polímeros, polietileno glicol e dextran, em meio de cultura celular em concentrações predeterminadas para formar um sistema aquoso bifásico bem-sucedido. O segundo passo consiste em preparar as células de interesse com o dobro da densidade celular desejada e misturar a suspensão celular com um volume igual da fase aquosa de dextran.Em seguida, preencha uma placa de 96 poços com a fase aquosa de polietilenoglicol e dispense gotas submicrolitros da fase de dextrano contendo células nos poços utilizando um robô de manipulação líquida. O próximo passo é confirmar a formação de esferoides nas placas de 96 poços após 24 horas de incubação e adicionar diretamente os fármacos anticâncer de interesse aos poços. Por fim, utiliza-se um ensaio de viabilidade compatível com leitora de placas padrão para mostrar a porcentagem de viabilidade dos esferoides tratados com fármacos, normalizada em relação aos esferoides controle não tratados.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o método da gota suspensa ou a abordagem de poços microfabricados, é que ela não exige placas ou dispositivos personalizados e permite a formação de esferoides e testes de fármacos em alto rendimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na pesquisa do câncer e acelerar a descoberta de quimioterápicos antineoplásicos. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia do câncer, pois permitem triagem em alto rendimento de compostos químicos com modelos de tumor mais relevantes para identificar novas drogas anticâncer.Indivíduos novos neste método formarão convenientemente esteroides de células cancerígenas e microplacas e realizarão facilmente experimentos de tratamento com fármacos usando equipamentos de laboratório padrão e ferramentas robóticas. Para começar, pese 0,5 gramas de polietilenoglicol e adicione a 9,5 mililitros de meio de crescimento completo em um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Vortex a mistura por um minuto para preparar 10 mililitros de uma fase aquosa de polietilenoglicol a 5% peso por volume. Em seguida, pese 0,128 gramas de dextrana e adicione a 0,87.Duas mililitros de meio de crescimento completo em um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Vortex. Essa mistura por um minuto para preparar um mililitro de uma fase aquosa de dextrana a 12,8% peso por volume. Coloque ambas as soluções, de polietilenoglicol e de dextrana, em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora.Para auxiliar na dissolução completa. Certifique-se de que as tampas permaneçam acima do nível da água para evitar possível contaminação após uma hora. Remova a solução de polietilenoglicol e transfira-a para uma seringa plástica estéril de cinco mililitros.Passe a solução através de um filtro de seringa com poro de 0,2 mícrons para remover quaisquer impurezas. Armazene ambas as soluções de fase, polietilenoglicol e dextrana, a quatro graus Celsius por até 24 horas antes do uso. Cultive as células cancerígenas de interesse, como a linhagem de células de câncer de mama M-D-A-M-B 1 57, até que atinjam 90 a 100% de confluência.Em seguida, colha as células utilizando técnicas padrão e conte o rendimento em um hemocitômetro; ressuspender o pellet em uma concentração de 50 milhões de células por mililitro em uma mistura contendo metade meio de crescimento e metade solução de strand. Isso garante uma densidade de aproximadamente 15.000 células por gota de 0,3 microlitro. Dispense 50 microlitros da fase aquosa de polietileno glicol a 5% filtrada em cada poço de uma placa de 96 poços não aderente previamente codificada com onic, conforme descrito no protocolo de texto complementar. A adição de polietileno glicol pode ser realizada manualmente com uma pipeta multicanal ou roboticamente com um manipulador de líquidos, utilizando uma pipeta para misturar a suspensão celular por pipetagem suave para cima e para baixo a fim de ressuspender.Suspenda quaisquer células que tenham sedimentado ao longo do tempo. Adicione 20 microlitros da suspensão a todas as outras poças de uma coluna de uma placa de 384 poças. Em seguida, ligue o manipulador de líquidos e leve a cabeça de pipetagem à posição inicial.Para registrar as coordenadas, coloque a placa de origem, a placa de destino e as caixas de ponteiras em posições definidas na estação de trabalho do manipulador de líquidos. Utilizando o manipulador de líquidos automatizado, selecione um volume de mistura, aproximadamente um terço do volume da suspensão celular, e carregue uma coluna de cilindros da cabeça de pipetagem do manipulador com ponteiras de pipeta para mistura provenientes da estação de trabalho. Use o manipulador de líquidos para misturar a suspensão celular na placa de origem de 384 poços.Em seguida, ejetar as ponteiras em uma caixa vazia para ponteiras descartadas. A seguir, carregue uma coluna de cilindros da cabeça de pipetagem com ponteiras de pipeta dispensadoras de 10 microlitros. Utilize o manipulador líquido para aspirar 0,3 microlitros da suspensão celular da placa de origem para cada ponteira de pipeta.Em seguida, distribua a suspensão celular nos poços de uma coluna da placa de destino contendo 50 microlitros da fase de polietileno glicol a 5%. Utilize uma altura de distribuição de 0,5 milímetros e libere a gota numa taxa de fluxo de um microlitro por segundo ou mais lenta. Repita este processo até que todas as colunas da placa de destino tenham sido preenchidas com células; ao finalizar, remova cuidadosamente a placa de destino da estação de trabalho e incube as células em ambiente umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes de qualquer tratamento com fármaco.Confirma visualmente a formação de esteroides em cada poço da placa de 96 poços após 24 horas de cultivo. Utilize diluição seriada para preparar uma droga de interesse, como o cisplatina, para teste. Dilua a solução estoque da droga no meio de cultura de modo que cada diluição seja duas vezes a concentração final desejada.Até cinco concentrações diferentes podem ser testadas por placa de 96 poços. Adicione 50 microlitros da solução do fármaco na fase de polietileno glicol de cada poço. Utilize duas colunas de oito poços por grupo de tratamento, incluindo um grupo controle ao qual se adiciona apenas o meio de cultura.Incube os esteroides com o fármaco por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, protegido da luz. Após 48 horas, prepare novas diluições do fármaco e reponha o fármaco adicionando mais 50 microlitros de meio contendo fármaco fresco na concentração desejada. Incube o PHE por mais 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, protegido da luz.Em seguida, adicione um reagente de viabilidade celular a cada poço conforme descrito no protocolo textual acompanhante e incube a placa por seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, protegida da luz. Quando o ensaio estiver concluído, coloque a placa em um leitor de microplacas e leia o sinal fluorescente nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 560 e 590 nanômetros, respectivamente. A triagem em alta produtividade de fármacos anticâncer exige uma maneira reprodutível de formar centenas de esteroides de tamanho uniforme.O gráfico mostrado aqui enfatiza a reprodutibilidade deste método para formar esferoides. Em uma placa padrão de 96 poços, o diâmetro médio foi de 332 mícrons, com um desvio padrão inferior a 10%. As variações nos diâmetros dos esferoides mostraram ser típicas de uma distribuição normal. Quando os esferoides foram expostos por quatro dias a concentrações variáveis de cisplatina, uma droga quimioterápica clínica, eles exibiram uma resposta dependente da dose aos tratamentos.A concentração da dose letal 50% foi determinada como sendo 4,67 micromolar; o tratamento com a droga em concentrações letais desintegrou espécies de células cancerígenas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em aproximadamente duas horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar rapidamente a formação de duas fases aquosas antes de prosseguir para experimentos de impressão de esteroides. Após este procedimento, outros métodos, como crioseccionamento, coloração imuno-histoquímica de esteroides nas amostras e outros ensaios biológicos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre os alvos moleculares de drogas em esteroides de células cancerígenas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como formar culturas tridimensionais de células cancerígenas de maneira prática e realizar testes de fármacos de forma de alto rendimento, utilizando placas e dispositivos padrão.

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Uma grande variedade de indicações de doença, modelos mais fisiologicamente relevantes estão sendo programas de descoberta de drogas desenvolvida e implementada em. O novo sistema de modelo aqui descrito demonstra como tridimensional tumor esferoides podem ser cultivadas e exibidos em um sistema de baseado em placa de 1536-bem elevado-throughput para pesquisar novas drogas de Oncologia.

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Este protocolo destina-se a avaliar a citotoxicidade de células T (células T carro) imunoterapia redirecionada contra células cancerosas estruturadas 3D (esferoides) em tempo real.

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.

Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Aprenda a produzir esferoides de células cancerosas em formato de alta vazão usando um sistema aquoso bifásico com polietilenoglicol e dextrano. Este método robótico permite testes eficientes de drogas anticâncer em placas de 96 poços.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Explorar mais vídeos