Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é configurar um TED funcional no sistema em peixe-zebra para alcançar a expressão gênica condicional específica do tecido, conforme demonstrado na barbatana caudal em regeneração neste vídeo. Isso é feito primeiro gerando linhas transgênicas do ativador Tet que expressam um ativador transcricional induzível por tetraciclina marcado com am ciano no tecido de interesse e linhas de resposta Tet que contêm um gene de etiqueta ype de interesse sob controle de elementos responsivos ao Tet. Em seguida, são estabelecidas combinações específicas de peixes transgênicos duplos de resposta ao Tet.

Em seguida, a expressão do transgene do respondedor Tet específico do tecido é induzida através da administração de doxiciclina. Finalmente, a expressão do transgene Tet respondedor é verificada preparando seções de tecido aqui de regenerados de nadadeiras. Em última análise, a imunofluorescência é usada para visualizar a expressão do transgene do respondedor Tet específico do tecido.

A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como a expressão gênica induzida por choque térmico, é que a ação no sistema permite a expressão gênica induzível e reversível de maneira específica do tecido. Este método pode ajudar a obter uma compreensão mais profunda das redes de sinalização molecular que orientam a regeneração da barbatana de peixe S, pois permite a análise da via de sinalização e da função gênica em tecidos individuais. Embora usemos essa tecnologia para estudar a regeneração da barbatana do peixe-zebra, ela também pode ser instrumental em muitos outros contextos que exigem manipulação específica do tecido da função do gene.

Depois de gerar linhas de peixes respondedores do Tet de acordo com o protocolo de texto, avalie a integração da linha germinativa e a indutibilidade do transgene acasalando peixes G zero individuais com uma linha ativadora de Tet previamente estabelecida. Em seguida, colha os embriões e crie-os até um estágio em que a indução do respondedor ao Tet possa ser avaliada. Preparar 2000 x solução de estoque de doxiciclina utilizando etanol a 50% para dissolver as docas para chegar a uma concentração de 50 miligramas por mililitro.

Armazene alíquotas de docas protegidas da luz a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, preparar E três embriões contendo docas a uma concentração final de 25 microgramas por mililitro. Em seguida, decantar a maior parte do meio E três dos embriões.

Substitua-o por dos-contendo E três meio e retorne os embriões a 28,5 graus Celsius por um período mínimo de seis horas. Após a incubação, use um microscópio estéreo fluorescente para rastrear embriões quanto à fluorescência do animal de estimação Y. Estabeleça várias linhas de resposta ao Tet transgênico estáveis dos fundadores que acabamos de identificar.

Escolha linhas que induzam fortemente e exibam pouco mosaicismo dentro do domínio de expressão esperado, bem como pouca variação entre embriões individuais. Uma vez que o ativador TED e as linhas de peixes de resposta do Tet tenham sido estabelecidas, faça portadores de ativadores de Tet com portadores de resposta do Tet para gerar transgênicos duplos. Os peixes selecionam embriões portadores do transgene ativador Tet rastreando a fluorescência am ciano em um microscópio estereoscópico e criam embriões am ciano positivos até a idade adulta.

Identificar peixes adultos transgênicos duplos que carregam o respondedor Tet além do ativador Tet por genotipagem baseada em PCR ou por sua capacidade de induzir a expressão do Tet Responder no tecido de interesse para realizar a anestesia do peixe-zebra adulto em um béquer cheio de água de peixe contendo 160 microgramas por mililitro de trica. Quando o peixe parar de se mover, use uma pinça para transferi-lo cuidadosamente para uma placa de Petri invertida e use um bisturi para realizar uma amputação parcial da barbatana caudal para tratar com documentos. Prepare caixas de reprodução com um litro de água do sistema de peixes contendo 25 microgramas por mililitro de doxiciclina.

Como controle negativo, adicione 250 microlitros de etanol em vez de doxiciclina às caixas de criação com um litro de água do sistema de peixes, transfira até 10 peixes transgênicos duplos para cada caixa de reprodução e coloque as caixas no escuro para reduzir o estresse. Após um mínimo de seis horas, anestesiar e transferir o peixe tratado para um prato revestido de aros molhado e usar uma pinça para espalhar a cauda. Em seguida, sob um microscópio de fluorescência, examine o peixe quanto ao aparecimento de Y PET dentro do tecido em regeneração.

Posteriormente, os peixes podem ser usados para tratamentos adicionais ou retornar ao sistema de alojamento de peixes para encerrar a indução do transgene do respondedor após a amputação parcial da barbatana e o tratamento médico regenera a barbatana amputada regenerada em cerca de quatro a cinco segmentos ósseos proximais ao plano de amputação inicial e em um ponto de tempo, dependendo de sua configuração experimental, conforme descrito anteriormente neste vídeo com pinças e manuseando apenas a parte do coto do tecido, coloque cuidadosamente o tecido regenerado em uma pequena placa de Petri contendo 4% de peso por volume de PFA em PBS e fixe durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Use PBS para lavar os regenerados duas vezes antes de transferi-los para 0,5 molar E-D-T-A-P-B-S para descalcificar a matriz óssea a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, incube os regenerados em uma série de sacarose PBS à temperatura ambiente por 30 minutos cada e, finalmente, partes iguais de 30% de sacarose PBS e meio de congelamento de tecido por mais 30 minutos.

Transfira as barbatanas para o meio de congelamento de tecido e incube a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas. Em seguida, coloque os moldes criogênicos em uma lâmina de microscópio e preencha-os com meio de congelamento de tecido. Transfira os regenerados para os moldes criogênicos e oriente o tecido para obter seções longitudinais ou transversais.

Certifique-se de que a regeneração esteja reta para facilitar o seccionamento. Juntamente com a lâmina do microscópio, transfira os moldes criogênicos para uma prateleira de metal posicionada em um leito de gelo seco para iniciar o processo de congelamento. Quando o meio estiver sólido, transfira os moldes criogênicos de volta à temperatura ambiente para permitir que o meio descongele na interface do meio plástico.

Em seguida, usando um instrumento como uma caneta, empurre o bloco congelado para fora do molde criogênico e armazene a 80 graus Celsius negativos até seccionar com um micrótomo criogênico. Colete seções de 10 a 14 micrômetros em lâminas de microscópio de adesão e armazene as lâminas a 20 graus Celsius negativos até que sejam necessárias. Para caracterizar a expressão do respondedor de Tet em seções de aletas, trate as seções com 100% de MEOH resfriado a 20 graus Celsius negativos por 30 minutos.

Remova cuidadosamente o líquido usando uma toalha de papel. Em seguida, lave as seções duas vezes com PBT e uma vez com PBS por cinco minutos cada. Incube as seções por 10 minutos em papel antes de usar PBS para lavar duas vezes por 10 minutos cada.

Em seguida, use o agente de montagem Antifa e uma lamínula para montar as amostras antes de usar a microscopia de fluorescência confocal ou de campo amplo para obter imagens das amostras, tendo estabelecido um TET funcional no sistema em peixe-zebra. Este sistema pode ser usado para testar a função do gene ou da via de sinalização em tecidos individuais. Como mostrado aqui, o ativador tet acionado pelo promotor HER 4.3 induz a expressão do respondedor TED apenas em um subconjunto de tecidos da fluorescência YFP regenerada é detectada no blasa proximal proliferativo, enquanto o blasa distal e a epiderme são desprovidos de expressão.

A expressão do antagonista beta-catenina WINT atua em um domínio HER 4.3 contendo as células proliferativas da blasa, surpreendentemente não tem efeito na proliferação celular regenerativa. Isso sugere que a betaína eólica e a sinalização no blastema proximal proliferativo não têm papel essencial na regulação da proliferação de células ML dos blastos. Em contraste, o uso da linha ativadora Tet acionada pelo promotor da ubiquitina para induzir a expressão da axina um em todos os tecidos da nadadeira regenerada interfere fortemente na proliferação celular regenerativa.

Além disso, a expressão do axônio um no domínio HER 4.3, que não inclui osteoblastos, interfere fortemente na formação óssea no regenerado. Assim, a interferência específica do tecido na sinalização do vento usando o TE no sistema revela funções indiretas inesperadas da sinalização do vento na regulação da proliferação celular e regeneração óssea. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para expressão gênica direcionada induzível em qualquer tecido de interesse.

Aplicamos com sucesso este método para sondar funções específicas do tecido da sinalização de nicotina do leito de vento na barbatana caudal de peixe S em regeneração. O uso deste método ajudará a obter uma compreensão mais abrangente dos determinantes moleculares que regulam a regeneração do tecido.