Name: Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a cultivar células-tronco pluripotentes induzidas em placas de 96 poços usando um robô de manipulação líquida programável. Este método permite expansão escalável com manutenção da pluripotência e diferenciação em cardiomiócitos para aplicações terapêuticas.

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Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH, R44 e R01 GM087784 HL109505. Autores agradecer à equipa técnica e OEM em Gilson, INC para o suporte técnico estendido.

Os autores MKC, MJG, EEB, NJD e RO estão ou estavam no momento de funcionários de desenvolvimento de InvivoSciences, INC que conceberam e desenvolveram os protocolos robóticos descritos aqui. TW é o CSO para InvivoSciences INC. SH é um empregado de Gilson INC.

No presente estudo foi desenvolvido um método de cultura robótico para a produção iPSC que miniaturizes e automatiza alimentação e passagem em um formato de placa de 96 poços ao mesmo tempo, permitindo aumento de escala eficiente. Um robô de manipulação líquido foi utilizado para alimentar rotineiramente colónias IPSC e passagem los em intervalos regulares por dissociação enzimática. O robô também foi programado para produzir placas revestidas de gel de matriz extracelular e executar um gradiente de densidade de sementeira. Quando fibroblastos e tecido adiposo derivado iPSCs foram cultivadas neste sistema durante mais de 20 passagens, cerca de 3 meses, pluripotência foi mantida, como foram cariótipos estáveis. Ambas as linhas celulares foram capazes de diferenciação em cardiomiócitos. Juntos, a coleção de protocolos descrito aqui permite que os usuários com pouca experiência de cultura de células-tronco, ou acesso limitado a cultura equipamento especializado, a cultura de células-tronco e atingir uma produção de alta celular ou multi-linha manipulação com trabalho mínimo e custo. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Os protocolos robóticos detalhadas aqui fornecer um método para aumento de escala econômica de produção e manuseio da IPSC. Uma vantagem é a cultura de células-tronco escalável em um formato de placa estabelecida com base demonstrado aqui e anteriormente 44,47 - 49 para manter pluripotência. Enquanto outros formatos de células pluripotentes rendimento escalável cultura de células-tronco 20,23,29 método esta placa baseada essencialmente requer nenhuma mudança no formato da cultura, como a adaptação à suspensão, uso de anti-espuma produtos químicos ou o uso prolongado de Rho-quinase inibidor 20. Este método placa de base pode, portanto, rapidamente e, previsivelmente, acomodar novas linhas porque as condições de cultura são semelhantes. Como o uso de iPSCs para modelagem doença aumenta 4,6,19,50, novas linhas de IPSC são continuamente gerados. As técnicas descritas aqui são os mais adequados para a cultura nova linhas em meio ao alto volume e taxa de transferência porque a barreira para a transição para o formato é low. Isto também é verdade para o trabalho e do equipamento necessário para manter as colônias. Por último, porque o formato e manuseamento são semelhantes ao meio ambiente usado para derivar linhas e validar IPSC, desempenho de cultura, tais como a diferenciação dirigida, é provável que seja mais previsível. A Figura 8 ilustra uma estratégia para aumento de escala da produção de células estaminais em placas de 96 poços. Uma placa (ciclo 0) é utilizada para semear roboticamente 12 novas placas, um aumento de 12 vezes (ciclo 0 a 1). Depois de vários dias de alimentação, um dos doze placas é passadas para semear um outro conjunto de doze placas (Ciclo 1 Ciclo 2 a). Os restantes onze placas estão agora disponíveis para outros usos e representam o componente de produção do sistema. A este ritmo, a passagem de uma placa irá fornecer 11 placas de cada ciclo, ou a cada 3-4 dias. Esta metodologia pode ser dimensionada mais quando várias placas são passadas como mostrado na transição do Ciclo 2 para Ciclo 3. No ciclo 3, duas placas sãosempre utilizados para manter a colônia e sementes 24 novas placas. Os restantes 22 placas são então disponíveis para uso após cada ciclo de passagem. Em qualquer ponto no ciclo de manutenção do utilizador pode propagar mais placas para aumentar a produção. Um exemplo seria a passagem cada coluna para dois ciclos de crescimento. A primeira passagem converte uma placa em doze placas, e cada um dos doze placas é utilizada para semear 144 placas. Neste caso, um utilizador inicia com uma placa e após duas passagens, ou cerca de 1,5-2 semanas de cultura, tem 144 placas. Por exemplo, os fibroblastos e tecido adiposo linhas de IPSC produzir aproximadamente 25-75000000 células por placa de 96 poços quando estiver pronto para a passagem. 144 placas poderiam representar, por conseguinte, cerca de 4-7 x 10 9 células. O que é a carga de trabalho para o transporte de 144 placas de 96 poços roboticamente? Uma das metas para este trabalho foi a produção de células-tronco escalável que reduziu o trabalho em comparação aos tradicionais (placa ou seja, de 6 poços) cultura de células-tronco. O robô accomplishes este aliviando a necessidade de manipular fisicamente cada placa durante a alimentação e passaging. Enquanto escalas de 96 poços de produção placa linearmente, como seria em placas de 6 poços tradicionais, o tempo que um técnico gasta trabalhando com as placas é significativamente menos cultura utilizando robótica. A eficiência da produção de cultura robótico é derivado a partir desta diferença (Figura 9). Verificou-se técnicos poderia remover uma placa de 6 poços da incubadora, que vá ao microscópio, em seguida, aspirar e alimentar a placa em cerca de 3,5 minutos. Em comparação, os técnicos de passar cerca de 30 seg a remoção de uma placa de 96 poços da incubadora e inspeccionar sobre o microscópio para a densidade e a contaminação antes da sua colocação sobre o robô. Com um protocolo de alimentação expandida semelhante ao descrito acima, seis placas de 96 poços pode ser carregado e alimentado, o que demora aproximadamente 21 min ou 3,5 min por placa. O tempo total decorrido para alimentar uma placa é comparável entre robôic e métodos manuais, mas a alimentação de mão 6 placas de um técnico é necessário para todos os 21 min enquanto o técnico gasta apenas 3 min lidar com as seis placas para o robô (uma inspeção de 30 segundos por placa). Como a Figura 9 mostra, o tempo de um técnico passa a manipulação 144 placas usando o robô é cerca de 1,2 horas, contra 8 hr manualmente eo robô nunca vai fazer manipulação um erro as placas ou a transferência de líquidos. As 96 cavidades de cultura de IPSC métodos descritos aqui proporcionam uma plataforma para as tarefas de triagem tratável complexos. Porque cada poço é geneticamente idêntico e semeado com a mesma densidade a partir do mesmo conjunto inicial, as variáveis ​​podem ser distribuídos ao longo da placa e mantido pelo robô com reservatórios disponíveis comercialmente para segregar condições. Isto seria útil para experiências, como o crescimento de células estaminais desenvolvimento meios 34,35,47, substrato ou condição de cultura teste e estudos de toxicidade utilizando células estaminais51. Uma vez que cada linha de células estaminais é único em termos de requisitos de tamanho colônia e passagem óptimas, pode-se usar este sistema para modular a densidade de semeadura, freqüência de alimentação e manuseio passagem através da manipulação das colunas colhidas, a agitação mecânica durante a passagem ea frequência de alimentação. Iteração através destas variáveis ​​permitirá ao usuário encontrar rapidamente um conjunto de condições adequadas para a cultura de uma nova linha ou desenvolver novas técnicas de cultura. O sistema robótico também é capaz de manter a 96 colónias de células-tronco paralelas mas independentes. Quando IPSC derivada a partir de células somáticas ou clonado após a manipulação genética, vários clones são rastreados paralelas para produzir potenciais linhas IPSC. Uma vez que as células individuais são semeadas em placas de 96 poços, este sistema pode alimentar e de passagem das placas de 96 poços a colocação de cada colónia segregados. Isto permite muito elevado rendimento quando selecção de clones potenciais e elimina a dificuldade de cultura de 96 linhas paralelas fisicamente. Este método também umallows ampliados produção de cada clone, de modo que o material é prontamente disponível para análise paralela. Finalmente, prevemos integrando estas técnicas de cultura com um sistema de tráfico placa robótico que proporciona placas de e para a incubadora de cultura permitindo totalmente automatizado. Isto poderia ser conseguido com a robótica mais complexos que permitem uma maior expansão desde os protocolos básicos aqui descritos são transferíveis para outros sistemas baseados placa. Os primeiros passos críticos para abordar nos protocolos são aqueles que impedem e verificar se há contaminação, tais como os passos 1.5 e 4.2. Contaminação, como discutido acima, podem ser evitados com êxito se boa técnica estéril e bom senso são utilizados. É imperativo, independentemente do formato de cultura de células-tronco, que o cheque operador de contaminação e fazê-lo neste protocolo com os passos indicados irá reduzir significativamente o risco de contaminação. Aplicação do gel matriz extracelular adequada é uma segunda essnóstico passo para o sucesso global do presente protocolo. Sem revestimento adequadamente as placas de 96 poços, as células estaminais não irão crescer. Um problema comum é bem revestimento incompleto. A experiência demonstrou que as bolhas de ar, uma atracção electrostática e impedir acção capilar bem revestimento completo. O passo de pré-molhamento (1.6) foi desenvolvido para melhorar significativamente revestimento cavidades de fundo e não devem ser ignorados. Este passo de pré-molhar parece reduzir a hidrofobicidade aparente de 96 poços de plástico da placa de tal modo que quando o revestimento de gel da matriz extracelular é aplicada, ela é distribuída uniformemente em toda a cavidades de fundo e os lados. Também é recomendado para tocar suavemente as placas de 96 poços contra uma mão limpa uma vez revestido para garantir até mesmo distribuição extracelular solução gel matriz. Os parâmetros de dissociação são também importantes a optimizar. Incubação prolongado com a enzima ou reagente de dissociação com base EDTA vai resultar em células individuais, que podem ou não ser o objectivo durante a passagem. Por conseguinte, o operadordevem prestar especial atenção à forma como tempo de dissociação, força trituração, e repetições de lavagem afetar morfologia da colônia e da saúde e ajustar em conformidade. Compreender as limitações ao das técnicas descritas aqui são fundamentais para a operação bem-sucedida. Tal como em qualquer outro ambiente de cultura de células, a utilização de placas de 96 poços apresenta um risco relativamente elevado de contaminação. Como acima descrito, um técnico é responsável por cada placa durante a alimentação e passaging; por exemplo, quando se abre a tampa, colocar a placa na cama robô, e verificando a placa no microscópio. Portanto, como foi observado após o passo 1.5, é imperativo não tocar no interior de qualquer tampa ou placa de expor essa parte em qualquer superfície potencialmente contaminados, como os blocos de aquecimento inclinados ou pinos verticais na cama. Durante o desenvolvimento do protocolo essa limitação foi descoberto e foi o impulso para desenvolver um rack para segurar tampas de placas para manter a esterilidade. Da mesma forma, os reservatórios de cocho, pontas de pipeta e outras fontes sobre a cama manipulação robô líquido são fontes potenciais de contaminação, porque eles estão abertos ao meio ambiente e manipulados pelo técnico. Portanto, uma boa técnica estéril deve ser aplicada como a redução movimentos sobre os materiais de cultura expostas ou líquidos abertos. Outra limitação é que, quando o protocolo é dimensionado para cima, verificando visualmente cada poço de 100&gt; placas de 96 poços é incómodo. Este pode ser tratado por inspecção visual toda a placa para sinais de contaminação, tais como meios turva, para identificar poços suspeitas. Para aumento de escala futuro, a utilização de um microscópio automatizado e indicador de crescimento celular e potencial contaminação serão incorporados. Em resumo, o 96 poços plataforma de base de elevado rendimento descrita aqui oferece um método reprodutível, de alta fidelidade para a cultura de células estaminais e de produção num formato de placa. Este método reduz a experiência necessária, equipamentos e tempo necessário de trabalho dedicado à cultura de células-tronco enquantomantendo os benefícios de cultura aderente tradicional.

O uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos) tem aumentado significativamente desde sua derivação em 2007 1 para o teste composto, medicina regenerativa e modelagem doença 2-6. Essa demanda vem da capacidade de iPSC para produzir grandes quantidades de células pluripotentes que podem ser diferenciadas em células somáticas em uma quantidade inigualável. Como técnicas de diferenciação dirigidos melhorar 7-10 e desenvolvimento de células humanas ou modelagem de tecidos e terapia celular aumenta 11-14, o mesmo acontece com a exigência de produção em massa de iPSCs de alta qualidade. É amplamente citado que, entre outras doenças, enfarte do miocárdio ou a substituição funcional de células b vai exigir centenas de milhões para bilhões de iPSC derivada de células somáticas 15-18. Modelagem de tecido 3D Além disso, cada vez mais complexo para a descoberta de drogas e therapy vai exigir um grande número de células 9,13,19. Em todos estes exemplos, definido, uniforme e iPSCs reprodutíveis deve estar disponível e fácil de produzir. A fim de produzir-tronco derivadas de células biopharmaceutics e células para engenharia de tecidos e transplantes, uma tecnologia de células de fabricação de baixo custo é essencial. De produção em escala de iPSCs concentrou-se em cultura em suspensão de 20 - 25 ou uma suspensão com a utilização de substratos de microveiculos 26-28, em parte, porque estas técnicas são implantadas com sucesso para grande escala, não CIPS, produção baseado eucariótica. Vários grupos têm demonstrado que sistemas de cultura de suspensão de células estaminais pluripotentes produzem 20,21,23,24,29. No entanto, estas abordagens utilizam sistemas caros e complexos não prontamente disponíveis para os pesquisadores que desenvolvem programas de diferenciação novos, dirigindo engenharia de tecidos e fazendo laboratinvestigação à escala ory. Além disso, suspensão e microcarregador culturas IPSC necessitam de adaptação e técnicas ou produtos químicos que não são encontrados na cultura iPSC tradicional aderente, como o uso contínuo de inibidores Rho-quinase, agentes anti-espuma e filtração para regular agregação. O stress físico às células é mais prevalente em cultura em suspensão, introduzido por meio de agitação mecânica, bem como durante a colisão microtransportador. Estes problemas limitam a previsibilidade e velocidade com que recém-gerado linhas de células estaminais podem ser cultivadas em suspensão. Outros têm desenvolvido sistemas robotizados de manuseamento de placas que imitam as técnicas de cultura de placas 30,31 mas estas plataformas exigem grandes investimentos para equipamento e perícia para operar para além dos desafios fundamentais associados com a cultura de células estaminais. O presente trabalho descreve o desenvolvimento ea prática de um sistema de cultura escalável iPSC que utiliza um líquido robótico de 8 canais padrão auto-suficientemanipulador e placas de 96 poços. Este método foi concebido para colmatar escala de laboratório cultura iPSC e de alto volume de produção iPSC (por exemplo, 10 7-1,5 x 10 9 células por semana por técnico), permitindo aqueles que desenvolvem novas tecnologias IPSC para escalar facilmente a produção sem grandes investimentos em hardware ou trabalhistas. Este método é relativamente barato para configurar, requer pouca ou nenhuma experiência de cultura de células-tronco, programação ou engenharia, tem uma pequena pegada de equipamentos sem a necessidade de uma capa de cultura de células dedicado, e utiliza equipamento de cultura celular padrão para permitir a média a alta taxa de transferência automatizado a produção de células. O objetivo era desenvolver um sistema capaz de cultura de células-tronco escalável que pode ser utilizado por laboratórios novos para conter cultura de células, aqueles que acham cultivo manual uma barreira para o desenvolvimento de suas idéias ou aqueles que querem um meio econômico para a produção de um grande número de células-tronco. A plataforma apresentada aqui remove influência sobre técnicocultura de células-tronco e normaliza os procedimentos de alimentação e passagem para permitir a produção de células-tronco consistente.

<table><tbody><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96 poços; Volume do poço: 360&nbsp; &#956; l; Área de crescimento celular: 0,32&nbsp; cm2; Calha de Cavalo Marinho Embalada Individualmente</td></tr><tr><td></td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Reservatório 4 Partes Transparentes Poli Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Pontas Gilson</td><td></td><td>F167023</td><td>10 racks Gilson 96 pontas D200 pontas</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 pó.&nbsp; Ressuspender em 1 L de água purificada para cultura de células e filtro estéril.</td></tr><tr><td>Fator de crescimento reduzido Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Referido como "gel de matriz extracelular" no texto. Matrigel GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Kit Completo para Manutenção hES.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>Kit TeSR-E8 para manutenção hESC/hiPSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Inibidor de rocha Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>Referido como "reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica" no texto. Accutase 500&nbsp; ml de solução de células estéreis</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS sem Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

escalável placa de 96 poços baseado ipsc cultura e produção usando um sistema de manipulação robótica líquido

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Avanço contínuo em cultura de células-tronco pluripotentes está fechando a lacuna entre banco e cabeceira para o uso dessas células na medicina regenerativa, a descoberta de medicamentos e testes de segurança. A fim de produzir-tronco derivadas de células biopharmaceutics e células para engenharia de tecidos e transplantes, uma tecnologia de células de fabricação de baixo custo é essencial. Manutenção da pluripotencialidade e desempenho estável de células em aplicações a jusante (por exemplo, a diferenciação de células) ao longo do tempo é fundamental para a produção de células em grande escala. No entanto, isso pode ser difícil de conseguir, especialmente se as células são cultivadas manualmente onde o operador pode introduzir variabilidade significativa, bem como ser proibitivamente caro para aumento de escala. Para habilitar de alto rendimento, a produção de células-tronco em larga escala e remover a influência do operador protocolos de cultura de células-tronco usando um romance de bancada multi-canal de líquido manipulação do robô foram desenvolvidos que requerem o envolvimento técnico mínima ou experiência. Comestas células estaminais pluripotentes induzidas protocolos humanos (IPSCs) foram cultivadas em condições isentas de alimentação directamente a partir de um lote congelado e mantidas em placas de 96 poços. Dependendo da linhagem de células e taxa de aumento de escala desejado, o operador pode facilmente determinar quando a passagem com base numa série de imagens que mostram as densidades óptimas de fraccionamento de colónias. Em seguida, os reagentes necessários estão preparados para realizar uma separação de colónias para placas novas, sem um passo de centrifugação. Após 20 passagens (~ 3 meses), duas linhas de IPSC mantida cariótipos estáveis, expressa marcadores de células estaminais e diferenciadas em cardiomiócitos com alta eficiência. O sistema pode realizar subsequente rastreio de alto rendimento de novos protocolos de diferenciação ou manipulação genética concebidos para placas de 96 poços. Esta tecnologia vai reduzir a carga de trabalho e técnica para produzir um grande número de células-tronco idênticas para uma infinidade de aplicações.

Os protocolos descritos permitem que os laboratórios realizem cultura de células-tronco escaláveis e aderentes em alto rendimento com mão de obra, experiência e custo mínimo de investimento em equipamentos usando um robô programável de manuseio de líquidos e placas de 96 poços. As iPSCs passadas mais de 20 vezes neste sistema mantiveram a pluripotência, cariótipos normais e se diferenciaram em cardiomiócitos.

Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estabelecer de forma reprodutível um cultivo de células pluripotentes escalonável. Isso é alcançado primeiramente utilizando um robô programado de manipulação de líquidos para semear células-tronco pluripotentes humanas em diferentes densidades. Em uma placa de 96 poços, no segundo passo, os poços com densidades ótimas de colônias são identificados visualmente para embalagem.As células-tronco pluripotentes induzidas humanas são então semeadas em novas placas para alimentação automática e embalagem adicional. Em última análise, este procedimento permite a seleção das melhores densidades de semeadura para multiplicar células-tronco pluripotentes induzidas humanas, com vistas à sua posterior diferenciação em cardiomiócitos. As implicações desta técnica estendem-se para o desenvolvimento de terapias personalizadas e regenerativas em escala intermediária.O robô de cultura potente URI é adequado para produzir algumas centenas de milhões de células-tronco potentes URI em vários dias, as quais podem então ser diferenciadas em diversos tipos celulares para testes personalizados de fármacos ou terapias com implante de células e tecidos. Embora este método tenha sido aplicado na triagem de densidades de semeadura para expansão ideal de culturas de células pluripotentes, ele também pode ser usado para otimizar e identificar novos protocolos de diferenciação para diversos outros tipos celulares. O procedimento será demonstrado por cientistas farmacêuticos, Neil Daily do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento de alimentação, verifique a placa de colônias de células-tronco de 96 poços quanto à contaminação e confirme que a colônia celular está abaixo da densidade ideal para passagem.Se as células estiverem em boas condições, coloque a placa na cama. Posicione três na rampa inclinada de 37 graus Celsius do robô de manipulação de líquidos e carregue a grade de ponteiras na cama. Posicione um com ponteiras de pipeta de 200 microlitros em temperatura ambiente.Coloque um recipiente de quatro poços na posição dois da plataforma e encha o poço três do recipiente com oito mililitros de meio de crescimento de células-tronco fresco, à temperatura ambiente, sem inibidor de cinase RO. Em seguida, transfira a placa para o suporte de placas e, usando o painel de controle robótico, selecione sequencialmente Executar o protocolo de alimentação de colônia uma placa e depois pressione Executar teste para usar o assistente passo a passo e pré-testar o programa selecionado. Quando o protocolo for aprovado, selecione Executar protocolo. Após a alimentação, recupere a placa de 96 poços com colônias de células-tronco.Em seguida, registre os detalhes do evento de alimentação na tampa da placa e devolva-a ao incubador de cultura celular por 24 horas até a próxima alimentação ou passagem. A escolha do poço para divisão depende da densidade das colônias. Vários dias após a configuração de um gradiente de densidade de semeadura nesta placa, observamos um poço com densidade excessiva para divisão, uma densidade ideal para divisão e um poço com densidade muito baixa para passagem após vários ciclos de alimentação.Confirme que o espaço entre a maioria das colônias na placa de 96 poços é de 25% do diâmetro da colônia adjacente, pois, caso contrário, uma alimentação subsequente fará com que as colônias cresçam unidas. Em seguida, se a colônia não estiver contaminada, coloque a placa na cama. Posicione três na rampa de 37 graus e carregue o suporte de ponteiras na cama.Posicione um com ponteiras de micropipeta de 200 microlitros em temperatura ambiente. Coloque uma placa de quatro poços na posição dois da base e, deixando o poço quatro vazio, distribua 8,5 mililitros de meio de crescimento de células-tronco. Adicione o inibidor da quinase Rho Y 2 7 6 3 2 no poço três, 3,5 mililitros de reagente de dissociação proteolítico e colagenolítico a 30% no poço dois e 4,5 mililitros de PBS no poço.Em seguida, posicione uma nova placa de 96 poços recoberta com gel de matriz extracelular pré-aquecida a 37 graus Celsius no leito, posição cinco, e transfira as tampas da placa antiga e da nova para o suporte de tampas. Agora, use o painel de controle robótico para selecionar sequencialmente a execução do protocolo "colony split one to 12 column one", seguido por "next". Em seguida, selecione "test run" para usar o assistente passo a passo e pré-testar um programa selecionado, seguido por "run protocol".Quando o protocolo de passagem for concluído, recupere ambas as placas. Rotule a placa nova com as informações relevantes e devolva as placas ao incubador. Durante 24 horas, as células e colônias devem aderir à placa dentro de duas a três horas após a divisão, apresentando-se muito espalhadas devido à presença do inibidor da quinase RO.Após a primeira alimentação sem inibidor de quinase RO, as células irão se condensar e exibir a morfologia característica de células-tronco em formato de calçada. Anormalidades cromossômicas são comumente observadas durante o cultivo de células-tronco, mas podem não afetar a distribuição de marcadores de pluripotência como os mostrados nestas imagens; de fato, a análise de cariótipo de células cultivadas pelo protocolo aqui demonstrado revelou que ambas as linhagens de células-tronco pluripotentes induzíveis passadas roboticamente possuíam 46 cromossomos normais, sugerindo que o método de cultivo robótico não introduziu instabilidade cromossômica além daquela que normalmente poderia ocorrer. Para investigar marcadores estabelecidos de expressão gênica em células-tronco pluripotentes induzíveis cultivadas roboticamente, o RNA total também foi coletado.As duas linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas neste experimento exibiram expressão semelhante de marcadores de pluripotência, enquanto os cardiomiócitos diferenciados a partir de cada linhagem não exibiram, assim como uma linhagem separada de fibroblastos dérmicos humanos. Além disso, quando ambas as linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas foram diferenciadas em cardiomiócitos, elas apresentaram uma formação clara de sarcômeros. Em conjunto, esses dados sugerem que três meses e mais de 20 passagens de cultura robótica resultaram em células cromossomicamente normais que exibem um programa de transcrição compatível com a pluripotência e que também são capazes de diferenciação em cardiomiócitos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este ou um robô de manipulação líquida semelhante para cultivar células pluripotentes de maneira escalonável.

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Research

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