Name: Fígado Preservação Human Funcional e cobrança através de Subnormothermic Máquina de Perfusão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a preservação funcional e recuperação de fígados humanos por meio de perfusão mecânica subnormotérmica a 21 °C. Este método permite avaliar a viabilidade do órgão com menor demanda metabólica.

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O financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (concede R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 e F32 DK103500), Projeto CIMIT No. 12-1732 e os Shriners Hospitals for Children é reconhecido agradecimento. Gostaríamos de agradecer também à New England Organ Banco para apoiar este trabalho.

O uso de tecidos humanos deve ser revista por um conselho de revisão institucional (IRB) ou equivalente. O trabalho aqui descrito foi aprovado e declarado isento pelo Hospital Institutional Review Board Geral de Massachusetts (No. 2011P001496). 1. Preparação de Solução <ol><li> Adicionar assepticamente suplementos para vermelho de fenol Williams &#39;medium E, conforme descrito na Tabela 1. A solução deve ser preparada antes da utilização. A insulina deve ser adicionado imediatamente antes da utilização. </li></ol> 2. Voltar Tabela Preparação do Fígado <ol><li> Coloque uma tigela órgão cheio de gelo em uma superfície estéril, drapeado. Retire o fígado a partir da caixa, deixando-o no saco de solução de preservação frio. Mantenha o fígado principalmente submerso. </li><li> Identificar a artéria hepática (HA), que será localizada distalmente ao remendo aórtico. Dissecar livre da artéria para revelar vários ramos cortados ao longo do comprimento com uma tesoura Metzenbaum. Cuidadosamente Dissect todo o comprimento da artéria para evitar cortar um vaso que alimenta o fígado. Não corte ou amarrar ramos que não têm um fim visível. </li><li> Tie fora todos os ramos arteriais que não fornecem o fígado usando sutura de seda de tamanho variando de 0 a 4-0, dependendo do tamanho do vaso. Fechar filiais que são demasiado curto para amarrar ou buracos na artéria com um ponto de prolene 7-0. Tie e cortar as artérias esplênica e gástrica esquerda perto de sua origem no tronco celíaco. </li><li> Remova o sistema da aorta cortando o tronco celíaco diretamente sob o patch. Canular tronco celíaco utilizando a cânula aórtica. </li><li> Identifique a veia porta (PV) e sem rodeios dissecá-lo livre. Empate fora quaisquer ramos e cannulate o PV com o segmento preparado de tamanho 24 tubos. </li><li> Remover seções do diafragma da veia cava supra-hepática, sem cortar a própria veia. Do fluxo de saída a partir dos drenos da veia cava directamente para dentro da câmara de órgãos. </li><li> Corte 2 full-ti circunferênciassue amostras (2-3 mm de comprimento) a partir da extremidade do ducto biliar comum; congelar uma pressão em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) e armazenar o outro em formalina tamponada a 10%, de tecidos e para análise histológica, respectivamente. Canular do ducto biliar comum com a cânula navio e um tubo de drenagem feita de tubos de oxigenador de membrana. </li><li> Identificar e ligadura do ducto cístico com um empate 0 seda. O ducto cístico é encontrada entre o ducto biliar comum e da vesícula biliar. </li><li> Conecte o flush tubo definido para sacos de gelo-frio de solução de Ringer com lactato (LR) e prepare o tubo, retirando todo o ar. </li><li> Ajuste o regulador de fluxo na tubulação de descarga a um gotejamento lento. Antes de ligar o tubo de descarga para a cânula na veia portal, oclusão da veia porta com os dedos no hilo e encher a cânula e veia com descarga para remover o ar a partir da veia porta. Não elevar o saco mais de 20 cm acima da altura do fígado durante a lavagem frio a fim de evitar uma pressão excessiva sobre oveia. </li><li> Durante o flush brevemente ocluir o PV no ponto mais baixo. Examine o PV se há vazamentos. Ramos do navio pode ser fechado como descrito acima. Lavar o fígado através da PV com um total de 2 L de gelo-LR frio. </li><li> Repita os passos de 2.10, 2.11 para o HA com 1 L de LR. </li></ol> 3. Operação do sistema SNMP <ol><li> Primeiro o aparelho de perfusão através da adição de 2 L de perfusato (21 ° C) para a bacia de órgãos e de iniciar o dispositivo para preparar o tubo. Seguir as instruções do dispositivo para preparar a perfusão, ajustando a temperatura para 21 ° C. Comece com pressões de 3 mmHg e 30 mmHg no PV e HA, respectivamente. Abra o tanque de gás e ajustado para um caudal de 3 L / min. </li><li> Tomar uma amostra de gás no sangue, tanto do ingresso HA e PV desenhando uma amostra a partir dos portos de amostra de 0,3 ml e executá-lo na máquina de gasometria de acordo com as instruções do fabricante. Confirme oxigenação adequada (pO 2&gt; 700 mmHg) e pH (7,35-7,45). </li><li> Antes do fígado está ligado tomar uma amostra de 1,0 ml de solução de perfusão como a = 0 a medição em um tubo eppendorf e armazenar a -80 ° C. Corte duas ± 250 biópsias cunha mg do fígado usando uma lâmina de aço único gumes; congelar uma pressão em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) e armazenar o outro em formalina a 10% tamponada. Pesa-se o fígado antes da perfusão. </li></ol> 4. Human Liver Perfusão <ol><li> Transferir o fígado para o dispositivo. Ligue a entrada PV à cânula PV, após a remoção de ar do PV como na etapa 2.10. Ligue o HA de um modo semelhante. Definir PV e pressão HA para 3 e 30 mmHg. O fígado deve ser quase submerso por perfusato. Cubra todas as superfícies secas, incluindo os navios de afluência, com gaze estéril molhado para evitar a desidratação </li><li> Deixe o dreno tubulação bile em um recipiente de coleta. Certifique-se a abertura do ralo biliar é ao nível do fígado ou inferior para permitir que a bile para executar out livremente. </li><li> As taxas de fluxo alvo são 275-325 ml / min.kg e 50-100 ml / min.kg para a PV e HA respectivamente uma vez que o fígado tem aquecido a 21 ° C. Uma vez que cada fígado reage de forma diferente à perfusão, monitorar o fluxo de perto durante os primeiros minutos. Aumentar ou diminuir a pressão em qualquer um dos recipientes, se as taxas de fluxo alvo não são atingidos. Não exceda 50 mmHg na HA e 5 mmHg no PV. </li><li> As amostras podem ser tomadas a partir do tecido do fígado, do perfusato e biliar no preferência investigadores. Recomendamos, no mínimo, o seguinte esquema de coleta de amostras durante a perfusão. <ol><li> Biópsias de tecidos, n = 2 x 250 mg, a cada hora. Armazenamento: tirar congelar um em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C a longo prazo. Além disso, tomar outra biópsia antes e após a perfusão e corrigir em formalina a 10% tamponada (n = 1) </li><li> As amostras de perfusado, n = 2 x 1 ml, cada 15 minutos durante a primeira hora e, posteriormente, a cada 30 min. Desenhe amostras da inf PVbaixo porta amostra. Armazenagem: -80 ° C a longo prazo. </li><li> Gasometria do PV e HA ingresso e saída da veia cava. n = 3 X 0,3 ml, cada 30 minutos. Desenhe amostras, tanto do PV e portas de amostra de HA. Desenhar uma amostra a partir da veia cava de 0,3 ml por inserção de uma seringa na veia e executado directamente no analisador de gás do sangue. Através da saída para assegurar a oxigenação e pH adequado. </li><li> Produção de bílis, n = 1 x 1 ml, a cada hora. Visualmente quantificar a produção de bile a cada hora e tirar uma amostra do recipiente de coleta. Renove o recipiente após a colheita. Armazenamento: gelo seco e -80 ° C a longo prazo. </li></ol></li><li> Continuar a perfusão durante 3 horas. Controlo da pressão, pH e da oxigenação e da colheita de amostras por toda parte. Ajuste o pH se por adição de bicarbonato de sódio à solução de perfusão. </li><li> No final da perfusão tomar as amostras finais, enquanto o fígado é perfundido. Desligue o fígado e retirar a cânula do canal biliar. Tome 2 amostras de tecido pós-perfusão doducto biliar, tal como descrito antes, para armazenamento a -80 ° C e em 10% de formalina tamponada. </li><li> Descartar o fígado humano seguindo orientações de material biológico adequado. </li></ol>

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</ol>

Drs. SER Uygun, K Uygun e Yarmush são inventores sobre a patente pendente que é relevante para este estudo (WO / 2011/002926), e os Drs. SER Uygun, K Uygun e Yarmush são inventores sobre a patente pendente que é relevante para este estudo (WO / 2011/35223). Drs. K Uygun e Bruinsma ter um pedido provisório de patente relacionada a este trabalho. Dr. K Uygun e BE Uygun têm um interesse financeiro em órgão Solutions, uma empresa focada no desenvolvimento de tecnologia de preservação de órgãos. Dr. K Uygun e BE interesses da uygun são geridos pelo MGH and Partners HealthCare, de acordo com o seu conflito de políticas de juros.

Em uma tentativa de recuperar fígados feridos durante a isquemia, desenvolvemos um sistema SNMP que pode ser empregada após um período de armazenamento refrigerado. Máquina de perfusão Subnormothermic oferece uma alternativa viável para o armazenamento refrigerado convencional, assim como as modalidades de perfusão máquina hipotérmicos e normotérmicas. Existem vários sistemas diferentes; todos oferecem diferentes vantagens e desvantagens 3,9,20. SNMP permite a perfusão sem uma transportadora de oxigênio, como demanda de oxigênio metabólicas em 21 ° C são atendidas por oxigenação ativa do perfusato. Embora reduzido em condições subnormothermic, o metabolismo é substancial e requer o apoio de uma solução de perfusão rico em nutrientes. Soluções para perfusão tradicionais, tais como a solução de perfusão máquina Belzer, são geralmente mínima na composição e são projetados para perfusão frio. Williams Meio E tem sido utilizado como um meio de cultura de hepatócitos por muitos anos, e contém componentes que são universais para suportar a função celular, em especial no âmbito ex vivo condições quentes. As medições efectuadas durante a perfusão máquina são o reflexo da função do órgão. Parâmetros diretamente observáveis, como a produção de bílis e consumo de oxigênio são medições em tempo real que podem ser usados ​​para avaliar a pré-transplante de fígado. Similarmente, os marcadores de isquemia e lesão celular (K +, libertação de lactato) pode ser medida directamente na solução de perfusão e pode ser indicativo de função do órgão 20. Como a tecnologia de máquina de perfusão desenvolve e atinge aplicação clínica mais ampla, as correlações precisas entre ex vivo função e evolução clínica pode ser feito e parâmetros de perfusão será útil em ajudar decisões para transplante ou rejeitam fígados marginal qualidade. Além disso, como ponto-de ferramentas analíticas cuidados de antecedência, a análise mais sofisticada ficará disponível diretamente durante máquina perfusion 21. Neste trabalho, mostramos que os fígados podem ser suportados no sistema SNMP com lesão mínima para o fígado, refletida pela histologia e liberação de ALT. A recuperação funcional do fígado é melhor reflectida pela ATP, o que foi mostrado para correlacionar a viabilidade fígado e é fortemente sugestiva de sucesso do transplante em modelos animais 22. Ex vivo e recuperação de pré-transplante de enxertos de fígado iria permitir uma expansão significativa do dador piscina fígado, corrigir a disparidade entre a oferta e demanda de fígados de doadores no transplante.

O transplante de fígado é o único tratamento curativo para dezenas de milhares de pacientes que sofrem de estágio final da doença hepática. Para facilitar o transplante bem sucedido, preservação óptima do fígado a partir do momento em que é obtido a partir do dador, até o momento em que são implantadas no receptor é necessário para evitar a deterioração rápida do enxerto. A norma actual para preservação fígado é denominado «armazenamento frio estático &#39;: o fígado é arrefecida numa solução de preservação gelada, reduzindo, assim, o metabolismo do fígado e abrandar os efeitos deletérios da isquemia. Embora esta técnica de armazenamento a frio tem permitido para transplante bem-sucedido, os órgãos de qualidade marginal, como órgãos DCD danificadas por isquemia quente ou esteatose mostra paciente inferior resultados 1. Há um corpo em rápida expansão de evidências de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado como uma modalidade alternativa de preservação pode, potencialmente, improvar os resultados para esses órgãos marginais 2,3. O transplante de fígado tornou-se vítima do seu próprio sucesso. Far mais pacientes são encaminhados para transplante do que há fígados disponíveis, e milhares morrem na lista de espera nos Estados Unidos a cada ano. Dada a realidade da escassez de doadores de fígado e à crescente utilização de enxertos de fígado de qualidade abaixo do ideal para os destinatários carentes, é amplamente difundida de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado antes da implantação mantém a promessa de uma mudança de paradigma no transplante de fígado. Houve um aumento acentuado no interesse em pesquisas sobre este tema nos últimos anos 08/04. Em vários centros europeus e norte-americanos máquina de perfusão hipotérmica fez uma introdução 8 e normotérmica perfusão clínica máquina a temperaturas fisiológicas foi recentemente aplicada aos fígados humanos descartados e está sendo traduzido para o uso clínico, bem 9.Extenso desenvolvimento conduziu ao desenvolvimento de vários protocolos, enquanto a optimização contínua identifica a perfusão óptima parâmetros 10-12. O uso de enxertos marginal de qualidade aumentou mais de 10 vezes ao longo da última década 13. Quando comparado com o padrão atual para a preservação do fígado (armazenamento a frio estático), ex vivo máquina de perfusão proporciona inúmeros benefícios potenciais, os quais resultam em expansão muito necessária para a piscina do órgão e um potencial diminuição na incidência de complicações pós-transplante. Em particular, as complicações biliares que atualmente afligem enxertos hepáticos abaixo do ideal de qualidade após o transplante continuam a ser um problema substancial 14-18. Máquina de perfusão em condições subnormothermic fornece uma janela de tempo para avaliar a função do enxerto objetivamente como a aptidão para o transplante de 19. Enquanto o fígado está a ser perfundido num circuito ex vivo, tanto a um perfusadond a bile produzida durante a perfusão podem ser degustados para medição de marcadores de função do órgão. Desta forma &quot;gravemente comprometida&quot; fígados que são descartados para transplante de acordo com os critérios atuais podem ser objetivamente avaliados quanto à sua adequação para transplante. Avaliação da viabilidade permite potencialmente que para muitos destes órgãos a serem utilizadas para o transplante. Um igualmente poderoso benefício da máquina de perfusão é o reparo e melhoria de fígados que foram danificados por isquemia quente / frio. ATP está esgotado muito rapidamente durante a isquemia fria quente e posterior e pode ser repleted durante um período de máquina de perfusão antes da implantação do fígado 20. O fígado, com suas reservas de energia e estado metabólico reabastecido, está pré-condicionado e melhor preparados para os efeitos prejudiciais de lesão de reperfusão após o implante no receptor. Este trabalho descreve um método de máquina de perfusão ex vivo de fígado humano grafts em laboratório, o que será útil para pesquisadores que desejam estudar tanto a técnica e os efeitos benéficos do ex vivo máquina de perfusão. Nós fazemos uso de fígados de doadores humanos que tenham sido recusados ​​para o transplante e depois são alocados para fins de investigação. Norma técnica procurement fígado envolve em resplendor arterial situ do fígado após o pinçamento no cérebro doadores mortos (DBD) ou após a parada circulatória em doadores circulatórios morte (DCD), descritos em mais detalhes em outro lugar 20. Além disso, o fígado é resfriado durante a aquisição através do preenchimento da cavidade abdominal do doador com gelo. Lavar as preferências soluções variar entre regiões, com a maioria dos processos de aquisições utilizando a Universidade de solução de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK) ou Wisconsin. Uma descarga adicional back-mesa da veia portal melhora a lavagem de sangue residual. Os fígados são muitas vezes adquiridos no deixando um segmento de aorta surarredondamento do tronco celíaco. A vesícula biliar é entalhada, bile é aspirado, e do ducto biliar é liberado. Os fígados são embalados em sacos estéreis contendo solução de conservação gelada e transportados em caixas designadas ou refrigeradores. Para obter resultados representativos tempo de isquemia quente e frio deve ser limitado a 60 minutos e 12 horas, respectivamente. Apesar de triagem sorológica de rotina para patógenos transmissíveis, devem ser tomadas precauções padrão quando da entrega órgãos humanos, as amostras obtidas a partir de órgãos humanos, e quaisquer produtos residuais. O protocolo aqui descreve máquina de perfusão subnormothermic utilizando um dispositivo de perfusão do fígado disponível comercialmente. O uso de tal dispositivo permite mais rápida tradução para o contexto clínico e validação cruzada de diferentes protocolos e configurações do dispositivo, entre grupos de pesquisa e centros de transplante.

<table><tbody><tr><td>Dispositivo de perfusão Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Conjunto</td> descartável Liver Assist <td></td></tr><tr><td>Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Williams descartável</td><td></td>Liver Assist</tr><tr><td> Médio E Sigma</td><td></td><td>W1878&ndash; 6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>de insulina</td><td>Eli Lilly & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 5.000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>MGH farmácia</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de gás Carbogen 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de gás especial</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactato Ringer' s solução</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% de formalina tamponada neutra</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Adson dentada</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de tecido Debakey, 7,75", 2,25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Metzenbaum 7" Curvada SureCut Tungstênio</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas Castroviejo 5.5&ndash; 7"</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 suturas de seda trançadas pretas Sutura</td> de nylon <td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de análise de gases sanguíneos</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Balança</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de exibição de pressão</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de exibição de pressão descartáveis</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro e sonda termopar portátil</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 e EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Cânula de vaso com ponta de bolota, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de irrigação tubo de descarga</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Tigela de mistura, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

fígado preservação human funcional e cobrança através de subnormothermic máquina de perfusão

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Atualmente, há uma grave escassez de enxertos de fígado disponíveis para transplante. Novas técnicas de preservação de órgãos são necessárias para expandir o pool de fígados de doadores. A perfusão por máquina de enxertos de fígado de doadores é uma alternativa ao armazenamento refrigerado tradicional de fígados e é muito promissora como uma modalidade para expandir o pool de órgãos de doadores. Descrevemos recentemente o benefício potencial da perfusão subnormotérmica de fígados humanos. Os fígados perfundidos em máquina apresentaram melhora da função e restauração dos níveis de ATP tecidual. Além disso, a perfusão mecânica de enxertos hepáticos em temperaturas subnormotérmicas permite a avaliação objetiva da funcionalidade e adequação de um fígado para transplante. Dessa forma, muitos fígados que antes eram descartados devido à sua qualidade abaixo do ideal podem ser resgatados por meio dos efeitos restauradores da perfusão por máquina e utilizados para transplante. Aqui descrevemos essa técnica de perfusão subnormotérmica em detalhes. Os enxertos de fígado humano alocados para pesquisa são perfundidos através da artéria hepática e veia porta com um perfusato oxigenado acelular a 21 °C.

Uma série de observações e análises podem ser executadas no fígado durante a perfusão, incluindo observações directas tempo real, tais como as taxas de fluxo e a produção de bílis; medições em tempo real, tais como análise de gases do perfusato, e as medidas pós-hoc que são feitas após a coleta da amostra, incluindo a análise bioquímica do perfusato e tecido e análise histológica. Os resultados mencionados aqui são de 22 fígados humanos perfundidos. Os fígados foram rejeitados para transplante, por várias razões, incluindo a idade do doador, tempo de isquemia quente excessiva, os resultados da biópsia (esteatose, inflamação, fibrose) e por razões logísticas. 18 fígados foram adquiridos após a morte cardíaca, e 4, após a morte encefálica. Em ambos os casos, os dadores foram pré-tratados com 30.000 unidades de heparina e lavado in situ e na tabela da volta com uma solução de UW. Tempo de isquemia fria foi em média de 531 ± 237 (SD) min e o tempo de isquemia quente média foi de 27 ± 10 (SD) min, medido a partir de retirada da vidaapoio ao rubor frio. Observações e medições em tempo real pode ser utilizado para avaliar o fígado durante a perfusão, enquanto que as medições pós-hoc são reveladas após a perfusão. Observações em tempo real Fluxo através do fígado começa inferiores às taxas de fluxo alvo, como um resultado de uma resistência mais elevada no fígado frio. Utilizando uma pressão de 3 mm Hg sobre o PV e 30 mmHg sobre a HA os fluxos alvo podem geralmente ser obtidos uma vez que o fígado tenha sido aquecida até 21 &#160; ° C após 60 minutos de perfusão (Figura 1A). O fluxo biliar geralmente pode ser observado dentro de 10 min de perfusão e é produzido de forma constante durante a perfusão (Figura 1B). Bile quantidade depende da qualidade do fígado e varia de 0,3 ml / h / kg de fígado a 18 ml / min / kg. Em fígados com tempo de isquemia quente por mais tempo, o fluxo biliar tenderá a desaparecer, enquanto mais curtos quentes isquêmicos tempo resulta em um mais estável ou até mesmo aumentarprodução de bile. As medições do tempo real A medição direta e freqüente do perfusato por gasometria no essencial, tanto para fins experimentais, bem como a manutenção de condições de perfusão adequada, importante oxigenação e pH. A pressão parcial de oxigénio dissolvido deve ser superior a 700 mmHg, no fluxo, tanto da PV e HA. Pressão de oxigênio Vazão, medido na veia cava, geralmente diminui com o tempo de perfusão, refletindo um aumento de consumo de oxigênio. As taxas de captação de oxigénio pode ser calculada tal como descrito anteriormente e 13 variou 0,5-2,2 ml de O 2 / min / kg no início da perfusão de 2,4-9,7 ml de O 2 / min / kg em t = 3 horas (Figura 1C). A queda no pH é observado nos primeiros 30 min (Figura 1D), principalmente como um resultado da libertação de lactato no perfusado. Isto pode ser apoiado por suplementação com bicarbo de sódio a 8,4%nate e depois de cerca de 90 min o pH cai para trás na faixa normal. Comumente, 30-50 mL de bicarbonato de sódio a 8,4% é necessário. Aumento da concentração de lactato rapidamente na primeira 15-30 min, mas começa a falecimento após a primeira hora (Figura 1E). Medições Post-hoc Transaminases hepáticas, tais como ALT pode ser medido no perfusado. Nos primeiros 30 min de um grande aumento dos níveis de ALT é geralmente observado que reflecte a lavagem de ALT que foi lançado durante a isquemia (Figura 1F). ALT mostrou boa correlação com o tempo de isquemia quente 13. Máquina de perfusão aumentou o teor de ATP 2,8 vezes, refletindo um estado de energia de recuperação (Figura 1G). H &amp; E análise histológica revela nenhuma lesão adicional sofridos durante máquina de perfusão (Figura 1H, I). Deve notar-se que o regime de biópsia proposto no presente protocolo é a resfins earch e podem não ser aplicáveis ​​para fins clínicos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figura 1:. Avaliação de fígados humanos durante a perfusão máquina de fluxo através da PV e HA durante SNMP (A), a produção de bílis, quantificado por hora de perfusão (B), a taxa de uprate oxigénio (OUR), calculado a partir da diferença de influxo (PV + HA) e saída (veia cava), interrompeu linhas mostram pressões parciais de oxigênio na entrada e saída durante a perfusão (C), pH e lactato durante a perfusão (D, E), liberação de ALT no perfusato (F), ATP teor medido em tecido de biópsias de hora em hora (G) e H &amp; E as manchas do fígado (54 anos de idade DCD, 19 min de isquemia quente, 559 min de isquemia fria) antes de (H) e depois (I) perfusão. Os resultados são apresentados como média ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Descreve-se um método de perfusão ex vivo máquina de enxertos de fígado humano à temperatura subnormothermic (21 ° C).

Fígado Preservação Human Funcional e cobrança através de Subnormothermic Máquina de Perfusão

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma máquina de perfusão subnormotérmica, com perfusão do fígado humano para preservação, recuperação e avaliação do órgão. Em um contexto de pesquisa pré-clínica, isso é realizado primeiramente preparando o fígado para a conexão ao dispositivo. No segundo passo, o sistema de perfusão por máquina é preparado, o fígado é conectado e a perfusão é iniciada no passo final.O fígado perfundido por máquina tornar-se-á funcionalmente ativo em um estado térmico subnormal e produzirá bile. Em última análise, amostras coletadas do fígado durante a perfusão podem ser analisadas para estudar a recuperação metabólica e a função do órgão. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos de preservação existentes, como a perfusão a frio e a perfusão térmica normal, é que a perfusão subnormal por máquina permite a recuperação funcional e a avaliação da viabilidade do fígado, sem precisar atender às altas demandas metabólicas da perfusão à temperatura corporal.Muitos aspectos desta técnica exigem experiência ou uma demonstração para sua realização bem-sucedida. Por exemplo, a demonstração de como realizar o preparo na mesa cirúrgica do fígado, que inclui a dissecação da artéria, veia e ducto biliar, pode ser útil para pesquisadores sem treinamento cirúrgico prévio. Após receber o fígado, coloque uma bacia para órgãos cheia de gelo sobre uma superfície estéril coberta com campo cirúrgico e retire o fígado da caixa de transporte, mantendo-o principalmente submerso no saco contendo solução de preservação fria. Em seguida, use uma tesoura Metzenbaum para expor os diversos ramos ao longo do suprimento arterial para o fígado, desde a aorta até a artéria hepática própria.Em seguida, dissecar cuidadosamente o restante da artéria para evitar seccionar quaisquer vasos que supram o fígado, sem cortar ou ligar ramos que não tenham uma extremidade visível. Quando a artéria estiver isolada, utilizar suturas de seda de número zero a quatro zero para ligar todos os ramos arteriais que não supram o fígado. Ligar e cortar as artérias esplênica e gástrica próximas à sua origem no tronco celíaco.Corte um retalho aórtico ao redor do tronco celíaco. Em seguida, use uma cânula de perfusão arterial para canular o tronco celíaco. Agora, dissecar a veia porta livremente, ligando quaisquer ramos ou suturando furos na veia e canulando com uma cânula de perfusão da veia porta.Remova seções do diafragma da veia cava supra-hepática sem cortar a própria veia. Em seguida, corte dois segmentos de tecido de dois a três milímetros de comprimento e circunferência completa a partir da extremidade do ducto biliar comum. Os segmentos devem ser manipulados com delicadeza.Congele rapidamente uma amostra em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius e armazene a outra em formalina tamponada a 10%. Em seguida, canule o ducto biliar comum com uma cânula vascular e conecte um tubo de drenagem feito de tubo de pequeno diâmetro. A seguir, ligue o ducto cístico com um laço de seda zero.Conecte o conjunto de tubos de lavagem a bolsas de solução de Ringer lactato geladas e preencha os tubos para remover o ar. Ajuste o regulador de fluxo do tubo de lavagem para um gotejamento lento e oclua a veia porta no hilo para remover qualquer ar presente no vaso. Em seguida, encha a cânula na veia com a solução de lavagem para eliminar o ar da veia porta, tomando cuidado para não elevar a bolsa mais de 20 centímetros acima da altura do fígado, a fim de evitar pressão excessiva na veia.Em seguida, lave o fígado com um total de dois litros de solução de Ringer com lactato fria ICEC. Durante a lavagem, oclua brevemente a veia porta no ponto mais baixo para verificar vazamentos e, então, repita a lavagem para a artéria hepática com um litro da solução, conforme demonstrado anteriormente. Enquanto o fígado está sendo lavado, prepare o sistema de perfusão adicionando dois litros de solução de perfusão oito à temperatura ambiente à cuba do órgão e inicie o aparelho para escorvar a tubulação. Ajuste a temperatura para 21 graus Celsius.Em seguida, ajuste uma pressão de três milímetros de mercúrio na veia porta e 30 milímetros de mercúrio na artéria hepática. Abra o tanque de gás carbogen e ajuste-o para um fluxo de três litros por minuto. A seguir, colete uma amostra de gás sanguíneo nos pontos de coleta da veia porta e da entrada da artéria hepática, e analise as amostras no equipamento de análise de gases sanguíneos conforme as instruções do fabricante para confirmar uma oxigenação e pH adequados.Utilize bicarbonato de sódio ou ácido clorídrico para corrigir o pH conforme necessário. Em seguida, antes de conectar o fígado, colete uma amostra de um mililitro do perfusato como uma medida de tempo zero e armazene-a a 80 graus negativos Celsius. Utilize uma lâmina de aço de corte único para retirar dois fragmentos biópsicos em forma de cunha de aproximadamente 250 miligramas cada um do fígado neste momento também.Congele rapidamente uma amostra em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius e fixe a outra em formalina tamponada a 10%. Antes de iniciar a perfusão, pese o fígado, em seguida transfira o órgão para a câmara de órgãos do dispositivo e remova o ar das cânulas. Conforme acabou de ser demonstrado.Quando as cânulas estiverem prontas, conecte as entradas da veia porta e da artéria hepática às cânulas apropriadas. Inicie a perfusão garantindo que o fígado esteja submerso pela solução de perfusão, cobrindo quaisquer superfícies secas, incluindo os vasos de entrada, com gaze estéril úmida. Para prevenir desidratação, deixe o tubo biliar drenar em um recipiente de coleta.Certifique-se de que a abertura do dreno biliar esteja ao nível do fígado ou abaixo, para permitir que a bile escoe livremente. Uma vez que o fígado atinja 21 graus Celsius, direcione as taxas de fluxo para 275 a 325 e 50 a 100 mililitros por minuto por quilograma para a veia porta e artéria hepática, respectivamente. Durante a perfusão, colete amostras do tecido hepático perfundido e da bile conforme apropriado.Continue a perfusão por três horas, monitorando a pressão, o pH e a oxigenação e ajustando o pH com bicarbonato de sódio conforme necessário. Ao final da perfusão, colete as amostras finais, desconecte o fígado e remova a cânula do ducto biliar. Por fim, colete duas amostras de tecido pós-perfusão do ducto biliar conforme demonstrado anteriormente e descarte o fígado humano.Seguindo as diretrizes adequadas de descarte de resíduos biológicos. O fluxo inicia baixo em razão de uma resistência maior no fígado frio, utilizando uma pressão de três milímetros de mercúrio na veia porta e 30 milímetros de mercúrio na artéria hepática. Os fluxos-alvo geralmente podem ser alcançados assim que o fígado atinge a temperatura de 21 graus Celsius após 60 minutos de perfusão. A medição frequente do pH do perfusato por meio de análise de gases sanguíneos é essencial tanto para fins experimentais quanto para manter condições adequadas de perfusão.Por exemplo, a pressão parcial de oxigênio dissolvido deve ser maior que 700 milímetros de mercúrio na entrada tanto da veia porta quanto da artéria hepática. Já a pressão de oxigênio na saída, medida na veia cava, geralmente deve diminuir com a perfusão mais prolongada, refletindo uma captação crescente de oxigênio. As transaminases hepáticas também podem ser medidas no PERFU oito, por exemplo.Um aumento da alanina, transaminase ou de uma LT é geralmente observado nos primeiros 30 minutos da perfusão, com um aumento mínimo adicional durante o restante da perfusão. A avaliação adicional da produção de ATP em fígados submetidos à perfusão por máquina revela um aumento de 2,8 vezes no teor hepático de ATP, refletindo um estado energético em recuperação. Além disso, a análise histológica com hematoxilina e eosina revela ausência de lesões adicionais ocorridas durante o procedimento.Seguir este procedimento permite uma análise extensiva do fígado isolado, proporcionando insights únicos sobre a fisiologia e a patologia hepática. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manter um fígado humano durante a perfusão mecânica suberica para facilitar a avaliação de sua função fora do corpo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Enxertos marginais, tais como fígado gorduroso, enxertos de doadores mais velhos, ou fígados recuperados após a morte cardíaca (DCD) tolerar estática de armazenagem convencional, o frio só mal. Foi desenvolvido um novo modelo de subnormothermic ex vivo de perfusão hepática para a preservação, avaliação e reparo de enxertos de fígado marginais antes do transplante.

Técnica de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fígado de Perfusão para o armazenamento, Avaliação e Reparação de enxertos de fígado Marginal

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo ex oxigenado máquina de perfusão in situ de enxertos de doadores de fígado. Este artigo contém um passo a passo protocolo de adquirir e preparar o enxerto de fígado para a máquina de perfusão, preparar o líquido de perfusão, privilegiada a máquina de perfusão e executar oxigenado máquina de perfusão normotérmica do enxerto de fígado.

Ex Situ Normotérmica máquina de perfusão de fígados doados

Há uma escassez de doadores de fígado significativo, e expandiram-se critérios para doadores de fígado. Normotérmica ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi desenvolvido para avaliar e modificar a função do órgão. Este estudo demonstra um modelo do rato de NEVLP e testa a capacidade do peguilado-catalase, para atenuar a lesão hepática de preservação.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

O modelo suíno de perfusão normotérmica hepática (NMP), descrito aqui, pode ser usado com sucesso para estudar NMP como uma estratégia de preservação, uma ferramenta para avaliação de viabilidade e uma plataforma para reparo de órgãos. Possui um alto valor translacional, no entanto, é tecnicamente desafiador e trabalhoso.

Perfusão hepática isolada normotérmica suína

Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.

Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

Este protocolo descreve a metodologia de estabelecimento de um modelo suíno utilizando Perfusão de Máquina (MP) com temperatura controlada variável para a preservação do fígado do doador, seguido de transplante hepático ortotópico (OLTx). Tem como objetivo promover a taxa de sucesso do OLTx usando doação de doador após morte circulatória (DCD) hepática e estabelecer um modelo estável.

Preservação da Doação de Suínos após Morte Circulatória (DCD) Hepática por Perfusão e Transplante Hepático Ortotópico

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema de perfusão ex vivo normotérmico modificável e de código aberto, projetado para superar o alto custo e a flexibilidade limitada das plataformas existentes, permitindo um uso mais acessível, econômico e iterativo na pesquisa biomédica pré-clínica.

Um sistema de perfusão normotérmica de código aberto projetado para cientistas pesquisadores

Os mecanismos que levam ao desenvolvimento de hiperplasia intimal (HI) e falha do enxerto venoso ainda são pouco compreendidos. Este estudo descreve um sistema ex vivo para perfundir veias humanas sob fluxo e pressão controlados. Além disso, avaliou-se a eficiência do reforço da malha externa para limitar o desenvolvimento de IH.

Procedimento para safenas humanas Veias Ex Vivo Perfusão e reforço externo

Aqui, apresentamos um protocolo de como realizar uma perfusão hepática isolada (IHP) com melfalano e também discutimos a IHP como uma opção de tratamento para metástases hepáticas de melanoma uveal.

Isolado hepática Perfusão como um tratamento para o fígado Metástases de Uveal Melanoma

A escassez de órgãos grave resultou em aumento do uso de enxertos de rim marginais para transplante. Isso provocou interesse em métodos alternativos de armazenamento, uma vez que os enxertos marginais especialmente tolerar armazenamento a frio mal. A técnica de normothermic ex vivo de perfusão renal (NEVKP) representa um método de conservação de enxertos de rim romance antes do transplante.

Normotérmica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão rim para a Preservação do rim Os enxertos antes do transplante

Aprenda a preservação funcional e recuperação de fígados humanos por meio de perfusão mecânica subnormotérmica a 21 °C. Este método permite avaliar a viabilidade do órgão com menor demanda metabólica.

Fígado Preservação Human Funcional e cobrança através de Subnormothermic Máquina de Perfusão

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