Name: Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda a usar o sistema TetON para expressão gênica tecido-específica em Danio rerio durante a regeneração da barbatana caudal. Este método permite visualizar funções gênicas com doxiciclina e imunofluorescência.

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Os autores agradecem Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte para assistência técnica. Trabalho no laboratório Weidinger é suportado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e pela Deutsche Gesellschaft für Kardiologie através de uma Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

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<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
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<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de se regenerar com sucesso muitos órgãos internos e apêndices. Um profundo conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos requer uma análise específica de tecido de funções dos genes e vias de sinalização. Para isso, o sistema de Teton fornece uma ferramenta eficiente para a expressão do gene espaço-temporalmente controlada em zebrafish embrionárias e adultas. As construções do sistema de Teton ea metodologia descritos neste manuscrito foram usados ​​com ...

O peixe-zebra é um bem estabelecido modelo de organismo vertebrado para estudar muitos aspectos do desenvolvimento, a fisiologia, a doença, e regeneração. Com a crescente adopção de peixe-zebra como um modelo para os processos biológicos de pós-embrionárias, ferramentas experimentais para, manipulação específica de tecido da expressão génica indutível ou vias de sinalização tornaram-se cada vez mais importante. Particularmente, os estudos sobre a regeneração de órgãos e apêndice no peixe-zebra adulto têm sofrido com a falta de ferramentas para dissecar os requisitos espaço-temporais de vias de sinalização durante estes processos regenerativos. Actualmente, três sistemas diferentes têm sido usados ​​para alcançar, expressão condicional específica de tecido do gene na regeneração de órgãos de peixe-zebra adulto: o sistema Cre-lox, expressão de mosaico de choque térmico utilizando transgenes indutíveis transposão transgénese mediada por somática, e o sistema de 1 téton -3. Téton refere-se a uma variante de uma tetraciclina-contsistema de activação transcricional laminadas, onde a expressão é activada na presença do antibiótico tetraciclina ou um seu derivado, por exemplo, doxiciclina. O sistema Cre-lox, uma vez que até agora tem sido usado em peixes adultos, depende de uma recombinase Cre controlado-Tamoxifeno (CreERT2), cuja expressão é limitada espacialmente por elementos reguladores específicos de tecido. Remoção Cre-impulsionado de uma cassete de PARAGEM facilita a expressão do gene de interesse accionado por um promotor que deve ser activo em todos os tipos de células 1. Mediada por transposão criação de transgenes somáticas mosaically expressas fornece um sistema para a expressão induzível do transgene em linhagens celulares individuais. A injecção de embriões de peixes-zebra com um transposão Tol2 portador de um gene de interesse sob o controlo transcricional de um promotor de choque térmico resultados em indivíduos quiméricos tipicamente transportam o transgene apenas em linhagens celulares distintas de um órgão de regeneração 2. Embora ambos os sistemas permitem condicional tecido-spea expressão do gene espe-, o sistema Cre-lox não é reversível, e usando a estratégia de rotulagem clonal à base de transposão sofre com a sua natureza estocástica. Assim, nós e outros recentemente adaptado sistemas Teton transgênicos para uso em peixes-zebra, que facilitam temporal e expressão de genes controlados por espacialmente que é sintonizável em adição e reversível 3-5. O sistema utilizado aqui téton compreende um controlador de linha transgénica (TetActivator) em que um de doxiciclina (DOX) -inducible activador transcricional (melhoria transactivador tetraciclina reversa, irtTA, curto TETA) está sob o controle de sequências reguladoras genómicos específicos de tecidos. Em segundo lugar, requer uma linha transgénica respondedor (TetResponder) que abriga um gene de interesse sob o controlo transcricional do operador de tetraciclina (Tet elemento de resposta; tetre) (Figura 1A). Assim, a utilização de combinações específicas de TetActivator e TetResponder linhas permite condicional tecido-específic manipulação da expressão do gene. Temos recentemente utilizou o sistema de Teton para sondar para funções específicas de tecidos de sinalização Wnt / beta-catenina no adulto regeneração da cauda do peixe-zebra fin 3. No protocolo descrito aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para set-up e uso do sistema de Teton no peixe-zebra, em particular para estudos de regeneração fin. Isso inclui instruções detalhadas sobre como gerar TetActivator e TetResponder linhagens transgênicas estáveis ​​e um protocolo de indução transgene em embriões de peixe-zebra e adulto. Além disso, descreve-se técnicas para a verificação da expressão do gene específica para um tecido regenerado em barbatana, incluindo um protocolo para a preparação de criocortes de aletas de peixe-zebra adultos. Além disso, nós discutimos considerações para a concepção do transgene TetActivator, a escolha de um método de transgénese, e detecção da expressão TetResponder. Assim, o objetivo geral deste protocolo é para servir como um modelopara o estabelecimento de um sistema de téton funcional em peixes-zebra para conseguir a expressão do gene específica para um tecido condicional, o qual pode ser aplicado a qualquer tecido de interesse. Nós criamos um vetor TetActivator permitindo I-SCEI ou geração Tol2 mediada de linhas TetActivator estáveis ​​utilizando sequências de regulação genômicas curtas (fragmentos potenciador; banco de dados plasmídeo laboratório Weidinger nenhum 1247;. Figura 1B). Esta construção contém uma cassete que consiste TetActivator da variante mutante M2 do domínio inversa repressor Tet fundido com o vírus Herpes simplex VP16-domínio de transactivação derivado 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressão do TetActivator (TETA) pode ser facilmente monitorizada uma vez que é co-expressa com a AmCyan fluoróforo a partir do mesmo enquadramento de leitura aberto; um péptido P2A medeia salto ribossomal, o qual deve resultar na produção de TETA e AmCyan como proteínas separadas a uma razão 1: 1 5,6. O construto também contém um poylinker 5 &#39;do tetActivator cassete para facilitar a inserção de sequências genómicas reguladoras de interesse utilizando métodos de clonagem convencionais. Além disso, criámos um constructo consistindo do acima descrito cassete TetActivator além de uma cassete de selecção com canamicina (base de dados não plasmídeo laboratório Weidinger 1180;. A Figura 1C), o qual pode ser recombinado num cromossoma bacteriano artificial (BAC) contendo uma grande região genómica ( geralmente no codão de iniciação de um gene cuja expressão padrão é para ser mimetizado pelo transgene). Ambas as construções são disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante pedido.

<table><tbody><tr><td>Caixas de reprodução</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente composto</td><td>, por exemplo, Leica, Zeiss</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para obter imagens de seções de tecido fluorescente</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>, por exemplo, Leica, Zeiss</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para obter imagens de seções de tecido fluorescente</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>, por exemplo, Leica, Thermo-Scientific</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para crioseccionamento</td></tr><tr><td>4', 6- diamidino-2-fenilinodol (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use 1/5.000 em PBS para visualização de núcleos</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>prepare estoques em 50% EtOH a 50 mg/ml (97 mM) para indução TetResponder</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (p/v) de paraformaldeído em PBS, pH 7,5 para fixação</td></tr><tr><td>1x solução salina tampão fosfata (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer salina + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS com 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus lâminas de microscópio de adesão</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>para coleta de seções de tecido</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente estéreo</td>, <td>por exemplo, Leica, Zeiss</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para genotipagem baseada em fluorescência</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>, por exemplo, Biorad, Applied Biosystems</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para genotipagem baseada em PCR</td></tr><tr><td>Meio de congelamento de tecido (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>para incorporação de tecido amostras</td></tr><tr><td>Tricaína (L-etil-m-amino-benzoato-sulfonato de metano/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>para anestesia uso a 1 mg/ml em meio embrionário E3</td></tr></tbody></table>

uso do sistema de teton para estudar os mecanismos moleculares de regeneração zebrafish

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

O peixe-zebra tornou-se um organismo modelo muito importante para estudar o desenvolvimento, fisiologia, doença e regeneração de tecidos de vertebrados. Uma compreensão completa dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos requer ferramentas experimentais que permitam a manipulação induzível e específica do tecido da expressão gênica ou das vias de sinalização. Portanto, nós e outros adaptamos recentemente o sistema TetON para uso em peixe-zebra. O sistema TetON facilita a expressão gênica controlada temporal e espacialmente e recentemente usamos essa ferramenta para sondar funções específicas do tecido da sinalização Wnt / beta-catenina durante a regeneração da barbatana caudal do peixe-zebra. Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para obter a expressão gênica induzível e específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra adulto em regeneração. Isso inclui a geração de linhagens transgênicas estáveis TetActivator e TetResponder, indução de transgenes e técnicas para verificação da expressão gênica específica do tecido no regenerado da barbatana. Assim, este protocolo serve como modelo para a criação de um sistema TetON funcional em peixe-zebra e seu uso subsequente, em particular para estudar a regeneração de barbatanas.

Para estabelecer um sistema téton funcional para a expressão do gene induzível específico de tecido, TetActivator transgénicos e linhas TetResponder precisa de ser gerado (Figura 1A). Isto é conseguido por microinjecção TetActivator (Figura 1B - C) ou TetResponder (Figura 1E) constrói em embriões de peixe-zebra primeiros e integração da linha germinal subsequente. TetActivator construções funcionais podem ser gerados por clonagem de sequências regulador...

Aqui descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para alcançar a expressão gênica específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra em regeneração adulta.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

O objetivo geral deste procedimento é configurar um sistema TED funcional em peixe-zebra para obter expressão gênica condicional e específica de tecido, conforme demonstrado na regeneração da nadadeira caudal neste vídeo. Isso é realizado primeiramente gerando linhagens transgênicas de ativador Tet que expressam um ativador transcricional induzível por tetraciclina marcado com am cyan no tecido de interesse e linhagens repórter Tet que contêm um gene de interesse com marcação YPE sob controle de elementos responsivos ao Tet. Em seguida, são estabelecidos cruzamentos específicos de peixes duplo-transgênicos ativador Tet e repórter Tet.Em seguida, a expressão do transgene repórter Tet específica para tecidos é induzida pela administração de doxiciclina. Por fim, a expressão do transgene repórter Tet é verificada mediante o preparo de seções de tecido de regenerados da nadadeira. Em última instância, a imunofluorescência é utilizada para visualizar a expressão tecido-específica do transgene repórter Tet.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como a expressão gênica induzida por choque térmico, é que o sistema deed on permite expressão gênica induzível e r

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

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Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

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