Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Um protocolo para impressão robótica de esferoides de células cancerígenas em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento usando um sistema aquoso de duas fases é apresentado.

O objetivo geral deste procedimento é formar o pH das células cancerígenas em um formato padrão de alto rendimento, a fim de usá-las em testes de drogas anticâncer. Isso é feito dissolvendo primeiro dois polímeros, polietilenoglicol e dextrano em meio de cultura de células em concentrações predeterminadas para formar um sistema aquoso bifásico bem-sucedido. O segundo passo é preparar as células de interesse com o dobro da densidade celular desejada e misturar a suspensão celular com um volume igual da fase aquosa de dextrano.

Em seguida, encha uma placa de 96 poços com a fase aquosa de polietilenoglicol e dispense gotículas submicrolitros de células contendo gotas de fase dextrana nos poços usando um robô de manuseio de líquidos. O próximo passo é confirmar a formação de esferóides nas placas de 96 poços após 24 horas de incubação e adicionar diretamente medicamentos anticâncer de interesse aos poços. Finalmente, um ensaio de viabilidade compatível com leitor de placa padrão é usado para mostrar a porcentagem de viabilidade de esteróides tratados com drogas normalizadas contra esferas de controle não tratadas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o método de gota suspensa ou a abordagem de poço microfabricado, é que ela não requer placas ou dispositivos personalizados e permite a formação de esferas de alto rendimento e testes de drogas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa do câncer e acelerar a descoberta de quimioterápicos anticâncer. As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer porque permite a triagem de alto rendimento de compostos químicos com modelos de tumor mais relevantes para identificar novos medicamentos anticâncer.

Indivíduos novos neste método formarão convenientemente esteróides de células cancerígenas e placas de micro poços e conduzirão facilmente experimentos de tratamento de drogas usando roupas de laboratório padrão e ferramentas robóticas. Para começar, pesar 0,5 gramas de polietilenoglicol e adicioná-lo a 9,5 mililitros de meio de crescimento completo em um tubo cônico estéril de 15 mililitros Vortex, a mistura por um minuto para preparar 10 mililitros de uma fase aquosa de polietilenoglicol de 5% de peso por volume. Em seguida, pese 0,128 gramas de dextrano e adicione a 0,87.

Dois mililitros de meio de crescimento completo em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro Vortex. Esta mistura por um minuto para preparar um mililitro de uma fase aquosa de dextrano de 12,8% de peso por volume. Coloque as soluções de polietilenoglicol e dextrano em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora.

Para ajudar na dissolução completa. Certifique-se de que as tampas fiquem acima do nível da água para evitar possível contaminação após uma hora. Remova a solução facial de polietilenoglicol e coloque-a em uma seringa de plástico estéril de cinco mililitros.

Passe a solução por um filtro superior de seringa de poros de 0,2 mícron para remover quaisquer impurezas. Armazene as soluções de polietilenoglicol e dextrano a quatro graus Celsius por até 24 horas antes do uso. Cultive células cancerígenas de interesse, como a linha celular de câncer de mama M-D-A-M-B 1 57, até que sejam 90 a 100% confluentes.

Em seguida, colha as células usando técnicas padrão e conte o rendimento em um hemocitômetro, ressuspenda o pellet a uma concentração de 50 milhões de células por mililitro em uma mistura de solução de meio crescimento, média e meia fita. Isso garante uma densidade de cerca de 15.000 células por gotícula de 0,3 microlitro dispensando 50 microlitros da fase filtrada de polietilenoglicol a 5% em cada poço de uma placa de 96 poços não aderente que foi pré-codificada com onic conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. A edição de polietilenoglicol pode ser feita manualmente com a pipeta multicanal ou roboticamente com um manipulador de líquidos usando uma pipeta, misture a suspensão celular pipetando suavemente para cima e para baixo até Resus.

Suspenda todas as células que se estabeleceram ao longo do tempo. Adicione 20 microlitros da suspensão a todos os outros poços de uma coluna de uma placa de 384 poços. Em seguida, ligue o manipulador de líquidos e coloque em casa o cabeçote de pipetagem.

Para registrar as coordenadas, coloque a placa de origem, a placa de destino e as caixas de ponteiras de pipeta em posições definidas na estação de trabalho do manipulador de líquidos. Usando o manipulador de líquidos automatizado, selecione um volume de mistura, aproximadamente um terço do volume de suspensão da célula e carregue uma coluna de barris do cabeçote de pipetagem do manipulador de líquidos com pontas de pipeta de mistura da estação de trabalho. Use o manipulador de líquido para misturar a suspensão celular na placa de fonte de 384 poços.

Em seguida, ejete as pontas em uma caixa vazia de pontas de cintura. Em seguida, carregue uma coluna de barris do cabeçote de pipetagem com pontas de pipeta dispensadoras de 10 microlitros. Use o manipulador de líquidos para aspirar 0,3 microlitros da suspensão celular da placa de origem para cada ponta de pipeta.

Em seguida, dispense a suspensão celular nos poços de uma coluna da placa de destino contendo 50 microlitros da fase 5% de polietilenoglicol. Use uma altura de distribuição de 0,5 milímetros e dispense a gota a uma taxa de fluxo de um microlitro por segundo ou mais devagar. Repita esse processo até que todas as colunas da placa de destino estejam assentadas com células depois de concluídas, remova cuidadosamente a placa de destino da estação de trabalho e incube as células em um ambiente umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes de qualquer tratamento medicamentoso.

Confirma visualmente a formação de esteróides em cada poço da placa de 96 poços após 24 horas em cultura. Use diluição em série para preparar um medicamento de interesse, como a cisplatina, para teste. Dilua a solução estoque do medicamento em meios de cultura para que cada diluição seja duas vezes a concentração final desejada.

Até cinco concentrações diferentes podem ser testadas por 96. A placa de poço adiciona 50 microlitros da solução do medicamento na fase de polietilenoglicol de cada um. O poço usa duas colunas de oito poços por grupo de tratamento, incluindo um grupo de controle onde apenas o meio é adicionado.

Incube esteróides com a droga por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono protegido da luz. Após 48 horas, prepare novas diluições de medicamentos e renove o medicamento adicionando mais 50 microlitros de meio contendo novo medicamento na concentração desejada. Incube o PHE por mais 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono protegido da luz.

Em seguida, adicione um reagente de viabilidade celular a cada poço, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha e incube a placa por seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono protegido da luz. Quando o ensaio estiver concluído, coloque a placa em um leitor de microplacas e leia o sinal fluorescente em comprimentos de onda de excitação e emissão de 560 e 590 nanômetros, respectivamente. A triagem de alto rendimento de medicamentos anticâncer requer uma maneira repetível de formar centenas de esteróides de tamanho uniforme.

O gráfico mostrado aqui enfatiza a reprodutibilidade deste método para formar esferóides. Em uma placa padrão de 96 poços com média de 332 mícrons de diâmetro com um desvio padrão inferior a 10% As variações nos diâmetros dos esteróides foram consideradas típicas de uma distribuição normal. Quando os esferóides foram expostos por quatro dias a concentrações variadas de cisplatina, uma droga quimioterápica clínica, eles mostraram uma resposta dose-dependente aos tratamentos.

A concentração de droga de dose letal de 50% resultante foi de 4,67 Tratamento com drogas micromolares em concentrações letais sps de células cancerígenas desintegradas Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente duas horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar rapidamente a formação aquosa de duas fases antes de prosseguir com os experimentos de impressão de esteróides. Após este procedimento, outros métodos, como crioseccionamento de imuno-histoquímica de esteróides, coloração de amostras e outros ensaios biológicos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre alvos moleculares de medicamentos em esteróides de células cancerígenas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como formar culturas de células cancerígenas 3D de maneira conveniente e realizar testes de drogas de maneira de alto rendimento usando placas e dispositivos padrão.