Name: Aplicação do DNA-metil específico Stain Verde no Labeling fluorescentes de Embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Aprenda a usar o corante verde de metila para marcação nuclear fluorescente em embriões de peixe. Este método permite imagens confocais de alta qualidade em espécimes biológicos espessos, aproveitando a resistência à fotodegradação do corante.

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Os autores gostariam de agradecer a Patxi Jaso pela produção do vídeo, PEDECIBA e Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) pelo financiamento parcial.

1. A purificação do corante <ol><li> Prepara-se uma solução aquosa a 4% de verde de metilo por dissolução de 0,4 g de pó de mancha em 10 ml de água destilada. Misture bem até dissolver completamente. </li><li> Sob um fume-hood, misturá-lo com pelo menos 2 partes de clorofórmio. É importante verificar com antecedência se os tubos são resistentes ao clorofórmio. </li><li> Misturar bem e centrifuga-se durante 1 min a 2000 xg para acelerar a separação de fases. </li><li> Após centrifugação, a fase aquosa superior com verde de metilo e uma fase orgânica inferior com clorofórmio e o violeta de cristal de contaminantes são obtidos habitual. </li><li> Recuperar a fase superior e repita esta etapa até a fase mais baixa parece completamente desprovida de cristal violeta. </li><li> No final, a fase superior é recuperada e diluído em água até uma concentração final de 2% com verde de metilo. Esta solução de reserva é estável sobre a bancada durante meses e não necessita de ser protegido da luz. </li></ol><ol><li> Fixar os embriões durante a noite em 4% de formaldeído (paraformaldeído) a partir de em tampão fosfato salino (PBS). NOTA: Este pode levar desde algumas horas até durante a noite, dependendo da espessura dos embriões. No exemplo, nós fixa 48 horas pós-fertilização (HPF) embriões de peixe-zebra durante a noite. </li><li> Lavar os embriões três vezes em PBS-T (1% de Triton X-100 em PBS) durante 5 min. A concentração elevada de detergente permeabiliza a cutícula. </li><li> Prepara-se uma solução de 1: 10.000 de verde de metilo (a partir da solução stock 2%) em PBS-T: 5,000-1. A presença de detergente durante a incubação é útil para amostras de espessura, tais como embriões de peixe-zebra e larvas. </li><li> Incubar os embriões na solução, durante pelo menos 6 horas a 4 ° C, com agitação suave. Mais uma vez, a espessura do embrião é o parâmetro de calibração para o comprimento da incubação. </li><li> Lavar os embriões 3 times com PBS durante 30 min para remover o excesso de detergente. Metil fluorescência verde só é evidente quando ligado ao DNA, daí fundo da molécula não ligada é insignificante. </li><li> Montagem em um slide escavado ou de uma câmara caseira com solução de montagem (75% de glicerol, 0,1 M Tris-HCl pH 8). NOTA: Se a coloração nuclear deve ser realizada após imunomarcação, verde metilo pode ser incorporado à solução de montagem na concentração de trabalho, sem a necessidade de lavá-lo afastado. </li><li> Loja refrigerado ou iniciar imagiologia imediatamente. Realizar imagem com um confocal de varredura a laser (ou outra fluorescência) microscópio com excitação a 633 nm e emissão filtros definidos como registrar em 650-750 nm tendo em conta que metil emissão verde atinge o seu máximo em 677 nm. NOTA: Nós fornecemos os dados de medição do perfil de emissão verde de metilo, a ser carregados no software de aquisição, como material suplementar. </li></ol> 3. Fluorescent Nuclear Staining de Whole Pintainho embriões usando Metil Verde <ol><li> Incubar ovos de galinha fertilizados para a fase de interesse. Fixar os embriões durante a noite em 4% de formaldeído (paraformaldeído a partir de) em PBS a 4 ° C. Lavar os embriões 3 vezes em PBS-T, durante 2 h. </li><li> Prepara-se uma solução de 1: 10.000 de verde de metilo (a partir da solução stock 2%) em PBS-T: 5,000-1. Incubar os embriões na solução de coloração durante a noite a 4 ° C. Lavar os embriões 3 vezes em PBS, 1 h cada. Mount na câmara com 75% de glicerol, 0,1 M Tris, pH 8. </li></ol> 4. Criação de Imagens fluorescente etiquetado Núcleos em embriões inteiros montado <ol><li> Preparar uma câmara de imagem furando várias camadas de fita isolante sobre uma lâmina de microscópio e cuidadosamente cortar um buraco para ele com um bisturi para colocar os embriões dentro. Isso impedirá que os embriões de esmagamento durante o exame. </li><li> Transferir cuidadosamente os embriões para a câmara de imagiologia e encher a câmara com a parte superior com 75% de glicerol, Tris-HCl 0,1 M, pH = 8 para umaformação de bolhas vazio. </li><li> Cubra com um # 0 lamela evitar ou eliminar transbordante médio. Selá-lo com unha polonês. </li><li> Aquisição de imagens do espécime no microscópio de fluorescência equipado com um filtro de excitação de 633 ou linha de laser. NOTA: filtros de emissão deve cobrir o máximo de 677 emissões de verde metilo. </li></ol>

<ol><li>Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+imaging+in+three+dimensions%3A+a+unique+tool+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research.</a> Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Latt, S. A., Stetten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+studies+on+33258+Hoechst+and+related+bisbenzimidazole+dyes+useful+for+fluorescent+detection+of+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+a+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
<li>Kim, S. K., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+green.+A+DNA+major-groove+binding+drug%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Methyl green. A DNA major-groove binding drug.</a> FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).</li>
<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O desenvolvimento progressivo das técnicas de microscopia nas últimas décadas, com foco particular nas variações da microscopia fluorescente, levou à possibilidade de explorar a dinâmica e a estrutura de amostras de tecido intacto, incluindo embriões inteiros10,11. Uma grande limitação tem sido, no entanto, a disponibilidade de fluoróforos de boa qualidade que podem ser usados para corar direta e rapidamente estruturas subcelulares. 
As colorações de DNA fluorescente mais usadas, co...

A coloração fluorescente de DNA é ampla e rotineiramente usada tanto em pesquisas biológicas quanto em diagnósticos clínicos, seja para o estudo detalhado da estrutura nuclear e cromossômica, para contracoloração de tecidos e células, ou para estudar parâmetros do ciclo celular1. Embora várias colorações de DNA estejam disponíveis, as mais amplamente utilizadas foram aquelas excitadas pela luz ultravioleta e emitidas em azul, que se encaixam nos sistemas usuais de três filtros usados na maioria dos microscópios de epifluorescência convencionais quando combinados com fluoróforos emissores de verde e laranja-vermelho, como proteínas fluorescentes ou pequenas moléculas ligadas a anticorpos. Entre essas colorações de DNA emissoras de azul, as mais comuns são DAPI e agentes de ligação de sulcos menores de Hoechst2,3. No entanto, a incorporação de uma ampla variedade de linhas de emissão de laser e detecção espectral em microscópios de varredura a laser permitiu que os pesquisadores escolhessem o uso de manchas nucleares emissoras de vermelho distante, como iodeto de propídio (PI) ou TO-PRO 34. Uma vantagem dessas colorações é que elas superam o problema da autofluorescência encontrada em muitas células e tecidos, particularmente em embriões5, mas muitas delas têm problemas diferentes, como ter perfis de emissão amplos ou serem muito sensíveis ao fotobranqueamento6.
O pesquisador suíço Friedrich Miescher descobriu o DNA em 1869, extraindo-o dos núcleos de glóbulos brancos encontrados no pus. Ele o chamou de nucleína e mostrou alguns anos depois que formava precipitados com a mancha relativamente nova verde metil. O verde de metila é composto por três anéis de anilina, com diferentes graus de metilação, e possui duas cargas positivas que lhe permitem ligar-se fortemente ao sulco principal do DNA7,8. A coloração de DNA por verde de metila foi muito cedo mostrada como específica, levando ao desenvolvimento por Unna e Pappenheim de uma coloração combinada com pironina, que marca especificamente o RNA. A metil verde-pironina tem sido amplamente utilizada desde então na técnica histológica de rotina9.
Até recentemente, muito pouco se sabia sobre as propriedades fluorescentes do verde de metila. Nosso trabalho anterior, no entanto, descobriu algumas das vantagens espectrais do verde de metila6, como sua excitação a 633 nm, um conveniente deslocamento de Stokes, sua emissão na porção do infravermelho próximo do espectro eletromagnético, maior fotoestabilidade do que as colorações de DNA disponíveis comercialmente com propriedades espectrais semelhantes e a um custo muito baixo. É por isso que decidimos testá-lo para ser usado como um marcador fluorescente específico e de alta afinidade para DNA em tecidos embrionários e em embriões inteiros. Além disso, até agora a coloração nuclear com verde de metila era realizada em pH baixo, dificultando a combinação com a coloração de anticorpos. O objetivo do método detalhado aqui é ter um protocolo para coloração de DNA nuclear fluorescente que supere o inconveniente acima mencionado, realizando o procedimento de coloração em pH fisiológico, tornando-o uma contracoloração adequada para imunomarcação em seções e tecidos inteiros.

<table><tbody><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Metil verde</td><td>Dr. G. Gr&uuml; bler</td><td></td><td>Também testou o 323829 Sigma-Aldrich, que é livre de cristal violeta</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocal de varredura a laser Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash; Isotiocianato de tetrametilrodamina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>372978</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas</td><td>Esco optics</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação do dna-metil específico stain verde no labeling fluorescentes de embriões

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

O verde de metila é conhecido há muito tempo como uma coloração histológica com uma afinidade específica pelo DNA, embora suas propriedades fluorescentes tenham permanecido inexploradas até recentemente. Neste artigo, ilustramos o método de preparação de uma solução estoque aquosa de verde de metila, que quando diluída pode ser usada como um marcador nuclear fluorescente muito conveniente para células e tecidos fixos. Procedimentos fáceis para rotular embriões inteiros de peixe-zebra e pintinhos são detalhados e exemplos de imagens obtidas são mostrados. O verde de metila é maximamente excitado pela luz vermelha, a 633 nm, e emite com um espectro relativamente nítido que atinge o pico de 677 nm. É muito barato, não tóxico, altamente estável em solução e muito resistente ao fotobranqueamento quando ligado ao DNA. Sua emissão vermelha permite imagens confocais de varredura de alta resolução inalteradas de núcleos em espécimes espessos. Finalmente, este protocolo de coloração com verde de metila é compatível com outros procedimentos de coloração celular, como marcação de anticorpos ou marcação de filamentos de actina com faloidina conjugada com fluoróforo.

A coloração nuclear de amostras grossas. O protocolo aqui descrito permite a realização de coloração homogênea de estruturas profundas no embriões inteiros. Lente desenvolvimento formar núcleos 48 hpf embriões de peixe-zebra são homogeneamente marcado (Figura 1). Coloração de ADN com verde de metilo permite a discriminação do ciclo celular dependentes diferenças morfológicas, tais como a identificação de figuras mitóticas ou núcleos apoptóticos (Figura 2A). ...

Um método para coloração fluorescente de material biológico fixo com o marcador específico de DNA verde de metila é descrito. O verde de metila é usado em uma solução aquosa diluída e é muito resistente ao fotobranqueamento. Sua emissão vermelha distante permite imagens profundas de amostras, tornando-o particularmente adequado para embriões inteiros.

Aplicação do DNA-metil específico Stain Verde no Labeling fluorescentes de Embriões

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Neste vídeo, mostraremos como a coloração histológica muito comum verde de metila pode ser usada como um marcador nuclear extremamente conveniente na microscopia fluorescente, com aplicações especiais na microscopia confocal a laser de espécimes biológicos espessos, como embriões inteiros. Após uma breve introdução ao verde de metila como corante específico de DNA, descreveremos o método para preparar soluções estoque e de trabalho para coloração fluorescente. Em seguida, mostraremos o procedimento experimental para obter a coloração nuclear e apresentaremos vários embriões de peixe e exemplos de imagens confocais obtidas.Por fim, serão demonstradas e discutidas as excelentes propriedades físico-químicas do verde de metila. Freddy Misha descobriu o DNA em 1869 e mostrou alguns anos depois que ele formava precipitados com um corante relativamente novo, o verde de metila. O verde de metila possui duas cargas positivas que permitem interagir fortemente com o DNA em sua região majoritária, ligando-se preferencialmente a regiões ricas em AT.O uso mais difundido do verde de metila tem sido sua combinação em uma solução nasal com o corante de RNA perina, um corante desenvolvido por UNA e Poppen Heim no início do século XX. Pouco, no entanto, foi analisado sobre as propriedades fluorescentes do verde de metila, e é por isso que decidimos testar a possibilidade de que ele pudesse ser usado como um marcador fluorescente de alta afinidade e especificidade para DNA em células.A verde metila é um corante do tipo metano com sete grupos metila. Esse sétimo grupo é facilmente perdido e a substância reverte para violeta de genciana. Por essa razão, há uma quantidade residual de violeta de genciana misturada à verde metila para remover os cristais.A solução de verde metil violeta pode ser lavada com clorofórmio para extrair o violeta de cristal. Como mostraremos imediatamente para esse fim, preparamos uma solução de 4% de ACU sob uma capela de exaustão. Misturamos com pelo menos duas partes de clorofórmio e centrifugamos para acelerar a separação de fases.Após a centrifugação, obtemos uma fase aquosa com verde de metila e uma fase orgânica inferior com clorofórmio e violeta de cristal. Recuperamos a fase superior e repetimos até que a fase inferior fique límpida. No final, a fase superior é recuperada e diluída.Esta solução é estável na bancada de trabalho por meses. Agora mostraremos como proceder para tingir toda a camada de embriões de MO com verde de metila. Para a microscopia confocal, usaremos o embrião de peixe com alto grau de transparência.Como exemplo, obtenha embriões de peixe-zebra e remova os detritos com um coador. Incube-os até o estágio desejado em água de aquário ou meio de embrião. Remova o cório com pinças finas e fixe os embriões em formaldeído 4% por algumas horas ou durante a noite.Em seguida, lave os embriões em PBST várias vezes. Prepare uma solução de trabalho de verde de metila diluindo a solução estoque de cinco a dez mil vezes em PBST. Incube os embriões na solução por pelo menos três horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.Neste exemplo, imagens confocais serão obtidas em um microscópio confocal com detectores espectrais. A excitação máxima é alcançada com um laser de 633 nanômetros e o detector é ajustado para uma faixa ampla na região vermelha do espectro visível.A emissão vermelha do verde de metila permite obter imagens nucleares de boa qualidade mesmo de espécimes profundas, como embriões inteiros, com perda de sinal mínima. Esta primeira série mostra uma retina de peixe-zebra cujos núcleos foram corados com um corante de DNA bem estabelecido para pro três. Após um minuto, diminuímos o zoom.Uma região de varredura ABL torna-se evidente quando realizamos o mesmo experimento com verde de metila; nenhuma descoloração evidente é observada. Na série a seguir, mostramos resultados representativos do que pode ser obtido utilizando o protocolo descrito aqui: célula em mitose do epitélio de peixe-zebra na qual figuras mitóticas podem ser observadas. Núcleo de IIC do mesmo espécime, onde a arquitetura nuclear pode ser visualizada.Reconstrução 3D de uma parte da célula epidérmica de larvas de peixe-zebra marcada com alamina verde de metila, uma visão mais panorâmica de diferentes formas nucleares dentro de 48 horas pós-fertilização, peixe-prata, retina br. Apresentamos aqui uma maneira simples de preparar uma coloração fluorescente de DNA extremamente econômica que pode ser usada para marcação nuclear, embora estejamos mostrando apenas como exemplo o de várias possibilidades. Esta técnica pode ser aplicada a seus embriões ou tecidos, tanto em preparações inteiras quanto em cortes seccionais.Também pode ser usado para coloração de DNA em géis e para determinação de DNA em solução utilizando fotometria.

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