Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

O objetivo geral do experimento a seguir é sintetizar e caracterizar nanopartículas lipídicas para vacinas e avaliar sua capacidade de induzir a expansão de linfócitos T citotóxicos específicos para antígenos in vivo. Isso é alcançado por meio da engenharia de vesículas multilamelares interbilaminares reticuladas, ou ICMVs, que mimetizam patógenos e são carregadas simultaneamente com antígeno e adjuvante para vacinação de camundongos ingênuos. Transferidos adotivamente com linfócitos T positivos para CD8, específicos para antígeno e expressando luciferase.

No segundo passo, a expansão dos linfócitos T CD8 positivos específicos para o antígeno é avaliada por meio de imagem in vivo em todo o organismo. As células mononucleares do sangue periférico, obtidas de animais imunizados com ICMV, são então coradas com tetraméricos marcados com fluoróforos e analisadas por citometria de fluxo para quantificar a frequência dos linfócitos T CD8 positivos específicos para o antígeno endógeno no compartimento sistêmico. Em última instância, a imagem bioluminescente pode ser utilizada para acompanhar a expansão dos linfócitos T citotóxicos específicos em resposta à vacinação com nanopartículas.

Esses métodos podem ajudar a responder perguntas preliminares importantes no desenvolvimento de vacinas, como qual é a extensão da expansão de linfócitos T citotóxicos e como essas células migram para diversos tecidos em resposta à vacinação com nanopartículas? A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como a análise de células T in situ após necropsia de tecidos, é que a imagem in vivo da resposta de células T é não invasiva. Permitindo o monitoramento longitudinal do mesmo animal, comece misturando uma proporção molar um para um de DOPC e MPB em clorofórmio, mantendo uma quantidade total de lipídio de 1,26 micromol por lote em um frasco de vidro de 20 mililitros.

Em seguida, adicione o carregador lipofílico à solução lipídica na concentração desejada e purgue a solução com gás nitrogênio seco adicional para remover completamente o solvente orgânico. Coloque a amostra sob vácuo durante a noite e, na manhã seguinte, adicione 200 microlitros de BTP 10 milimolar contendo o carregador de interesse solúvel em água para hidratar o filme lipídico; vorte a solução resultante por 10 segundos a cada 10 minutos durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, transfira o conteúdo para um tubo microcêntrifuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, coloque o tubo em banho de gelo com água, realizando sonicação contínua usando o ajuste de intensidade de 40% em uma ponta de sonicador de 125 watts e 20 quilohertz. Após cinco minutos, adicione quatro microlitros de DTT 150 milimolar ao tubo, vortexie para homogeneizar e centrifugue a amostra em uma microcentrífuga. Em seguida, adicione 40 microlitros de cloreto de cálcio 200 milimolar à amostra, seguido da reticulação das camadas lipídicas contendo MPB com DTT a 37 graus Celsius por uma hora.

No final da incubação, centrifugue a solução três vezes, adicionando 200 microlitros de água bidestilada durante a segunda e terceira centrifugação, para remover o cloreto de cálcio remanescente, o DTT não reagido e os materiais de carga não encapsulados do sobrenadante. Após a última centrifugação, suspendemos os I CMVs em 100 microlitros de pegol recém-preparado durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave os vesículos mais duas vezes com água bidestilada.

Ressuspenda o pellet final em PBS e armazene os VCI a quatro graus Celsius. Para caracterizar as partículas, misture a suspensão fria de VCI antes de diluir uma pequena alíquota da amostra em um volume total de um mililitro de água bidestilada. Em seguida, coloque os VCI em uma cubeta do zeta sizer e utilize um sistema de espalhamento dinâmico de luz e medição de potencial zeta para determinar o tamanho das partículas, o índice de polidispersão e o potencial zeta das amostras de acordo com as instruções do fabricante.

Para isolar células T CD8 positivas expressando luciferase específicas por ova, primeiro colete os baços de camundongos transgênicos OT1 luciferase. Coloque os tecidos em cinco mililitros de PBS frio com gelo e 2% de FBS e, em seguida, na cabine de fluxo laminar.

Use o êmbolo de uma seringa de três mililitros para triturar até três baços de uma vez através de uma peneira de 70 mícrons em um tubo cônico de 15 mililitros. Lave o êmbolo e a peneira com PBS e 2% FBS. Em seguida, ajuste o volume total da suspensão celular para 10 mililitros por baço.

Determine o número total de células e, em seguida, centrifugue as células. Depois, utilize um kit comercial de seleção negativa magnética para isolar as células esplênicas CD oito positivas de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, lave as células T em PBS.

Conte-os e incube duas a três vezes 10 elevado à quinta dessas células em 20 microlitros de anticorpo bloqueador de CD1632 de camundongo. Após 10 minutos, adicione 20 microlitros de anticorpo anti-CD8a PC às células por 30 minutos e avalie a pureza da população de linfócitos T CD8 positivos isolados por microesferas magnéticas por citometria de fluxo. Em seguida, transfira adotivamente uma a 10 vezes 10 elevado à quinta células T CD8 positivas OT1 luciferase para camundongos albinos C57BL/6 ingênuos e depilados em 200 microlitros de PBS por injeção intravenosa na veia da cauda; 24 horas depois, administre a vacina no número apropriado de dias após a vacinação.

Injete os animais com 150 miligramas por quilograma de Lucifer após 10 minutos, adquira o sinal de bioluminescência por cinco a 10 minutos com um sistema de imagem de animal inteiro para visualizar as células T OT um Lucifer CD oito positivas e determinar o número de células T CD oito positivas específicas para o antígeno no momento apropriado. Após a vacinação, colete aproximadamente 100 microlitros de sangue dos camundongos vacinados por meio da técnica de sangria submandibular em um tubo revestido com EDTA de potássio, inverta o tubo várias vezes para evitar coagulação. Em seguida, transfira 100 microlitros de sangue para um tubo de microcentrífuga e adicione um mililitro de um tampão de lise CK.

Após dois a três minutos, centrifugue as células e remova o sobrenadante. Lave os PBMCs restantes em um mililitro de tampão fax e bloqueie a ligação inespecífica com CD 1632 conforme demonstrado anteriormente. Após 10 minutos, divida a suspensão celular em tubos fax redondos de quatro mililitros e adicione 20 microlitros da solução PE fecal tetramer H dois KB sobre cada amostra, de acordo com as especificações do fabricante.

Após 30 minutos em gelo, adicione 20 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado a cada amostra experimental e os anticorpos de controle monocromáticos para cada tetramero ou anticorpo monocromático a cada amostra de controle. Por fim, após uma nova incubação de 20 minutos, lave todas as amostras em tampão fax, ressuspenda os pellets em tampão fax suplementado com DPI e analise as amostras por citometria de fluxo. Os CMVs co-carregados com antígenos proteicos monocromáticos e corantes lipofílicos fluorescentes permitem a visualização da entrega de antígenos e nanopartículas in vivo. Por exemplo, imagens de microscopia confocal indicam que o antígeno solúvel administrado por via subcutânea na base da cauda alcança os linfonodos drenantes dentro de quatro horas após a administração e é eliminado em 24 horas.

Em contraste, os CMV carregados excessivamente são inicialmente detectados na periferia dos linfonodos drenantes 24 horas após a administração, com uma acumulação contínua que resulta em um grande depósito de CMV-Ova dentro do tecido linfático drenante. No quarto dia, de fato, a imagem de bioluminescência de camundongos C57BL/6 que receberam transferência adotiva de células T CD8 positivas OT1 luciferase no dia da vacinação demonstra um nível de fundo mínimo de células T OT1 luciferase no quarto dia após a vacinação. No entanto, camundongos imunizados com os CMV-Ova MPI exibem um sinal de bioluminescência robusto dentro dos linfonodos inguinais drenantes.

Os camundongos vacinados com ova solúvel, por outro lado, demonstram uma expansão muito reduzida das células T CD8 positivas OT-I Luciferase nos linfonodos drenantes. Além disso, camundongos imunizados com ova solúvel e MPLA, sem qualquer transferência adotiva de células T específicas para antígeno, não exibem uma expansão apreciável de células T CD8 positivas específicas para ova, conforme indicado pelo monitoramento semanal das PBMC. A vacinação com ICMV, no entanto, induz uma resposta mais forte e endógena de células T CD8 positivas, atingindo um pico de 28% das células T tetraméricas positivas para sin fecal dentro do compartimento de células T CD8 positivas entre as PBMC no dia 41. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas baseadas em lipídios, realizar imunizações e visualizar e quantificar a expansão de CTL in vivo.

Esses métodos podem ser ainda modificados para revelar informações adicionais sobre a resposta CTL. Por exemplo, o ensaio de coloração teer pode ser complementado com marcadores adicionais, como CD127, BCL2 e KLRG1, para avaliar o fenótipo de memória das células.