Name: Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas lipídicas de vacina e avaliar a expansão de células T CD8+ específicas de antígeno em modelo murino usando imagem de corpo inteiro e citometria de fluxo.

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Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder 1K22AI097291-01 e pelo Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número UL1TR000433. Nós também reconhecemos Prof. Darrell Irvine no MIT e Prof. Matthias Stephan no Fred Hutchinson Cancer Center por sua contribuição no trabalho inicial sobre as nanopartículas de vacinas e camundongos transgênicos OT-I / Luc.

Todas as experiências descritas neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Universidade de uso e cuidados dos Animais (UCUCA) na Universidade de Michigan e realizado de acordo com as políticas e diretrizes estabelecidas. 1. Síntese e Caracterização de ICMVs Co-carregado com proteína Antígeno e Adjuvante Moléculas <ol><li> Mistura 1: 1 de razão molar de 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl--sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butiramida] (MPB) em clorofórmio, mantendo-se a quantidade total de lípidos em 1,26 umol por lote (isto é, 500 jig de DOPC e 630 ug de MPB) em um frasco de vidro de 20 ml (diâmetro = 28 mm e altura = 61 mm). </li><li> Adicionar fármacos lipofílicos, tais como monofosforil lípido A (MPLA) ou corantes lipofílicos (por exemplo, fez), para a solução de lípido na concentração desejada. Cuidadosamente remover o solvente orgânico por purga com nitroge extra-secon gás e colocando as amostras sob vácuo O / N. </li><li> Hidratar a película de lípidos pela adição de 200 ul de 10 mM de bis-Tris propano (BTP, pH 7,0) contendo fármacos solúveis em água (por exemplo, antigénios de proteína). Vortex durante 10 segundos cada 10 minutos durante 1 h à TA. </li><li> Transferir o conteúdo do frasco de vidro para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as amostras lugar num banho de gelo-água, e sonicar continuamente durante 5 min, utilizando a intensidade de 40% em uma configuração de 125 W / 20 kHz sonda de sonicador de ponta. </li><li> Adicionar 4 mL de 150 mM de ditiotreitol (DTT) para cada lote (concentração de trabalho de 2,4 mM), vortex, e centrifuga-se brevemente utilizando um tampo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 40 ul de 200 mM CaCl 2 e misturar-se com a pipeta (concentração de trabalho de 33 mM). Incubar as amostras a 37 ° C durante 1 hora para permitir a reticulação da MPB contendo camadas lipídicas com DTT. </li><li> Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 15 min, remover o sobrenadante e ressuspender em 200 ul de ddiH 2 O. </li><li> Repetir o passo de 1,7 e centrifuga-se novamente após a segunda ddiH 2 O lavagem para remover de CaCl2, que não reagiu, DTT, não encapsulados e materiais de carga a partir do sobrenadante. </li><li> Prepare a 10 mg / ml de 2 kDa polietileno glicol-tiol (PEG-SH) em ddiH 2 O. Ressuspender cada amostra ICMV em 100 ul de solução de PEG-SH e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Execute duas ddiH 2 O lavagens (passo 1.7) e ressuspender o sedimento ICMV final em PBS e armazenar a 4 ° C. Antes de usar, misturar a suspensão ICMV, como partículas podem assentar no fundo após um armazenamento prolongado. </li><li> Para a caracterização de partículas, remover uma pequena alíquota (~ 10%) de ICMVs de cada lote individualmente e diluir num volume total de 1 ml de ddiH 2 O. Colocar uma única amostra num Zetasizer tamanho celular e medida da partícula, o índice de polidispersidade, e potencial zeta das amostras usando um sistema de medição de DLS e potencial zeta (de acordo com o protocolo do fabricante). </li></ol> 2. O exame do Linfonodo Drenagem de ICMVs Fluorescência-marcado com microscopia confocal <ol><li> Preparação de ICMVs carregado com antigénio marcado com fluoróforo e corante fluorescente lipof ílico <ol><li> Prepare a proteína marcada com fluororo, tal como ovalbumina feito reagir com éster de Alexa Fluor 555-succinimidilo, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Para preparar ICMVs marcados com fluoróforo no invólucro lipídico, adicionar corante fluorescente lipof ílico, (por exemplo, 1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) durante a preparação da película de lípido (Passo 1.2) na quantidade de 0,05% molar de lípido. Para a hidratação do lípido filme (Passo 1,3), tampão de utilização contendo o antigénio marcado com fluoróforo, e a síntese completa ICMV como descrito nas etapas 1,4-1,11. </li></ol></li><li> A administração subcutânea de nanoparticulas na base da cauda <ol><li> Anestesiar rato usando um vaporizador fluxo controlado equipado com uma câmara de indução utilizing 3% de isoflurano e 1,5 L / min de fluxo de oxigênio de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Uma vez que o mouse estiver inconsciente, execute os seguintes passos rapidamente antes da anestesia desgastar fora para permitir o acesso ideal para o local da injeção e minimizar o desconforto para o animal. Como alternativa, use um bom encaixe cone do nariz para manter a anestesia. Se os ratos são anestesiados por mais de 5 minutos, aplicar lubrificante ocular necessário para minimizar a irritação após o procedimento. </li><li> Pulveriza-se a base da cauda com etanol a 70% para higienizar e molhar a pele Parte o cabelo molhado para expor um pequeno pedaço de pele visível, que pode ser usado para visualizar a agulha sob a pele. </li><li> Prepare a suspensão de injecção de partículas, contendo a quantidade desejada de antigénio e adjuvante por 100 ul de dose de vacinação em PBS (por exemplo, 10 ug de OVA e 0,3 ug MPLA por 100 ul de dose injectada foi usado no passado 6,9). </li><li> Desenhe a suspensão de partículas intOA seringa com uma agulha de 27-29 G e inserir a agulha na base da cauda (~ 5 mm da linha fina) com o chanfro voltado para cima e injectar 50 ul da suspensão de partículas 22. </li><li> Aguarde alguns segundos para que a pressão para igualar para evitar back-fluxo excessivo e retire a agulha. Repetir a injecção do outro lado da base da cauda, ​​para atingir ambos os linfonodos de drenagem inguinais. </li></ol></li><li> Preparação de criosecções nódulos linfáticos e análise com microscopia confocal. <ol><li> Eutanásia o rato com asfixia com CO 2, seguida por pneumotórax produzido de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Extrair LNs inguinais acordo com o protocolo demonstrada em Bedoya 23 e lavar o sangue, colocando os tecidos em 1 mL de PBS a 4 ° C. </li><li> Absorve o PBS a partir dos tecidos com os tecidos e colocar o tecido no cryomolds tecido (10 x 10 x 5 mm3) pré-cheia para o topo com meio de congelação 24 de outubro. Snap congelar a tissue bloco em nitrogênio líquido por 30 s. Alternativamente, coloque bloco de tecido em gelo seco durante 30 minutos. Armazenar tecido congelado em freezer -80 ° C. </li><li> Os cortes de tecido de 5-10 mm de espessura num crióstato fixada em -20 ° C 24. </li><li> Se necessário, execute rotulagem de imunofluorescência, e examinar o tecido com microscopia confocal como demonstrado anteriormente 24. </li></ol></li></ol> 3. Monitoração de Expansão de antígeno específico da, luciferase expressando células T CD8 + após Nanoparticle vacinação com Whole animal de imagem <ol><li> Isolamento de OVA 257-264 -específica, células que expressam luciferase T CD8 + a partir de ratinhos transgénicos OT-I / Luc <ol><li> Euthanize um rato transgénico OT-I / Luc com asfixia com CO2 e induzir um pneumotórax de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Colher o baço de forma estéril através do acesso a cavidade peritoneal e separar cuidadosamente o tecido do pâncreas 23, elugar em 5 ml de PBS a 4 ° C + 2% FBS para a transferência de capuz de cultura de tecidos. </li><li> Inserir o baço sobre um filtro de nylon de 70? M ao longo de um tubo de centrífuga cónico de 50 ml (até 3 baços de cada vez). Utilizando um êmbolo de uma seringa de 3 ml, moer as células através do filtro. </li><li> Lavar o êmbolo e o filtro com PBS + 2% FBS e descartar. Levar o volume total a 10 ml / baço no tubo de 50 ml, levar uma pequena amostra da suspensão de células para contagem com um hemocitómetro, e centrifuga-se durante 10 min a 300 x g. </li><li> Utilizando um kit de selecção negativa magnética comercialmente disponível, isolar a população de células T CD8 +, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Depois de lavar as células com PBS, contar o número de células T CD8 + isoladas. Para avaliar a pureza das células T CD8 + isoladas, incubar ~ 20.000-30.000 células em 20 ul de rato CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) durante 10 min, em seguida, adicionar 20 ul de anticorpo αCD8-APC (0,005 mg / ml) e incubar durante 30 min. Perform todas as incubações a 4 ° C em PBS + 1% w / v BSA. Realizar análise de citometria de fluxo 25. </li></ol></li><li> A transferência adoptiva de células T CD8 + isoladas e visualização da sua vacinação pós expansão <ol><li> Realizar a transferência adoptiva de células isolado OT-I / Luc T CD8 + em naïve C57BL / 6 ratos por administração de 1-10 x 10 5 células em um volume de 200 ul de PBS por via de injecção intravenosa na veia da cauda 22 (dia -1). Considerando que as manchas da pele e da pele preta em camundongos C57BL / 6 podem interferir com o sinal bioluminescente, albinos raspada camundongos C57BL / 6 são ideais para esses estudos. </li><li> Depois de um dia (dia 0), administrar a vacina como previamente descrito (secção 2.2). </li><li> Administrar 150 mg de luciferina por kg de peso corporal do ratinho por via intraperitoneal num volume de 300 ul de PBS. Após 10 min, anestesiar os ratos com isoflurano (como no passo 2.2.1) e visualizar as células AT-I / Luc T CD8 + através da aquisição do sinal de bioluminescência durante 5-10 min wom um sistema de imagem animal inteiro (IVIS; referem-se a Wilson 26 para instruções detalhadas). Repita conforme necessário para os estudos longitudinais. </li></ol></li></ol> As células T CD8 + 4. péptido-MHC Tetrâmero Coloração de PBMC para análise do antigénio específico da- Nota: O procedimento seguinte protocolo pode ser realizada utilizando tanto ratinhos C57BL / 6 com células transferidas adoptivamente OT-I / Luc T CD8 + ou ratinhos C57BL / 6, sem a transferência adoptiva. <ol><li> Num ponto de tempo desejado após a vacinação, recolher aproximadamente 100 mL de sangue (4-6 gotas) a partir de ratinhos por sangramento submandibular técnica 27 dentro de um tubo revestido com K2EDTA e gire várias vezes para evitar a coagulação. </li><li> Transferir 100 uL de sangue para um tubo de microcentrífuga, adicionar 1 ml de tampão de lise, e incubar durante 2 a 3 minutos, a fim de remover as células vermelhas do sangue (RBC). Centrifugar as amostras durante 5 min a 1500 x g e eliminar o sobrenadante. Se o sedimento ainda umppears vermelho (indicando remoção incompleta de hemácias), repita o passo de lise com uma breve incubação (&lt;1 min) de lise. </li><li> Lavam-se as PBMC restantes com 1 ml de tampão de FACS (PBS + 1% p / v de BSA) e centrifugar a 1500 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender a amostra em 20 ul de rato CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) para bloquear o anticorpo não específico e FcR-mediada de ligação. Incubar durante 10 min à TA. </li><li> Células transferir de microtubos em 4 ml tubos de FACS de fundo redondo. Adicionar 20 ul de H-2K b solução de OVA SIINFEKL Tetrâmero-PE de acordo com as especificações do fabricante para cada amostra e incubar durante 30 min em gelo. </li><li> Preparar a mistura de anticorpos (por exemplo, αCD8-APC, αCD44-FITC, e αCD62L-PECy7 anticorpos (0,005, 0,005, e 0,002 mg / ml de concentração, respectivamente)). Adicionar 20 ul de cada amostra experimental, e incubar durante 20 min em gelo. Preparar controlos fluoróforo individuais por labeling células com cada tetrâmero marcado com fluoróforo ou o anticorpo na concentração indicada acima. </li><li> Lavar duas vezes com tampão FACS e ressuspender o sedimento final em tampão FACS contendo 2 mg / ml de DAPI. As células são agora pronto para a análise de citometria de fluxo (detalhes e exemplos podem ser encontrados em Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer, desde que o custo de produção incorridos durante a publicação deste artigo.

O protocolo fornecido neste artigo descreve a síntese e caracterização de um novo sistema de nanopartículas à base de lípidos, denominado ICMVs, e fornece o processo de validação da eficácia de formulações de vacinas à base de nanopartículas para induzir respostas de CD8 +, células T específicas de antigénio. ICMV síntese é completada em todas as condições aquosa, o que é uma grande vantagem em comparação com outros sistemas habitualmente utilizados nanopartículas poliméricas (por exemplo, poli (lactido-co-glic...

Desenvolvimento tradicional vacina tem utilizado, principalmente, a abordagem empírica de tentativa-e-erro. No entanto, com o recente desenvolvimento de uma grande variedade de biomateriais e descoberta de determinantes moleculares de activação imunitária, é agora possível conceber racionalmente formulações de vacinas com pistas biofísicas e bioquímicas derivados de patogénios 1,2. Em particular, várias plataformas de entrega de droga de partículas foram examinados como transportadores de vacinas uma vez que podem ser co-carregadas com antigénios de subunidade e agentes imunoestimulantes, proteger os componentes da vacina contra a degradação, e aumentar a sua co-entrega a células apresentadoras de antigénio (APCs), residente em linfa nodos (LNs), maximizando assim a estimulação e activação imunitária 3-5. Neste relatório, descreve-se a síntese de um sistema de nanopartículas &quot;-imitando agente patogénico&quot;, denominados interbilayer reticulado vesículas multilamelares (ICMVs), que tenham sido previamente demonstrado como uma vacina potente Platform para elicitação de robusto de linfócitos T citotóxicos (CTL) e respostas imunitárias humorais em ambos os compartimentos dos tecidos das mucosas e sistémicas 6-9. Em particular, a vacinação com ICMVs alcançado substancialmente melhorada níveis de IgG no soro contra um antigénio da malária, em comparação com a vacinação com adjuvantes convencionais (por exemplo, alúmen e Montanide 7) e também induziu respostas CTL potentes contra células tumorais e modelos de desafio virais em ratinhos 9. Aqui, usando ICMVs como um sistema de nanopartículas vacina modelo, descrevem métodos para caracterização de nano-vacinais formulações, incluindo tamanho de partícula e medições de potencial zeta e monitoramento do tráfico de partículas para linfonodos drenantes (dLNs) utilizando confocal imagem de tecidos criosseccionada 7. Além disso, apresenta-se um método baseado no de imagem inteira em animais de análise de expansão de respostas por CTL em ratinhos após a transferência adoptiva de células específicas para o antigénio T CD8 + que expressam luciferase 9,10. Finalmente, deescriba tetrâmero coloração de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para quantificação longitudinal de respostas de células T endógenas em ratinhos vacinados com nanopartículas 6,9. ICMVs são uma formulação de nanopartículas à base de lípidos sintetizados por fusão controlada de lipossomas simples em estruturas multilamelares, que são então estabilizadas quimicamente por grupos de cabeça de fosfolípidos de reticulação funcionalizado com maleimida dentro camadas lipídicas com ditiol reticuladores 6. Uma vez ICMVs são sintetizados, uma pequena fracção de nanopartículas podem ser usadas para determinar o tamanho de partícula e potencial zeta (isto é, carga de superfície das partículas), com um sistema de dispersão de luz dinâmica (DLS), e um analisador de potencial zeta. DLS medidas de mudanças na dispersão de luz em suspensões de partículas, permitindo a determinação do coeficiente de difusão e o tamanho hidrodinâmico de partículas 11. Atingir o tamanho de partícula consistente de lote para lote é crítica sínteseuma vez que o tamanho de partícula é um dos principais factores que influenciam a drenagem linfática das partículas de vacinas para dLNs e subsequente absorção celular por APCs 12,13. Além disso, o potencial zeta pode ser obtido por medição da velocidade das partículas, quando uma corrente eléctrica é aplicada, o que permite a determinação da mobilidade electroforética das partículas e superfície das partículas de carga 11. Assegurar valores de potencial zeta consistentes de partículas é importante uma vez que a carga superficial das partículas determina a estabilidade coloidal, o que tem um impacto directo sobre a dispersão das partículas durante o armazenamento e após a administração in vivo 14,15. A fim de controlar a localização das partículas para dLNs, ICMVs pode ser marcado com fluoróforos desejados, incluindo corantes lipofílicos e antigénios covalentemente marcados. A seguir à imunização, os ratos podem ser sacrificados em vários pontos temporais, dLNs ressecado, criosseccionada, e analisados ​​com microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização de drai linfáticoNing de ambos os veículos de vacina para antigénio de nanopartículas e dLNs. As secções de tecido podem ser adicionalmente coradas com anticorpos marcado por fluorescência e utilizada para obter mais informação, tais como tipos de células associadas com o antigénio e a formação de centros germinais como mostrámos anteriormente 7. Uma vez que a síntese de partículas é optimizada e tráfico para os dLNs é confirmada, é importante para validar elicitação de expansão de CTL in vivo. A fim de analisar a elicitação de células específicas para o antigénio T CD8 + em resposta à vacinação de nanopartículas, nós utilizamos um modelo de antigénio, ovalbumina (OVA), 257-264 péptido com OVA (SIINFEKL) epítopo imunodominante de células T CD8 +, o que permite que as análises imunológicas detalhados de respostas de células T específicas para o antigénio para o desenvolvimento de vacinas inicial 16,17. Em particular, para interrogar a dinâmica de expansão e migração de células específicas para o antigénio T CD8 +, que geraram ummodelo de ratinho transgénico duplo da luciferase do pirilampo por cruzamento de ratinhos transgénicos que expressam (Luc) com OT-I ratinhos transgénicos que possuem células T CD8 + com o receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (em associação com H-2K b). A partir destes ratinhos OT-I / Luc, que expressam luciferase, as células AT-I T CD8 + pode ser isolado e preparado para transferência adoptiva para naive C57BL / 6. Uma vez semeadas, a imunização bem sucedida com nanopartículas contendo OVA resultará na expansão das células T transferidas, que podem ser controladas através da monitorização do sinal de bioluminescência com um sistema de imagem de animais 9,10 todo. Esta técnica de imagem não invasiva de corpo inteiro foi usado com outros antigénios virais ou tumorais no passado 18-20, processos envolvidos na expansão das células T em tecidos linfóides e difusão para os tecidos periféricos de um modo longitudinal revelando. Complementar para análise de adoptivamente células específicas de antigénio transferidos T CD8 +, endógenoas respostas das células T após vacinação nos pode ser examinado com o complexo de péptido-histocompatibilidade principal (MHC) de ensaio de tetrâmero 21, em que um complexo péptido-MHC de tetrâmero, que consiste de quatro marcado com fluoróforo do MHC de classe I de moléculas carregadas com epítopos de péptidos, é empregue TCR se ligar e marcar as células T CD8 + de um modo específico do antigénio. O ensaio de tetrâmero de péptido-MHC pode ser realizada tanto em estudos de necropsia terminais para identificar as células T CD8 + específicas para o antigénio em linfóides e tecidos periféricos ou em estudos longitudinais com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de sangue em série chama. Após a coloração de linfócitos com péptido-MHC de tetrâmero, análise de citometria de fluxo é realizada por análises detalhadas sobre o fenótipo dos CTL ou quantificação da sua frequência entre as células T CD8 +.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Síntese e caracterização de ICMVs co-carregados com antígeno proteico e moléculas adjuvantes</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil)butiramida] (sal de sódio) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Monofosforil Lipídio A (Sintético) (PHAD&trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro de 20 ml</td> Forno a Vácuo <td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumina (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris Propano (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicator (125&nbsp; W/20&nbsp; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Polietilenoglicol Tiolado (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Cuvettes</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Exame de drenagem linfonodal de ICMVs marcados com fluorescência com microscopia confocal</td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina, 4-Clorobenzenossulfonato Sal (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT meio de congelamento&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Criomoldes de tecido</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Monitoramento da expansão de células T CD8+ específicas do antígeno, que expressam luciferase, após vacinação com nanopartículas com imagens de animais inteiros</camundongos strong></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>camundongos Albino C57BL/6</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6</td><td>camundongos Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m coador de nylon</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Kit de Isolamento de Células T CD8+ de Camundongo</td><td>Células-Tronco</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; sistema de imagem de animais inteiros</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Coloração de tetrâmero peptídico-MHC de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para análise de citometria de fluxo de células T CD8+ específicas para antígenos</td></tr><tr><td>K2EDTA tubos</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampão de lise</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Fc Block</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetramer</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6- Dicloridrato de diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn Citômetro de fluxo</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para cd8 + respostas de células t análise do antigénio específico da nanoparticle após vacinação

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Adjuvantes vacinais tradicionais, como alúmen, provocam respostas subótimas de células T CD8+. Para enfrentar esse grande desafio no desenvolvimento de vacinas, vários sistemas de nanopartículas foram projetados para imitar as características dos patógenos para melhorar a entrega de antígenos aos linfonodos de drenagem e aumentar a captação de antígenos pelas células apresentadoras de antígenos, levando a novas formulações de vacinas otimizadas para indução de respostas de células T CD8+ específicas do antígeno. Neste artigo, descrevemos a síntese de um sistema de nanopartículas "imitador de patógenos", denominado vesículas multilamelares reticuladas entre bicamadas (ICMVs) que podem servir como um transportador de vacina eficaz para a co-entrega de antígenos de subunidades e agentes imunoestimuladores e elicitação de potentes respostas de linfócitos T CD8 + citotóxicos (CTL). Descrevemos métodos para caracterizar o tamanho hidrodinâmico e a carga superficial de nanopartículas de vacina com espalhamento dinâmico de luz e analisador de potencial zeta e apresentamos um procedimento baseado em microscopia confocal para analisar a entrega de antígenos mediados por nanopartículas aos linfonodos de drenagem. Além disso, mostramos uma nova técnica de imagem de bioluminescência de animais inteiros utilizando a transferência adotiva de células T CD8 + específicas para antígenos que expressam luciferase em camundongos receptores, seguida de vacinação com nanopartículas, que permite a interrogação não invasiva de padrões de expansão e tráfego de CTLs em tempo real. Também descrevemos a coloração de tetrâmero e a análise por citometria de fluxo de células mononucleares do sangue periférico para quantificação longitudinal das respostas endógenas das células T em camundongos vacinados com nanopartículas.

Os passos envolvidos na síntese de ICMVs estão ilustrados na Figura 1 6. Resumidamente, uma película de lípido contendo quaisquer fármacos lipofílicos ou corantes fluorescentes é hidratado na presença de drogas hidrofílicas. Os catiões divalentes, tais como Ca 2+, são adicionados à unidade de fusão de lipossomas aniónicos em vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulação, tal como DTT, é adicionado a &quot;staple&quot; lípidos funcionalizado com maleimida na apposing camada...

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

O objetivo geral do experimento a seguir é sintetizar e caracterizar nanopartículas lipídicas para vacinas e avaliar sua capacidade de induzir a expansão de linfócitos T citotóxicos específicos para antígenos in vivo. Isso é alcançado por meio da engenharia de vesículas multilamelares interbilaminares reticuladas, ou ICMVs, que mimetizam patógenos e são carregadas simultaneamente com antígeno e adjuvante para vacinação de camundongos ingênuos. Transferidos adotivamente com linfócitos T positivos para CD8, específicos para antígeno e expressando luciferase.No segundo passo, a expansão dos linfócitos T CD8 positivos específicos para o antígeno é avaliada por meio de imagem in vivo em todo o organismo. As células mononucleares do sangue periférico, obtidas de animais imunizados com ICMV, são então coradas com tetraméricos marcados com fluoróforos e analisadas por citometria de fluxo para quantificar a frequência dos linfócitos T CD8 positivos específicos para o antígeno endógeno no compartimento sistêmico. Em última instância, a imagem bioluminescente pode ser utilizada para acompanhar a expansão dos linfócitos T citotóxicos específicos em resposta à vacinação com nanopartículas.Esses métodos podem ajudar a responder perguntas preliminares importantes no desenvolvimento de vacinas, como qual é a extensão da expansão de linfócitos T citotóxicos e como essas células migram para diversos tecidos em resposta à vacinação com nanopartículas? A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como a análise de células T in situ após necropsia de tecidos, é que a imagem in vivo da resposta de células T é não invasiva. Permitindo o monitoramento longitudinal do mesmo animal, comece misturando uma proporção molar um para um de DOPC e MPB em clorofórmio, mantendo uma quantidade total de lipídio de 1,26 micromol por lote em um frasco de vidro de 20 mililitros.Em seguida, adicione o carregador lipofílico à solução lipídica na concentração desejada e purgue a solução com gás nitrogênio seco adicional para remover completamente o solvente orgânico. Coloque a amostra sob vácuo durante a noite e, na manhã seguinte, adicione 200 microlitros de BTP 10 milimolar contendo o carregador de interesse solúvel em água para hidratar o filme lipídico; vorte a solução resultante por 10 segundos a cada 10 minutos durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, transfira o conteúdo para um tubo microcêntrifuga de 1,5 mililitro.Em seguida, coloque o tubo em banho de gelo com água, realizando sonicação contínua usando o ajuste de intensidade de 40% em uma ponta de sonicador de 125 watts e 20 quilohertz. Após cinco minutos, adicione quatro microlitros de DTT 150 milimolar ao tubo, vortexie para homogeneizar e centrifugue a amostra em uma microcentrífuga. Em seguida, adicione 40 microlitros de cloreto de cálcio 200 milimolar à amostra, seguido da reticulação das camadas lipídicas contendo MPB com DTT a 37 graus Celsius por uma hora.No final da incubação, centrifugue a solução três vezes, adicionando 200 microlitros de água bidestilada durante a segunda e terceira centrifugação, para remover o cloreto de cálcio remanescente, o DTT não reagido e os materiais de carga não encapsulados do sobrenadante. Após a última centrifugação, suspendemos os I CMVs em 100 microlitros de pegol recém-preparado durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave os vesículos mais duas vezes com água bidestilada.Ressuspenda o pellet final em PBS e armazene os VCI a quatro graus Celsius. Para caracterizar as partículas, misture a suspensão fria de VCI antes de diluir uma pequena alíquota da amostra em um volume total de um mililitro de água bidestilada. Em seguida, coloque os VCI em uma cubeta do zeta sizer e utilize um sistema de espalhamento dinâmico de luz e medição de potencial zeta para determinar o tamanho das partículas, o índice de polidispersão e o potencial zeta das amostras de acordo com as instruções do fabricante.Para isolar células T CD8 positivas expressando luciferase específicas por ova, primeiro colete os baços de camundongos transgênicos OT1 luciferase. Coloque os tecidos em cinco mililitros de PBS frio com gelo e 2% de FBS e, em seguida, na cabine de fluxo laminar.Use o êmbolo de uma seringa de três mililitros para triturar até três baços de uma vez através de uma peneira de 70 mícrons em um tubo cônico de 15 mililitros. Lave o êmbolo e a peneira com PBS e 2% FBS. Em seguida, ajuste o volume total da suspensão celular para 10 mililitros por baço.Determine o número total de células e, em seguida, centrifugue as células. Depois, utilize um kit comercial de seleção negativa magnética para isolar as células esplênicas CD oito positivas de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, lave as células T em PBS.Conte-os e incube duas a três vezes 10 elevado à quinta dessas células em 20 microlitros de anticorpo bloqueador de CD1632 de camundongo. Após 10 minutos, adicione 20 microlitros de anticorpo anti-CD8a PC às células por 30 minutos e avalie a pureza da população de linfócitos T CD8 positivos isolados por microesferas magnéticas por citometria de fluxo. Em seguida, transfira adotivamente uma a 10 vezes 10 elevado à quinta células T CD8 positivas OT1 luciferase para camundongos albinos C57BL/6 ingênuos e depilados em 200 microlitros de PBS por injeção intravenosa na veia da cauda; 24 horas depois, administre a vacina no número apropriado de dias após a vacinação.Injete os animais com 150 miligramas por quilograma de Lucifer após 10 minutos, adquira o sinal de bioluminescência por cinco a 10 minutos com um sistema de imagem de animal inteiro para visualizar as células T OT um Lucifer CD oito positivas e determinar o número de células T CD oito positivas específicas para o antígeno no momento apropriado. Após a vacinação, colete aproximadamente 100 microlitros de sangue dos camundongos vacinados por meio da técnica de sangria submandibular em um tubo revestido com EDTA de potássio, inverta o tubo várias vezes para evitar coagulação. Em seguida, transfira 100 microlitros de sangue para um tubo de microcentrífuga e adicione um mililitro de um tampão de lise CK.Após dois a três minutos, centrifugue as células e remova o sobrenadante. Lave os PBMCs restantes em um mililitro de tampão fax e bloqueie a ligação inespecífica com CD 1632 conforme demonstrado anteriormente. Após 10 minutos, divida a suspensão celular em tubos fax redondos de quatro mililitros e adicione 20 microlitros da solução PE fecal tetramer H dois KB sobre cada amostra, de acordo com as especificações do fabricante.Após 30 minutos em gelo, adicione 20 microlitros do coquetel de anticorpos apropriado a cada amostra experimental e os anticorpos de controle monocromáticos para cada tetramero ou anticorpo monocromático a cada amostra de controle. Por fim, após uma nova incubação de 20 minutos, lave todas as amostras em tampão fax, ressuspenda os pellets em tampão fax suplementado com DPI e analise as amostras por citometria de fluxo. Os CMVs co-carregados com antígenos proteicos monocromáticos e corantes lipofílicos fluorescentes permitem a visualização da entrega de antígenos e nanopartículas in vivo. Por exemplo, imagens de microscopia confocal indicam que o antígeno solúvel administrado por via subcutânea na base da cauda alcança os linfonodos drenantes dentro de quatro horas após a administração e é eliminado em 24 horas.Em contraste, os CMV carregados excessivamente são inicialmente detectados na periferia dos linfonodos drenantes 24 horas após a administração, com uma acumulação contínua que resulta em um grande depósito de CMV-Ova dentro do tecido linfático drenante. No quarto dia, de fato, a imagem de bioluminescência de camundongos C57BL/6 que receberam transferência adotiva de células T CD8 positivas OT1 luciferase no dia da vacinação demonstra um nível de fundo mínimo de células T OT1 luciferase no quarto dia após a vacinação. No entanto, camundongos imunizados com os CMV-Ova MPI exibem um sinal de bioluminescência robusto dentro dos linfonodos inguinais drenantes.Os camundongos vacinados com ova solúvel, por outro lado, demonstram uma expansão muito reduzida das células T CD8 positivas OT-I Luciferase nos linfonodos drenantes. Além disso, camundongos imunizados com ova solúvel e MPLA, sem qualquer transferência adotiva de células T específicas para antígeno, não exibem uma expansão apreciável de células T CD8 positivas específicas para ova, conforme indicado pelo monitoramento semanal das PBMC. A vacinação com ICMV, no entanto, induz uma resposta mais forte e endógena de células T CD8 positivas, atingindo um pico de 28% das células T tetraméricas positivas para sin fecal dentro do compartimento de células T CD8 positivas entre as PBMC no dia 41. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas baseadas em lipídios, realizar imunizações e visualizar e quantificar a expansão de CTL in vivo.Esses métodos podem ser ainda modificados para revelar informações adicionais sobre a resposta CTL. Por exemplo, o ensaio de coloração teer pode ser complementado com marcadores adicionais, como CD127, BCL2 e KLRG1, para avaliar o fenótipo de memória das células.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Este vídeo descreve um protocolo para isolar células T CD8+ específicas de antígenos raros usando células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) baseadas em nanopartículas magnéticas funcionalizadas com MHC-Igs carregados de peptídeos antigênicos e anticorpos anti-CD28. A interação dos aAPCs com células T CD8+ que expressam especificamente os receptores de células T direcionados a peptídeos antigênicos, seguida de sua expansão in vitro, resulta no enriquecimento e expansão dessa...

Enriquecimento baseado em nanopartículas e expansão de células T CD8+ específicas para antígenos

Este vídeo demonstra um ensaio para analisar células T CD8+ específicas do antígeno em diferentes estágios do ciclo celular. As células viáveis marcadas com fluorescência são selecionadas usando citometria de fluxo, e as células nos diferentes estágios do ciclo celular são identificadas por seu conteúdo de DNA usando anticorpos contra a proteína nuclear associada à proliferação celular e uma coloração de ácido nucleico.

Um ensaio para análise do ciclo celular de células T CD8+ específicas do antígeno

O vídeo demonstra um método imunológico para monitorar in vivo a produção de linfócitos T citotóxicos induzidos por adjuvantes ou CTL. Um camundongo é pré-injetado com linfócitos T CD8 + de doadores proliferativos corados com corante geneticamente modificado. A injeção subcutânea de ovalbumina com adjuvantes gera linfócitos T CD8+ citotóxicos que são identificados pós-colheita por meio de imunomarcação e citometria de fluxo.

Uma técnica imunológica para monitorar a geração de linfócitos T citotóxicos mediados por adjuvantes

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Este protocolo descreve as etapas necessárias para realizar a validação ex vivo de experimentos de imagem de xenoenxerto de fluorescência de infravermelho próximo in vivo em camundongos usando nanocorpos marcados com fluoróforo e anticorpos convencionais.

Validação de nanocorpo e Antibody Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Experimentos Tumor Xenoenxerto NIRF-imagem em ratos usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria de fluxo e microscopia

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

A expansão clonal é uma característica fundamental da resposta celular T específica do antígeno. No entanto, o ciclo celular das células T que respondem antígeno tem sido pouco investigado, em parte devido a limitações técnicas. Descrevemos um método citométrico de fluxo para analisar células CD8 T específicas de antígeno em baço e linfonodos de camundongos vacinados.

Um ensaio de citometria de fluxo baseado em DNA/Ki67 para análise do ciclo celular de células CD8 T específicas de antígeno em camundongos vacinados

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In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D

Aprenda a sintetizar nanopartículas lipídicas de vacina e avaliar a expansão de células T CD8+ específicas de antígeno em modelo murino usando imagem de corpo inteiro e citometria de fluxo.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação (Vídeo) | JoVE Journal

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