A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

O objetivo geral deste procedimento é minimizar o estresse da coleta de sangue de ratos por amostragem através da veia lateral da cauda. Isso é feito primeiro restringindo o rato e aquecendo a cauda. Na segunda etapa, um cateter borboleta é inserido em uma das veias da cauda lateral dilatadas e, em seguida, o sangue é retirado na etapa final.

O cateter é removido e o fluxo sanguíneo do local da punção é interrompido. Em última análise, a amostragem de sangue da veia da cauda lateral causa estresse mínimo ao rato durante a coleta de sangue, reduzindo a influência da resposta aguda ao estresse na composição do sangue. As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como a amputação da ponta da cauda sobre a amostragem da veia lateral da cauda, são muito menos angustiantes para o animal e permitem a repetição dentro da amostragem do sujeito.

O procedimento será demonstrado por dois membros do meu laboratório, Graham Lee, um pós-doutorado e Elia Harmatz, um técnico Para começar, conecte um cateter borboleta à seringa, mantendo a proteção da seringa sobre a agulha para proteger a ponta. Em seguida, retire um volume de heparina ligeiramente maior do que o volume de sangue que será coletado. Retire a seringa e encha-a com ar.

Recoloque a seringa no cateter e expulse todas as quantidades da solução de heparina do tubo, agulha e seringa. Em seguida, coloque o cateter e a seringa em uma superfície estéril. Agora, prenda rapidamente o rato em um pano limpo, cuidando para que as quatro patas e as patas traseiras estejam em uma posição confortável e que a respiração seja irrestrita.

Prenda o envoltório com fita adesiva. Em seguida, em uma superfície de trabalho sólida, peça a um assistente que contenha o rato com gentileza e firmeza pelo abdômen e pela base da cauda com a cauda pendurada na borda do balcão para obter a amostra de sangue. Em seguida, dilate os vasos sanguíneos da cauda em água a 42 graus Celsius por 40 a 50 segundos.

Em seguida, seque a cauda com uma toalha de papel e gire todo o corpo com a cauda para localizar a veia da cauda direita ou esquerda, lateral à artéria para sangramento. Direcione uma seção da veia na parte inferior da cauda e limpe a área com uma solução anti-séptica de clorexidina a 2%. Em seguida, retire o êmbolo da seringa de zero a aproximadamente 50 microlitros para criar pressão negativa na seringa e segure a cauda com cuidado e firmeza perto da ponta para manter a cauda reta durante a coleta da amostra.

Agora, insira lentamente o cateter na veia em um ângulo raso, a aproximadamente cinco centímetros da ponta da cauda. Quando a veia é penetrada, o sangue flui para dentro do cateter, retira lentamente o êmbolo da seringa para coletar o volume desejado a uma taxa constante de cerca de 20 microlitros por segundo. Para facilitar o fluxo sanguíneo, passe um dedo ao longo do comprimento da veia da base em direção à ponta da cauda, permanecendo a mais de dois centímetros da ponta da agulha inserida para ordenhar o sangue.

Se o sangue não puder ser coletado com sucesso do local inicial da penetração do cateter, reinsira a agulha mais acima na veia. Quando um volume de amostra adequado for coletado, desconecte e reconecte o cateter para liberar a pressão na seringa. Em seguida, retire a agulha da veia e aplique pressão brevemente no local de inserção para parar o sangramento quando o sangramento parar.

Limpe a área com solução anti-séptica e devolva o animal à sua gaiola de origem. Para processar a amostra de sangue, aspire o ar para garantir que nenhum sangue permaneça dentro da agulha do cateter e use uma tesoura para cortar o tubo do cateter logo acima da agulha. Remova a agulha, colete o plasma sanguíneo e expulse o sangue em tubos de microcentrífuga contendo EDTA.

Como anticoagulante. Agite suavemente o tubo para misturar o anticoagulante no sangue e, em seguida, coloque as amostras no gelo. Dentro de 10 minutos após a coleta, gire todo o sangue e elua o plasma, tomando cuidado para não perturbar as camadas de glóbulos vermelhos e brancos para coletar o soro sanguíneo.

Coloque o sangue em tubos de microcentrífuga sem anticoagulante em temperatura ambiente por até 30 minutos. Então, depois que o sangue coagular, gire os tubos de coleta em uma centrífuga refrigerada e elui o soro. Ambos os tipos de amostras podem ser usados imediatamente ou armazenados a menos 80 graus Celsius por até um ano.

O plasma sanguíneo coletado da veia lateral da cauda, conforme demonstrado, fornece uma amostra de plasma translúcida e de aparência amarela pálida. Se ocorrer hemólise, uma tonalidade vermelha será transmitida ao plasma. Uma resposta aguda ao estresse pode alterar rapidamente a composição de uma amostra de sangue.

Por exemplo, a concentração circulante de corticosterona aumenta acentuadamente dentro de 10 minutos após a exposição a um estressor, como neste experimento representativo. É importante, no entanto, que o baixo nível basal de corticosterona obtido por este método antes da exposição ao estressor revela que o procedimento de amostragem em si não é uma fonte significativa de estresse. Sugerimos que você pratique este procedimento em animais anestesiados até dominar a inserção da agulha e a coleta de sangue.

Então, uma vez dominada, a técnica pode ser concluída em cinco minutos se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de minimizar quaisquer fontes potenciais de estresse, como ruído ambiente, e concluir o procedimento o mais rápido possível.