Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é configurar um sistema TED funcional em peixe-zebra para obter expressão gênica condicional e específica de tecido, conforme demonstrado na regeneração da nadadeira caudal neste vídeo. Isso é realizado primeiramente gerando linhagens transgênicas de ativador Tet que expressam um ativador transcricional induzível por tetraciclina marcado com am cyan no tecido de interesse e linhagens repórter Tet que contêm um gene de interesse com marcação YPE sob controle de elementos responsivos ao Tet. Em seguida, são estabelecidos cruzamentos específicos de peixes duplo-transgênicos ativador Tet e repórter Tet.

Em seguida, a expressão do transgene repórter Tet específica para tecidos é induzida pela administração de doxiciclina. Por fim, a expressão do transgene repórter Tet é verificada mediante o preparo de seções de tecido de regenerados da nadadeira. Em última instância, a imunofluorescência é utilizada para visualizar a expressão tecido-específica do transgene repórter Tet.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como a expressão gênica induzida por choque térmico, é que o sistema deed on permite expressão gênica induzível e reversível de maneira específica para tecidos. Este método pode ajudar a obter uma compreensão mais profunda das redes de sinalização molecular que orientam a regeneração da nadadeira de peixes S, pois permite a análise da via de sinalização e da função gênica em tecidos individuais. Embora utilizemos esta tecnologia para estudar a regeneração da nadadeira de peixe-zebra, ela pode ser fundamental também em muitos outros contextos que exigem manipulação específica de tecidos da função gênica.

Após gerar linhagens de peixes respondedores ao Tet conforme o protocolo descrito, avalie a integração na linhagem germinativa e a induzibilidade do transgene cruzando peixes individuais da geração zero com uma linhagem previamente estabelecida de ativador Tet. Em seguida, colete os embriões e os desenvolva até um estágio em que a indução do respondedor Tet possa ser avaliada. Prepare uma solução estoque de doxiciclina 2000 x utilizando etanol a 50% para dissolver o doxiciclina até atingir uma concentração de 50 miligramas por mililitro.

Armazene alíquotas de docks protegidas da luz a menos 20 graus Celsius. Em seguida, prepare o meio de embrião E três contendo docks numa concentração final de 25 microgramas por mililitro. Depois, decante a maior parte do meio E três dos embriões.

Substitua-o por meio de cultura contendo E3 e retorne os embriões a 28,5 graus Celsius por um mínimo de seis horas. Após a incubação, utilize um microscópio estereoscópico de fluorescência para triar os embriões quanto à fluorescência Y pet. Estabeleça várias linhagens transgênicas estáveis do tipo Tet responder a partir dos fundadores recém-identificados.

Escolha linhagens que induzam fortemente e apresentem pouca mosaicidade dentro do domínio de expressão esperado, bem como pouca variação entre embriões individuais. Uma vez estabelecidas as linhagens de peixes com ativador Tet e com resposta ao Tet, cruze portadores do ativador Tet com portadores do sistema de resposta ao Tet para gerar transgênicos duplos. Selecione embriões portadores do transgene do ativador Tet mediante triagem pela fluorescência ciano-am em um microscópio estereoscópico e criem os embriões positivos para ciano-am até a fase adulta.

Identifique peixes adultos duplo transgênicos que carregam o vetor repórter Tet, além do ativador Tet, por meio de genotipagem baseada em PCR ou pela capacidade de induzir a expressão do vetor repórter Tet no tecido de interesse para realizar a amputação da nadadeira caudal. Anestesie peixes adultos de zebra em um béquer contendo água para peixes com 160 microgramas por mililitro de trica. Quando o peixe parar de se mover, use pinças para transferi-lo cuidadosamente para um recipiente de Petri invertido e use um bisturi para realizar uma amputação parcial da nadadeira caudal para tratamento com docs. Prepare caixas de reprodução com um litro de água do sistema para peixes contendo 25 microgramas por mililitro de doxiciclina.

Como controle negativo, adicione 250 microlitros de etanol em vez de doxiciclina em caixas de reprodução com um litro de água do sistema para peixes, transfira até 10 peixes duplo transgênicos para cada caixa de reprodução e coloque as caixas no escuro para reduzir o estresse. Após um mínimo de seis horas, anestesie e transfira os peixes tratados para uma placa úmida revestida com ágar, e use pinças para espalhar a nadadeira caudal. Em seguida, sob um microscópio de fluorescência, analise os peixes quanto à presença de Y PET no tecido em regeneração.

Posteriormente, os peixes podem ser utilizados para tratamentos adicionais ou devolvidos ao sistema de criação para encerrar a indução do transgene repórter após a amputação parcial da nadadeira e o tratamento com docs. Reamputar os tecidos regenerados em cerca de quatro a cinco segmentos ósseos próximos ao plano inicial de amputação e em um ponto temporal, dependendo da sua configuração experimental, conforme descrito previamente neste vídeo. Com pinças, e manuseando apenas a parte do coto do tecido, colocar cuidadosamente os tecidos regenerados em uma pequena placa de Petri contendo 4% peso por volume de PFA em PBS e fixar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, usar PBS para lavar os tecidos regenerados duas vezes antes de transferi-los para E-D-T-A 0,5 molar em PBS, a fim de descalcificar a matriz óssea a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, incubar os tecidos regenerados em uma série de sacarose em PBS, à temperatura ambiente, por 30 minutos cada, e finalmente em partes iguais de sacarose 30% em PBS e meio de congelamento de tecidos por mais 30 minutos.

Transfira as barbatanas para o meio de congelamento de tecidos e incube a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas. Em seguida, coloque as formas de criomoldagem sobre uma lâmina de microscópio e preencha-as com meio de congelamento de tecidos. Transfira os regenerados para as formas de criomoldagem e oriente o tecido para obter cortes longitudinais ou transversais.

Certifique-se de que o regenerado esteja reto para facilitar o corte em seções. Juntamente com a lâmina de microscópio, transfira as fôrmas de criomoldagem para uma grade metálica posicionada sobre uma cama de gelo seco para iniciar o processo de congelamento. Quando o meio estiver sólido, transfira as fôrmas de criomoldagem de volta à temperatura ambiente para permitir que o meio descongele na interface entre o plástico e o meio.

Em seguida, utilizando um instrumento como uma caneta, empurre o bloco congelado para fora do molde criogênico e armazene a menos 80 graus Celsius até o corte com micrótomo criogênico. Colete cortes de 10 a 14 micrômetros em lâminas adesivas para microscopia e armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius até o uso. Para caracterizar a expressão do respondedor Tet em seções da nadadeira, trate os cortes com MEOH a 100% resfriado a menos 20 graus Celsius por 30 minutos.

Remova cuidadosamente o líquido usando um papel-toalha. Em seguida, lave as seções duas vezes com PBT e uma vez com PBS durante cinco minutos cada. Incube as seções por 10 minutos em dappy antes de usar PBS para lavar duas vezes por 10 minutos cada.

Em seguida, utilize o meio de montagem Antifa e uma lamínula para montar as amostras antes de usar microscopia de fluorescência confocal ou de campo amplo para imaginar as amostras, após ter estabelecido um sistema TET funcional em peixe-zebra. Este sistema pode ser usado para testar a função de genes ou vias de sinalização em tecidos individuais. Como mostrado aqui, o ativador tet conduzido pelo promotor HER 4.3 induz a expressão do respondedor TED apenas em um subconjunto de tecidos da regeneração; a fluorescência de YFP é detectada na blástula proximal proliferativa, enquanto a blástula distal e a epiderme estão desprovidas de expressão.

A expressão do antagonista WINT da beta-catenina atua em um dos domínios HER 4.3 que contém as células proliferativas da blástula, mas surpreendentemente não tem efeito sobre a proliferação celular regenerativa. Isso sugere que a sinalização da wind betaina e nas células proliferativas da blástula proximal não desempenha um papel essencial na regulação da proliferação celular das células ML da blástula. Em contraste, o uso da linha ativadora Tet conduzida pelo promotor de ubiquitina para induzir a expressão da axina 1 em todos os tecidos do regenerado da nadadeira interfere fortemente na proliferação celular regenerativa.

Além disso, a expressão do axônio um no domínio HER 4.3, que não inclui osteoblastos, interfere fortemente na formação óssea no tecido regenerado. Assim, a interferência específica em tecidos na sinalização wind utilizando o sistema TE on revela funções indiretas inesperadas da sinalização wind na regulação da proliferação celular e na regeneração óssea. Uma vez dominada, esta técnica pode ser utilizada para expressão gênica induzível e direcionada em qualquer tecido de interesse.

Aplicamos com sucesso este método para investigar as funções específicas dos tecidos na sinalização de nicotina em leito de vento na barbatana caudal regenerativa do peixe S. O uso deste método ajudará a obter uma compreensão mais abrangente dos determinantes moleculares que regulam a regeneração tecidual.