Name: Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda a usar o sistema TetON para expressão gênica tecido-específica em Danio rerio durante a regeneração da barbatana caudal. Este método permite visualizar funções gênicas com doxiciclina e imunofluorescência.

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Os autores agradecem Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte para assistência técnica. Trabalho no laboratório Weidinger é suportado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e pela Deutsche Gesellschaft für Kardiologie através de uma Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de se regenerar com sucesso muitos órgãos internos e apêndices. Um profundo conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos requer uma análise específica de tecido de funções dos genes e vias de sinalização. Para isso, o sistema de Teton fornece uma ferramenta eficiente para a expressão do gene espaço-temporalmente controlada em zebrafish embrionárias e adultas. As construções do sistema de Teton ea metodologia descritos neste manuscrito foram usados ​​com ...

O peixe-zebra é um bem estabelecido modelo de organismo vertebrado para estudar muitos aspectos do desenvolvimento, a fisiologia, a doença, e regeneração. Com a crescente adopção de peixe-zebra como um modelo para os processos biológicos de pós-embrionárias, ferramentas experimentais para, manipulação específica de tecido da expressão génica indutível ou vias de sinalização tornaram-se cada vez mais importante. Particularmente, os estudos sobre a regeneração de órgãos e apêndice no peixe-zebra adulto têm sofrido com a falta de ferramentas para dissecar os requisitos espaço-temporais de vias de sinalização durante estes processos regenerativos. Actualmente, três sistemas diferentes têm sido usados ​​para alcançar, expressão condicional específica de tecido do gene na regeneração de órgãos de peixe-zebra adulto: o sistema Cre-lox, expressão de mosaico de choque térmico utilizando transgenes indutíveis transposão transgénese mediada por somática, e o sistema de 1 téton -3. Téton refere-se a uma variante de uma tetraciclina-contsistema de activação transcricional laminadas, onde a expressão é activada na presença do antibiótico tetraciclina ou um seu derivado, por exemplo, doxiciclina. O sistema Cre-lox, uma vez que até agora tem sido usado em peixes adultos, depende de uma recombinase Cre controlado-Tamoxifeno (CreERT2), cuja expressão é limitada espacialmente por elementos reguladores específicos de tecido. Remoção Cre-impulsionado de uma cassete de PARAGEM facilita a expressão do gene de interesse accionado por um promotor que deve ser activo em todos os tipos de células 1. Mediada por transposão criação de transgenes somáticas mosaically expressas fornece um sistema para a expressão induzível do transgene em linhagens celulares individuais. A injecção de embriões de peixes-zebra com um transposão Tol2 portador de um gene de interesse sob o controlo transcricional de um promotor de choque térmico resultados em indivíduos quiméricos tipicamente transportam o transgene apenas em linhagens celulares distintas de um órgão de regeneração 2. Embora ambos os sistemas permitem condicional tecido-spea expressão do gene espe-, o sistema Cre-lox não é reversível, e usando a estratégia de rotulagem clonal à base de transposão sofre com a sua natureza estocástica. Assim, nós e outros recentemente adaptado sistemas Teton transgênicos para uso em peixes-zebra, que facilitam temporal e expressão de genes controlados por espacialmente que é sintonizável em adição e reversível 3-5. O sistema utilizado aqui téton compreende um controlador de linha transgénica (TetActivator) em que um de doxiciclina (DOX) -inducible activador transcricional (melhoria transactivador tetraciclina reversa, irtTA, curto TETA) está sob o controle de sequências reguladoras genómicos específicos de tecidos. Em segundo lugar, requer uma linha transgénica respondedor (TetResponder) que abriga um gene de interesse sob o controlo transcricional do operador de tetraciclina (Tet elemento de resposta; tetre) (Figura 1A). Assim, a utilização de combinações específicas de TetActivator e TetResponder linhas permite condicional tecido-específic manipulação da expressão do gene. Temos recentemente utilizou o sistema de Teton para sondar para funções específicas de tecidos de sinalização Wnt / beta-catenina no adulto regeneração da cauda do peixe-zebra fin 3. No protocolo descrito aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para set-up e uso do sistema de Teton no peixe-zebra, em particular para estudos de regeneração fin. Isso inclui instruções detalhadas sobre como gerar TetActivator e TetResponder linhagens transgênicas estáveis ​​e um protocolo de indução transgene em embriões de peixe-zebra e adulto. Além disso, descreve-se técnicas para a verificação da expressão do gene específica para um tecido regenerado em barbatana, incluindo um protocolo para a preparação de criocortes de aletas de peixe-zebra adultos. Além disso, nós discutimos considerações para a concepção do transgene TetActivator, a escolha de um método de transgénese, e detecção da expressão TetResponder. Assim, o objetivo geral deste protocolo é para servir como um modelopara o estabelecimento de um sistema de téton funcional em peixes-zebra para conseguir a expressão do gene específica para um tecido condicional, o qual pode ser aplicado a qualquer tecido de interesse. Nós criamos um vetor TetActivator permitindo I-SCEI ou geração Tol2 mediada de linhas TetActivator estáveis ​​utilizando sequências de regulação genômicas curtas (fragmentos potenciador; banco de dados plasmídeo laboratório Weidinger nenhum 1247;. Figura 1B). Esta construção contém uma cassete que consiste TetActivator da variante mutante M2 do domínio inversa repressor Tet fundido com o vírus Herpes simplex VP16-domínio de transactivação derivado 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressão do TetActivator (TETA) pode ser facilmente monitorizada uma vez que é co-expressa com a AmCyan fluoróforo a partir do mesmo enquadramento de leitura aberto; um péptido P2A medeia salto ribossomal, o qual deve resultar na produção de TETA e AmCyan como proteínas separadas a uma razão 1: 1 5,6. O construto também contém um poylinker 5 &#39;do tetActivator cassete para facilitar a inserção de sequências genómicas reguladoras de interesse utilizando métodos de clonagem convencionais. Além disso, criámos um constructo consistindo do acima descrito cassete TetActivator além de uma cassete de selecção com canamicina (base de dados não plasmídeo laboratório Weidinger 1180;. A Figura 1C), o qual pode ser recombinado num cromossoma bacteriano artificial (BAC) contendo uma grande região genómica ( geralmente no codão de iniciação de um gene cuja expressão padrão é para ser mimetizado pelo transgene). Ambas as construções são disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante pedido.

<table><tbody><tr><td>Caixas de reprodução</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente composto</td><td>, por exemplo, Leica, Zeiss</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para obter imagens de seções de tecido fluorescente</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>, por exemplo, Leica, Zeiss</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para obter imagens de seções de tecido fluorescente</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>, por exemplo, Leica, Thermo-Scientific</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para crioseccionamento</td></tr><tr><td>4', 6- diamidino-2-fenilinodol (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use 1/5.000 em PBS para visualização de núcleos</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>prepare estoques em 50% EtOH a 50 mg/ml (97 mM) para indução TetResponder</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (p/v) de paraformaldeído em PBS, pH 7,5 para fixação</td></tr><tr><td>1x solução salina tampão fosfata (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer salina + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS com 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus lâminas de microscópio de adesão</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>para coleta de seções de tecido</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente estéreo</td>, <td>por exemplo, Leica, Zeiss</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para genotipagem baseada em fluorescência</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>, por exemplo, Biorad, Applied Biosystems</td><td>varia de acordo com o fabricante</td><td>para genotipagem baseada em PCR</td></tr><tr><td>Meio de congelamento de tecido (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>para incorporação de tecido amostras</td></tr><tr><td>Tricaína (L-etil-m-amino-benzoato-sulfonato de metano/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>para anestesia uso a 1 mg/ml em meio embrionário E3</td></tr></tbody></table>

uso do sistema de teton para estudar os mecanismos moleculares de regeneração zebrafish

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

O peixe-zebra tornou-se um organismo modelo muito importante para estudar o desenvolvimento, fisiologia, doença e regeneração de tecidos de vertebrados. Uma compreensão completa dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos requer ferramentas experimentais que permitam a manipulação induzível e específica do tecido da expressão gênica ou das vias de sinalização. Portanto, nós e outros adaptamos recentemente o sistema TetON para uso em peixe-zebra. O sistema TetON facilita a expressão gênica controlada temporal e espacialmente e recentemente usamos essa ferramenta para sondar funções específicas do tecido da sinalização Wnt / beta-catenina durante a regeneração da barbatana caudal do peixe-zebra. Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para obter a expressão gênica induzível e específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra adulto em regeneração. Isso inclui a geração de linhagens transgênicas estáveis TetActivator e TetResponder, indução de transgenes e técnicas para verificação da expressão gênica específica do tecido no regenerado da barbatana. Assim, este protocolo serve como modelo para a criação de um sistema TetON funcional em peixe-zebra e seu uso subsequente, em particular para estudar a regeneração de barbatanas.

Para estabelecer um sistema téton funcional para a expressão do gene induzível específico de tecido, TetActivator transgénicos e linhas TetResponder precisa de ser gerado (Figura 1A). Isto é conseguido por microinjecção TetActivator (Figura 1B - C) ou TetResponder (Figura 1E) constrói em embriões de peixe-zebra primeiros e integração da linha germinal subsequente. TetActivator construções funcionais podem ser gerados por clonagem de sequências regulador...

Aqui descrevemos o fluxo de trabalho para usar o sistema TetON para alcançar a expressão gênica específica do tecido na barbatana caudal do peixe-zebra em regeneração adulta.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

O objetivo geral deste procedimento é configurar um sistema TED funcional em peixe-zebra para obter expressão gênica condicional e específica de tecido, conforme demonstrado na regeneração da nadadeira caudal neste vídeo. Isso é realizado primeiramente gerando linhagens transgênicas de ativador Tet que expressam um ativador transcricional induzível por tetraciclina marcado com am cyan no tecido de interesse e linhagens repórter Tet que contêm um gene de interesse com marcação YPE sob controle de elementos responsivos ao Tet. Em seguida, são estabelecidos cruzamentos específicos de peixes duplo-transgênicos ativador Tet e repórter Tet.Em seguida, a expressão do transgene repórter Tet específica para tecidos é induzida pela administração de doxiciclina. Por fim, a expressão do transgene repórter Tet é verificada mediante o preparo de seções de tecido de regenerados da nadadeira. Em última instância, a imunofluorescência é utilizada para visualizar a expressão tecido-específica do transgene repórter Tet.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como a expressão gênica induzida por choque térmico, é que o sistema deed on permite expressão gênica induzível e reversível de maneira específica para tecidos. Este método pode ajudar a obter uma compreensão mais profunda das redes de sinalização molecular que orientam a regeneração da nadadeira de peixes S, pois permite a análise da via de sinalização e da função gênica em tecidos individuais. Embora utilizemos esta tecnologia para estudar a regeneração da nadadeira de peixe-zebra, ela pode ser fundamental também em muitos outros contextos que exigem manipulação específica de tecidos da função gênica.Após gerar linhagens de peixes respondedores ao Tet conforme o protocolo descrito, avalie a integração na linhagem germinativa e a induzibilidade do transgene cruzando peixes individuais da geração zero com uma linhagem previamente estabelecida de ativador Tet. Em seguida, colete os embriões e os desenvolva até um estágio em que a indução do respondedor Tet possa ser avaliada. Prepare uma solução estoque de doxiciclina 2000 x utilizando etanol a 50% para dissolver o doxiciclina até atingir uma concentração de 50 miligramas por mililitro.Armazene alíquotas de docks protegidas da luz a menos 20 graus Celsius. Em seguida, prepare o meio de embrião E três contendo docks numa concentração final de 25 microgramas por mililitro. Depois, decante a maior parte do meio E três dos embriões.Substitua-o por meio de cultura contendo E3 e retorne os embriões a 28,5 graus Celsius por um mínimo de seis horas. Após a incubação, utilize um microscópio estereoscópico de fluorescência para triar os embriões quanto à fluorescência Y pet. Estabeleça várias linhagens transgênicas estáveis do tipo Tet responder a partir dos fundadores recém-identificados.Escolha linhagens que induzam fortemente e apresentem pouca mosaicidade dentro do domínio de expressão esperado, bem como pouca variação entre embriões individuais. Uma vez estabelecidas as linhagens de peixes com ativador Tet e com resposta ao Tet, cruze portadores do ativador Tet com portadores do sistema de resposta ao Tet para gerar transgênicos duplos. Selecione embriões portadores do transgene do ativador Tet mediante triagem pela fluorescência ciano-am em um microscópio estereoscópico e criem os embriões positivos para ciano-am até a fase adulta.Identifique peixes adultos duplo transgênicos que carregam o vetor repórter Tet, além do ativador Tet, por meio de genotipagem baseada em PCR ou pela capacidade de induzir a expressão do vetor repórter Tet no tecido de interesse para realizar a amputação da nadadeira caudal. Anestesie peixes adultos de zebra em um béquer contendo água para peixes com 160 microgramas por mililitro de trica. Quando o peixe parar de se mover, use pinças para transferi-lo cuidadosamente para um recipiente de Petri invertido e use um bisturi para realizar uma amputação parcial da nadadeira caudal para tratamento com docs. Prepare caixas de reprodução com um litro de água do sistema para peixes contendo 25 microgramas por mililitro de doxiciclina.Como controle negativo, adicione 250 microlitros de etanol em vez de doxiciclina em caixas de reprodução com um litro de água do sistema para peixes, transfira até 10 peixes duplo transgênicos para cada caixa de reprodução e coloque as caixas no escuro para reduzir o estresse. Após um mínimo de seis horas, anestesie e transfira os peixes tratados para uma placa úmida revestida com ágar, e use pinças para espalhar a nadadeira caudal. Em seguida, sob um microscópio de fluorescência, analise os peixes quanto à presença de Y PET no tecido em regeneração.Posteriormente, os peixes podem ser utilizados para tratamentos adicionais ou devolvidos ao sistema de criação para encerrar a indução do transgene repórter após a amputação parcial da nadadeira e o tratamento com docs. Reamputar os tecidos regenerados em cerca de quatro a cinco segmentos ósseos próximos ao plano inicial de amputação e em um ponto temporal, dependendo da sua configuração experimental, conforme descrito previamente neste vídeo. Com pinças, e manuseando apenas a parte do coto do tecido, colocar cuidadosamente os tecidos regenerados em uma pequena placa de Petri contendo 4% peso por volume de PFA em PBS e fixar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, usar PBS para lavar os tecidos regenerados duas vezes antes de transferi-los para E-D-T-A 0,5 molar em PBS, a fim de descalcificar a matriz óssea a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, incubar os tecidos regenerados em uma série de sacarose em PBS, à temperatura ambiente, por 30 minutos cada, e finalmente em partes iguais de sacarose 30% em PBS e meio de congelamento de tecidos por mais 30 minutos.Transfira as barbatanas para o meio de congelamento de tecidos e incube a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas. Em seguida, coloque as formas de criomoldagem sobre uma lâmina de microscópio e preencha-as com meio de congelamento de tecidos. Transfira os regenerados para as formas de criomoldagem e oriente o tecido para obter cortes longitudinais ou transversais.Certifique-se de que o regenerado esteja reto para facilitar o corte em seções. Juntamente com a lâmina de microscópio, transfira as fôrmas de criomoldagem para uma grade metálica posicionada sobre uma cama de gelo seco para iniciar o processo de congelamento. Quando o meio estiver sólido, transfira as fôrmas de criomoldagem de volta à temperatura ambiente para permitir que o meio descongele na interface entre o plástico e o meio.Em seguida, utilizando um instrumento como uma caneta, empurre o bloco congelado para fora do molde criogênico e armazene a menos 80 graus Celsius até o corte com micrótomo criogênico. Colete cortes de 10 a 14 micrômetros em lâminas adesivas para microscopia e armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius até o uso. Para caracterizar a expressão do respondedor Tet em seções da nadadeira, trate os cortes com MEOH a 100% resfriado a menos 20 graus Celsius por 30 minutos.Remova cuidadosamente o líquido usando um papel-toalha. Em seguida, lave as seções duas vezes com PBT e uma vez com PBS durante cinco minutos cada. Incube as seções por 10 minutos em dappy antes de usar PBS para lavar duas vezes por 10 minutos cada.Em seguida, utilize o meio de montagem Antifa e uma lamínula para montar as amostras antes de usar microscopia de fluorescência confocal ou de campo amplo para imaginar as amostras, após ter estabelecido um sistema TET funcional em peixe-zebra. Este sistema pode ser usado para testar a função de genes ou vias de sinalização em tecidos individuais. Como mostrado aqui, o ativador tet conduzido pelo promotor HER 4.3 induz a expressão do respondedor TED apenas em um subconjunto de tecidos da regeneração; a fluorescência de YFP é detectada na blástula proximal proliferativa, enquanto a blástula distal e a epiderme estão desprovidas de expressão.A expressão do antagonista WINT da beta-catenina atua em um dos domínios HER 4.3 que contém as células proliferativas da blástula, mas surpreendentemente não tem efeito sobre a proliferação celular regenerativa. Isso sugere que a sinalização da wind betaina e nas células proliferativas da blástula proximal não desempenha um papel essencial na regulação da proliferação celular das células ML da blástula. Em contraste, o uso da linha ativadora Tet conduzida pelo promotor de ubiquitina para induzir a expressão da axina 1 em todos os tecidos do regenerado da nadadeira interfere fortemente na proliferação celular regenerativa.Além disso, a expressão do axônio um no domínio HER 4.3, que não inclui osteoblastos, interfere fortemente na formação óssea no tecido regenerado. Assim, a interferência específica em tecidos na sinalização wind utilizando o sistema TE on revela funções indiretas inesperadas da sinalização wind na regulação da proliferação celular e na regeneração óssea. Uma vez dominada, esta técnica pode ser utilizada para expressão gênica induzível e direcionada em qualquer tecido de interesse.Aplicamos com sucesso este método para investigar as funções específicas dos tecidos na sinalização de nicotina em leito de vento na barbatana caudal regenerativa do peixe S. O uso deste método ajudará a obter uma compreensão mais abrangente dos determinantes moleculares que regulam a regeneração tecidual.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós descrevemos um método para condicionalmente knockdown a expressão de uma proteína alvo durante a regeneração do adulto peixe-zebra barbatana. Esta técnica envolve a micro-injecção e electroporating morpholinos oligonucleótido anti-sentido para o tecido da aleta, o que permite testar o papel da proteína em vários estágios de regeneração da barbatana, incluindo a cicatrização de feridas, a formação de blastema, e excrescência regenerativo.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

O método aqui apresentado compreende a lesão precisa de embriões vivos zebrafish com pulsos de laser de alta potência e a subsequente análise das lesões e sua recuperação com o tempo. Também mostramos como geneticamente marcado individual ou grupos de células do músculo esquelético pode ser monitorado durante e após o laser danos leves induzido.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Um método de genética reversa adaptável para peixe-zebra para avaliar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento e homeostase fisiológica, como a regeneração do tecido usando injeções intraventricular de morpholinos gene-específicos.

Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Aqui apresentamos um método confiável para estudar a regeneração renal adulta induzindo lesão renal aguda por injeção de gentamicina. Mostramos que a lesão depende da dosagem de gentamicina e da temperatura ambiente usando hibridização in situ para rotular lhx1a+ em desenvolvimento de novos néfrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

Apresentamos um protocolo para capturar a dinâmica da regeneração da barbatana caudal de larvas de peixe-zebra em uma escala de tecido inteiro usando estereomicroscopia baseada em campo claro. Esta técnica permite capturar a dinâmica de regeneração com resolução de célula única. Esta metodologia pode ser adaptada a qualquer estereomicroscópio equipado com uma câmera CCD e software de lapso de tempo.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Aqui apresentamos um protocolo para transplantar células com alta resolução espacial e temporal em embriões e larvas de peixe-zebra em qualquer estágio entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização.

Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

Aprenda a usar o sistema TetON para expressão gênica tecido-específica em Danio rerio durante a regeneração da barbatana caudal. Este método permite visualizar funções gênicas com doxiciclina e imunofluorescência.

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

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