Aplicação do DNA-metil específico Stain Verde no Labeling fluorescentes de Embriões
2 de maio de 2015
Um método para coloração fluorescente de material biológico fixo com o marcador específico de DNA verde de metila é descrito. O verde de metila é usado em uma solução aquosa diluída e é muito resistente ao fotobranqueamento. Sua emissão vermelha distante permite imagens profundas de amostras, tornando-o particularmente adequado para embriões inteiros.
Neste vídeo, mostraremos como a coloração histológica muito comum verde de metila pode ser usada como um rótulo nuclear extremamente conveniente em microscopia fluorescente com aplicações especiais em microscopia confocal a laser de espécimes biológicos espessos, como embriões inteiros. Depois de introduzir brevemente o verde de metila como uma coloração específica de DNA, descreveremos o método para preparar soluções de estoque e de trabalho para coloração fluorescente. Em seguida, mostraremos o procedimento experimental para obter a coloração nuclear e manter vários embriões de peixes e exemplos de imagens confocais obtidas.
Finalmente, as excelentes propriedades físico-químicas dos verdes de metila serão demonstradas e discutidas. Freddy Misha descobriu o DNA em 1869 e mostrou alguns anos depois que ele formava precipitados com um annal relativamente novo e mancha de verde metil. O verde de metila tem duas cargas positivas que permitem que ele interaja fortemente com o DNA em seu grupo principal, ligando-se preferencialmente às regiões de alcance.
O uso mais difundido do verde de metila tem sido sua combinação em uma solução nasal com RNA corante perine, um metil desenvolvido pela UNA e Poppen Heim no início do século 20. Muito pouco foi analisado, no entanto, sobre as propriedades fluorescentes do verde de metila, e é por isso que decidimos testar a possibilidade de que ele pudesse ser usado como um rótulo fluorescente específico e de alta afinidade. Para DNA em células.
O verde de metila é uma mancha de metano de al com sete raízes de metila. Este sétimo grupo é facilmente perdido e reverte para violeta cristalino. Por esse motivo, há uma quantidade de chegada de violeta cristal misturado com verde de metila para remover o cristal.
A solução violeta metil verde pode ser lavada com clorofórmio para extrair o cristal violeta. Como mostraremos imediatamente para esse fim, preparamos a solução de 4% de ACU sob uma capela de exaustão. Nós o misturamos com pelo menos duas partes de clorofórmio e centrífuga para acelerar a separação de fases.
Após a centrificação, obtemos uma fase aquosa com verde de metila e uma fase orgânica inferior com clorofórmio e violeta cristalino. Recuperamos a fase superior e repetimos até que a fase inferior pareça clara. No final, a fase superior é recuperada e diluída.
Esta é a solução é um estábulo na bancada de trabalho por meses. Agora vamos mostrar como proceder para cuidar de MO inteiro em camada de embriões com metanfetamina verde. Para microing confocal, usaremos o embrião de peixe de alto transplante.
Por exemplo, obtenha embriões de peixe-zebra e lave os detritos com uma peneira. Incube-os até o estágio desejado em água de aquário ou meio embrionário. Retire o cório com uma pinça fina, fixe os embriões em 4% para formaldeído por algumas horas ou durante a noite.
Em seguida, lave os embriões em PBST várias vezes. Preparar uma solução de trabalho verde de metilo diluindo a solução de reserva de cinco a 10 000 vezes em PBST. Incubar os embriões na solução por pelo menos três horas em temperatura ambiente ou durante a noite de quatro graus Celsius diminuídos.
Neste exemplo, as imagens confocais serão obtidas em um microscópio confocal menor com detectores espectrais. A excitação máxima é alcançada com um laser de 633 nanômetros e o detector é ajustado para uma ampla faixa. Na área vermelha do espectro visível.
A emissão de vermelho verde metil torna possível obter imagens nucleares de boa qualidade, mesmo de espécimes profundos, como embriões inteiros, com uma perda mínima de sinal. Esta primeira série mostra uma retina de peixe-zebra cujos núcleos foram corados com uma coloração de DNA bem estabelecida para pro três. Depois de um minuto, diminuímos o zoom.
Uma região de varredura ABL torna-se evidente quando realizamos o mesmo experimento com verde de metila, nenhum branqueamento evidente é visto. Na série a seguir, mostramos resultados representativos do que pode ser obtido usando o protocolo aqui descrito, célula mitótica da epiderme do peixe-zebra na qual figuras mitóticas podem ser observadas. IIC do mesmo espécime onde a arquitetura nuclear pode ser vista.
Reconstrução 3D de uma parte de uma célula epidérmica de larvas de peixe-zebra marcada com amalina verde de metila, uma visão mais panorâmica de diferentes formas nucleares dentro de uma fertilização portuária de 48 horas, traça, br retina. Mostramos aqui uma maneira fácil de preparar uma coloração de DNA fluorescente extremamente barata que pode ser usada na marca nuclear, embora mostremos apenas como exemplo, o de segurar vários. Esta técnica pode ser aplicada aos seus embriões ou tecidos, seja de montagem inteira ou seccional.
Também pode ser usado para coloração de DNA em géis e para determinação de DNA em solução usando fotometria.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para coloração fluorescente de material biológico fixado utilizando verde de metila, um marcador específico para DNA. A emissão no infravermelho distante do verde de metila permite a obtenção de imagens profundas de espécimes, tornando-o adequado para embriões inteiros.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microscopia fluorescente
- Coloração histológica
- Imagem biológica
Contexto
- O verde metílico é um corante histológico comum.
- Ele interage fortemente com o DNA, ligando-se preferencialmente a regiões ricas em AT.
- Foi descoberto no contexto da pesquisa sobre DNA no final do século XIX.
- O corante é resistente ao fotodesbotamento, o que aumenta sua utilidade em microscopia.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o uso do verde de metila como marcador nuclear em microscopia fluorescente.
- Fornecer um método para o preparo de soluções estoque e de trabalho para coloração.
- Apresentar a imagem confocal de espécimes biológicos espessos.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções estoque e de trabalho de verde de metila.
- Coloração fluorescente de material biológico fixado.
- Aplicação de microscopia confocal a laser.
- Obtenção de imagens de embriões inteiros e análise de imagens confocais.
Resultados Principais
- Coloração nuclear bem-sucedida de embriões de peixe usando verde de metila.
- Demonstração de excelentes capacidades de imagem devido às propriedades do verde de metila.
- As imagens confocais obtidas mostram marcação nuclear clara.
- Foi confirmada a resistência do verde de metila ao fotodesbotamento.
Conclusões
- O verde metila é um corante nuclear eficaz para microscopia fluorescente.
- Suas propriedades tornam-no adequado para a obtenção de imagens de espécimes biológicos espessos.
- O método pode ser aplicado a diversas áreas de pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A marcação fluorescente do núcleo com verde de metila permite a obtenção de imagens de alta resolução dos núcleos em espécimes biológicos espessos, apoiando fluxos de trabalho de descoberta precoce e validação de alvos. Sua estabilidade, especificidade pelo DNA e compatibilidade com microscopia confocal proporcionam confiança preditiva para análises em nível celular e tecidual. Essa capacidade aprimora a tomada de decisões em portfólios ao permitir imagens robustas e reprodutíveis em sistemas modelo complexos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Facilita a visualização precisa do núcleo para estudos orientados por hipóteses em células e tecidos fixados.
- Apoia a validação funcional de alvos ao permitir a identificação clara da arquitetura nuclear.
- Reduz a ambiguidade mecanicista em modelos celulares por meio de marcação específica de DNA.
- Permite o triagem confiante de alvos candidatos com base em dados de imagem de alta fidelidade.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de imagemagem de alto conteúdo posteriores.
- Fornece marcação nuclear reprodutível e quantitativa, essencial para a padronização de ensaios.
- Permite escalabilidade e reutilização da plataforma devido à estabilidade e baixo custo da verde de metila.
- Permite avaliação confiável de compostos ao minimizar o desbotamento fotográfico e a perda de sinal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a sistemas modelo relevantes para doenças ao permitir a obtenção de imagens em embriões inteiros e tecidos espessos.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica com marcação nuclear robusta.
- Apóia o avanço ajustado ao risco ao fornecer resultados de imagem consistentes entre modelos.
- Amplia a redução de riscos preditiva por meio da compatibilidade com protocolos de coloração multiplexada.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A marcação fluorescente com verde de metila integra-se ao continuum de descoberta, desde a fase inicial de testes de hipóteses até a imagem pré-clínica, apoiando fluxos de trabalho que exigem visualização nuclear robusta em espécimes complexos.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses e esclarecer vias por meio de imagem nuclear específica para DNA.
- Triagem: Fornece marcação nuclear pronta para ensaios e reprodutível para plataformas de triagem de alto conteúdo.
- Análises: Fornece leituras quantitativas e fotostáveis para análise comparativa de condições celulares.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores e a continuidade em modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma solução de marcação estável e economicamente eficiente, adaptável a diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade na imagem nuclear.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade nos fluxos de trabalho de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir e a eficiência do capital ao permitir a geração de dados robustos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal e técnicas de imagem fluorescente.
- Exige acesso a detectores espectrais e fontes de excitação a laser compatíveis (por exemplo, 633 nm).
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de coloração e de imagem para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos sistemas modelo fixados, incluindo embriões inteiros e cortes de tecidos.
- Limitado a espécimes fixados; não adequado para imagem nuclear em células vivas.
