Name: Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de Arthrobacter Bacteriophage Espécie de amostra de solo Isolados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Aprenda um protocolo de enriquecimento para isolar bacteriófagos de Arthrobacter a partir de amostras de solo. Este método otimizado permite obter resultados rápidos e reprodutíveis para pesquisas em virologia.

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O financiamento para o desenvolvimento deste protocolo foi fornecido pela Pennsylvania Consortium Sudeste do Ensino Superior e do Departamento de Ciência Cabrini College. Financiamento e apoio adicional veio da Universidade de Arcadia e Universidade Imaculada. Agradecemos especialmente ao Dr. Karen Snetselaar em St. Joseph Universidade para gentilmente tomando as imagens microscópicas de elétrons dos nossos fagos isoladas. Apoio adicional foi fornecido pelos Hunters Instituto Médico Howard Hughes Educação Ciência Alliance fagos Avançando Genomics e Evolutiva Ciência programa (SEA-fagos).

1. Preparação de células Arthobacter para Fago Isolation <ul><li> Cultura de Arthrobacter sp. KY3901 colónias riscadas em um Bertaini Luria (LB) agar placa incubada a 30 ° C durante 2-3 dias. Escolha uma colónia e usar uma ansa estéril para adicioná-lo a 250 ml de caldo LB num frasco de cultura com chicanas e incubar numa incubadora com agitação a 225 rpm a 30 ° C. </li><li> Reserve em torno de 24 horas de crescimento para obter células estacionárias exponenciais / início de final de fase para experimentos de infecção fago. Monitorar o estado de crescimento bacteriano de perto para evitar que as células de entrar no meio para o final estado estacionário de crescimento. NOTA: O crescimento celular deve consistir de uma densidade óptica OD 600 entre 0,5-.0.7 para os procedimentos de isolamento e purificação de fago / passos descritos abaixo. </li></ul> 2. Recolha de Fago de amostras de solo <ol><li> Reúna 200-400 g de solo do local desejado. Nota: Uma vez que as bactérias no ArthrobaCTER género são bactérias comuns do solo e que os fagos que eles infectam pode ser encontrado em e são difundidas na maior parte dos tipos de solo. </li><li> Adicionar, pelo menos, 400 ml de tampão de fagos (PB) [NaCl 68 mM, 10 mM de MgSO 4, 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5)] para o solo e misturar num frasco grande o suficiente para que, pelo menos, 200 ml de PB é no sobrenadante e é capaz de ser extraído. </li><li> Misture por agitação ou rodando suavemente até que o solo está suspenso e permitir que os sedimentos do solo para resolver, tipicamente 30 min. </li><li> Passe o &quot;extrato de solo&quot; por papel de filtro por filtração por gravidade para remover os restos de sedimentos do solo. </li><li> Adicionar LB pó e misturar para fazer uma solução a 2% (4 g LB pó em 200 ml de extracto de solo). </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um por filtração em vácuo para se obter um filtrado estéril. Se possível, continue no passo 2.7 imediatamente. Caso seja necessário, armazenar as amostras filtradas a 4 ° C durante até uma semana antes de continuar, no entanto, o número de partículas fágicas viáveisserá reduzido. </li><li> Múltipla alíquota de 50 ml da mistura de extrato de LB / solo esterilizado por filtração em individuais de 250 ml esterilizadas tremendo frascos de cultura perplexos usando técnicas assépticas. Adicionar estéril M de CaCl2 solução 2,0 para as concentrações finais pretendidas (0-50 mM) uma vez que diferentes fagos de Arthrobacter crescem optimamente sob diferentes condições de CaCl 2. NOTA: Descobrimos que a maioria dos fagos Arthrobacter identificados por nós estão dentro da gama de 1 mM-2,5 mM de CaCl2. No entanto, vários dos fagos isolados cresceram nos exclusivamente a 0 mM CaCl2 .ou a concentrações muito elevadas de CaCl 2. Prossiga imediatamente para a etapa 3.1. </li></ol> 3. Fago Isolation <ol><li> Adicionar 1 a 2,5 ml de exponencial tardia / estacionária antecipada bactérias em fase de cultura para cada um dos frascos. Para uma DO600 0,5-0,7, utilizar 1 ml de células. Para uma DO600 superior a uma DO de 0,7 2,5 ml de usarcélulas. NOTA: As células em fase de crescimento exponencial normalmente produzem mais fagos e títulos mais elevados do que as células em crescimento fase estacionária. </li><li> Frascos de agitação a 250 rpm a 30 ° C durante aproximadamente 24 horas numa incubadora com agitação. </li><li> Após um período de incubação de 24 h remover frascos de enriquecimento da incubadora com agitação e diluir as amostras de enriquecimento de dez vezes em tampão de fago. </li><li> Configure tubos de cultura com 0,5 ml de tarde exponencial / início de bactérias em fase estacionária cultura e adicionar várias quantidades de a cultura de enriquecimento (5 mL a 500 mL de uma diluição 10 -1 em PB) para os tubos de cultura. NOTA: É aconselhável testar uma ampla gama de concentrações uma vez que cada amostra de solo gera diferentes títulos de fagos após enriquecimento. </li><li> Adicionar CaCl2 para tubos de cultura para obter uma concentração final igual à concentração presente no frasco de enriquecimento inicial. Use uma variedade de diferentes concentrações de CaCl 2 para selecionar para muitos fagos wom variando CaCl 2 dependências. NOTA: A maioria dos fagos será isolado dentro do CaCl2 gama de 1-2,5 mM mas há fagos isolados mais de forma ideal em qualquer lugar 0-50 mM de CaCl2 concentrações. Por isso, o melhor é verificar uma série de CaCl 2 concentrações de maximizar o número de Arthrobacter fagos únicas isoladas. </li><li> Misturar 4,5 ml de LB agar superior no tubo de cultura e despeje a mistura em uma placa de ágar LB. Agitar suavemente o frasco para distribuir uniformemente ao longo da placa e para permitir agar de topo solidificar durante aproximadamente 15 minutos. NOTA: Topo de agar podem ser preparadas em lotes maiores (250 ml) e agar de topo extra pode ser armazenado à temperatura ambiente e reutilizado para as experiências subsequentes, durante pelo menos duas semanas. Embora existam diferentes fórmulas utilizadas para fazer agar top, fazemos top agar usando 7g / L de agar misturado com LB. Ponto de agar de topo num banho de água a 60 ° C para manter o estado líquido durante o decurso de uma experiência. </li><li> Inverter tele placa e incubar a temperatura desejada (temperatura de 30 ° C) O / N a 48 h. Alterar estas condições para otimizar os fagos presentes. Mais fagos isolados provenientes de placas incubadas a 30 ° C a 1-2,5 mM de CaCl 2 a concentração após um período de incubação de 24 horas. </li></ol> 4. Fago Purificação <ol><li> Após uma incubação de 24 horas de verificação para a formação de placas em placas. Continue incubação por até 72 horas, se não há placas são evidentes ou para determinar se as placas adicionais aparecerão. Se necessário, as placas de loja com placas putativas de até uma semana a 4 ° C antes de prosseguir. NOTA: Não é raro encontrar uma variedade de diferentes morfologias de placa em um prato. Encontrar placas após 3 dias de incubação, é possível, mas raro. </li><li> Purificar fagos desejados de placas claramente isolado utilizando o método raia placa. Toque em uma placa com uma vara de madeira estéril. Streak a placa executando uma vara de madeira através de uma chama, allowing o pau para esfriar brevemente, e, em seguida, esfregando o pau na placa de agar no movimento suave, como mostrado na Figura 1. Repita esta usando uma vara limpa para cada passagem. </li><li> Em alternativa, usar o ensaio de título de placa tradicional para isolar placas de fagos individuais. O ensaio de titulação da placa requer a utilização de mais reagentes, tais como agar LB e agar de topo LB e materiais, tais como placas de petri para o isolamento do fago de placa. Temos sido muito bem sucedida usando o método raia placa, mas é tecnicamente mais fácil isolar placas individuais utilizando o ensaio título placa. </li><li> Uma vez que a placa de agar LB é riscada pelo menos três vezes, marcar a área com a menor concentração de partículas fágicas putativas e suavemente aplicar 0,5 ml de Arthrobacter e 4,5 ml de agar de topo LB fundida (contendo a mesma concentração de cloreto de cálcio, tal como a placa-mãe ) e deixe-a espalhar uniformemente ao longo da placa. </li><li> Inverter e incubar placa O / N. Repita a placa raiatécnica para, pelo menos, três iterações para garantir uma espécie de fagos puros é isolado. Armazenar as placas a 4 ° C durante até uma semana, conforme necessário entre estrias, sem perda significativa da viabilidade do fago. </li><li> Uma vez que as placas desejadas tenham sido cultivadas e isolado na placa raia final, toque em uma placa bem isolado com uma ponta de micropipeta e suspender novamente em 100 PB ul. Serialmente dilua esta solução a 10 0 para a diluição de 10 -8, passando 20 ul da amostra em 180 ul de PB fresco. </li><li> Adicionam-se 10 ul de cada diluição de 0,5 ml de Arthrobacter crescido num tubo de cultura para 5 a 10 minutos à temperatura ambiente e placa misturando as bactérias infectadas com 4,5 ml de agar de topo LB fundida contendo a mesma concentração de CaCl2 utilizada para isolar o fago a partir da amostra original do solo. Salve todas as diluições feitas a 4 ° C até o dia seguinte. </li><li> Determinar a diluição em série fago necessária para fazer um teste padrão da web usando o título de placa tradicional comodizer. O objectivo do ensaio de titulação de placa é determinar o título de fago necessária para obter uma placa padrão de teia. Identificar uma placa padrão de teia como na maior parte isenta de bactérias, mas que contém vestígios de bactérias que ainda não tenham sido submetidas a lise por fagos. Adicionar 5 ml de tarde exponencial / início de cultura Arthrobacter estacionário a um frasco estéril cultura de 50 ml. <ol><li> Adicionar 100 ul da diluição (que deu um padrão de teia para a cultura de Arthrobacter) no frasco de cultura e permitir que os fagos para infectar as células de bactérias por 5 a 10 min a RT. Misturar com fundido de topo LB agar contendo a mesma concentração de CaCl 2 como inicialmente utilizados para identificar o fago e placa 5 ml desta mistura sobre 10 placas de LB fresco. Deixa-se solidificar e incubar as placas invertidas a 30 ° C. </li></ol></li><li> No dia seguinte, inundar as placas em forma de rede com 5 ml de PB e armazenamento de O / N a 4 ° C ou 4 horas à temperatura ambiente. </li><li> Filtra-se o lisado de fago através de um filtro de seringa de 0,22? Me armazenar a 4 ° C. Use este inventário final fago para experiências adicionais, tais como imagens de microscopia electrónica de partículas de fago, o fago de isolamento de ADN genómico para análise de enzimas de restrição e sequenciação de DNA genómico usando procedimentos padrão. Para armazenamento a longo prazo do stock de fagos, adicionar uma quantidade igual de lisato de fago de glicerol estéril em frascos pequenos para arquivamento estoque a -80 ° C. NOTA: Para aqueles que não experimentaram com estas técnicas de fagos, um grande recurso é o site www.phagesdb.org acessível online. </li></ol>

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 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram não há interesses financeiros concorrentes.

Apesar de muitas tentativas anteriores para isolar fagos capazes de infectar hospedeiros Arthrobacter, tivemos pouco sucesso utilizando procedimentos de enriquecimento padrão. O método de enriquecimento bacteriana generalizada desenvolvido e adaptado por van Twest e Kropinski 10 para enriquecer os fagos a partir de amostras ambientais continuam a base para a maioria dos procedimentos de enriquecimento. Evidências de estudos anteriores sugerem que métodos de plaqueamento direto produziram placas detec...

A onipresença de espécies Arthrobacter em ambientes de solo oferece um vasto número e diversidade de fagos capazes de serem isolados nessa espécie de bactérias hospedeiras. Bacterianas membros da família Acintobacteriaceae são o mais notável para suas vias catabólicas de degradar compostos recalcitrantes como atrazina e vários outros pesticidas e herbicidas 1,2,3. Embora a maioria das pesquisas tem sido feito utilizando estirpes ambientais de Arthrobacter, isolados clínicos deste gênero é encontrado no sangue, urina, olhos, e muitas outras fontes humanas todos exibindo heterogeneidade filogenética 4. Enquanto não há um corpo bastante extensa pesquisa sobre bactérias Arthrobacter, apenas alguns estudos relatam sobre os fagos capazes de infectar membros deste gênero diverso. Curiosamente, porém, o trabalho feito anteriormente em Arthrobacter fagos toques sobre diversos temas distintos-chave, tais como a digitação de solo &lt;em&gt; espécies Arthrobacter 5, usos industriais, com o objetivo de reduzir espuma deletéria em estações de tratamento de lamas activadas 6, e destacando o trabalho de recombinação sítio específico e genes integrase 7. Vários protocolos técnica de enriquecimento têm sido empregadas para gerar pura fago isolados em espécies Arthrobacter. Procedimentos iniciais incluem incubações de solo com agentes tóxicos adicionais como sais de nicotina por períodos de mais de um ano 8 dando origem a fagos capazes de infectar apenas A. globiformis. Estudos feitos usando solo percolados com orgânicos instáveis ​​apareceu para produzir fagos detectáveis ​​através de técnicas de ensaio de placa, omitindo períodos de incubação longos 8. Curiosamente, porém, uma técnica parecida com semeadura direta foi utilizado no passado dando origem a vários fagos enquanto continua a ter uma baixa taxa de sucesso nomeadamente pelos investigadores 5, citando estudos anteriores com baixas taxas de sucesso <saté&gt; 8. No geral, as técnicas de isolamento usados ​​no passado eram notável por ter pouca eficácia na prática, apesar das género Arthrobacter representativas do solo aeróbico mais comum isolar na natureza 4,9,, Van Twest e Kropinski 10 atuais métodos de enriquecimento para isolamento de fagos a partir da água e do solo adaptado a partir de técnicas anteriores utilizadas para enriquecer isolados bacterianos ambientais, mas estas técnicas de enriquecimento se mostrou ineficiente para isolar fagos Arthrobacter. O objectivo do método descrito aqui é mostrar &quot;prova de conceito&quot; que os métodos de enriquecimento precoces podem ser adaptados de forma consistente e eficaz isolar fagos Arthrobacter, ultrapassar os desafios técnicos anteriores, associados com o isolamento de fagos a partir deste género bacteriano.

<table><tbody><tr><td>LB Caldo em pó</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>É melhor encomendá-los em grandes quantidades.</td></tr><tr><td>Ágar Granulado</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>É melhor encomendá-los a granel.</td></tr><tr><td>Filtros de seringa de 0,22 um</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Filtros buchner de 0,22 um</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>Mais de 50 ml de líquido podem ser obtidos trocando cuidadosamente o tubo receptor.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 5 ml individuais</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>Pipetas Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml individuais</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas individuais de 25 ml Fisher</td><td></td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro qualitativo Whatman</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

uma técnica de enriquecimento aperfeiçoado para o isolamento de<em&gt; arthrobacter</em&gt; bacteriophage espécie de amostra de solo isolados

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

O isolamento de bacteriófagos de amostras ambientais tem sido realizado há décadas usando princípios estabelecidos por pioneiros em microbiologia. O isolamento de fagos que infectam hospedeiros Arthrobacter tem sido limitado, talvez devido à baixa taxa de sucesso de muitas técnicas de isolamento anteriores, resultando em um grupo sub-representado de fagos Arthrobacter disponíveis para estudo. A técnica de enriquecimento aqui descrita, ao contrário de muitas outras, utiliza um extrato filtrado livre de bactérias contaminantes como base para o crescimento de bactérias indicadoras, Arthrobactersp. KY3901, especificamente. Ao remover primeiro as bactérias do solo, os fagos alvo não são prejudicados pela competição com as bactérias nativas do solo presentes nas amostras iniciais do solo. Este método de enriquecimento resultou em dezenas de fagos únicos de vários tipos diferentes de solo e até produziu diferentes tipos de fagos a partir do mesmo isolado de amostra de solo enriquecido. O uso deste procedimento pode ser expandido para a maioria dos meios aeróbicos ricos em nutrientes para o isolamento de fagos em uma vasta diversidade de bactérias hospedeiras interessantes.

Para demonstrar reprodutibilidade da melhoria técnica de enriquecimento de fagos Arthrobacter, 30 amostras de solo diferentes foram usados ​​em diferentes momentos e locais durante a primavera eo verão de 2014. Destes 30 amostras de solo fagos Arthrobacter originais foram obtidos a partir de 22 de amostras de solo coletadas usando este enriquecimento procedimento. O processo de enriquecimento de fagos padrão originou únicas de 3 das mesmas amostras de solo. As amostras de enriquecimento podem ter um tí...

Apresentamos um protocolo de enriquecimento para o isolamento de bacteriófagos infectando bactérias do gênero Arthrobacter. Este protocolo de enriquecimento produz resultados rápidos e reprodutíveis para o isolamento e amplificação de fagos de Arthrobacter a partir de isolados de solo.

Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage Espécie de amostra de solo Isolados

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar fagos de bactérias Arthrobacter a partir de amostras de solo utilizando um protocolo de enriquecimento. Isso é realizado primeiramente coletando amostras de solo e isolando partículas de fago viáveis dos microrganismos do solo contaminantes. O segundo passo é infectar células bacterianas hospedeiras de Arthrobacter com as partículas de fago isoladas.Em seguida, células bacterianas infectadas são semeadas em placas com ágar para identificar fagos, evidenciado pela formação de placas. O passo final é purificar os fagos desejados a partir de placas claramente isoladas utilizando o método de estriação em placa. Em última análise, essa técnica de enriquecimento é otimizada para o isolamento relativamente fácil de fagos de Arthrobacter a partir da espécie Arthrobacter KY 3 9 0 1.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos de enriquecimento existentes é a adição de uma amostra de solo finamente filtrada a um cultivo puro de bactérias hospedeiras, evitando assim o crescimento de bactérias concorrentes. Embora este método tenha se mostrado eficaz para o isolamento de fagos de Arthrobacter, ele deverá ser aplicável ao isolamento de fagos de outros hospedeiros bacterianos. Tivemos inicialmente a ideia deste método ao saber que outros pesquisadores estavam tendo dificuldades para encontrar fagos de Arthrobacter.Com técnicas tradicionais de enriquecimento. Meus alunos demonstrarão as técnicas utilizadas para isolar com sucesso fagos de Arthrobacter. Células de Arthrobacter são cultivadas a partir de colônias estriadas em uma placa de ágar LB, incubadas a 30 graus Celsius por dois a três dias.Use um alça estéril para colher uma colônia e adicioná-la a 50 mililitros de caldo LB. Em um frasco de cultura com chicanas, incubar o frasco em um incubador agitador a 225 rpm a 30 graus Celsius por aproximadamente 24 horas. Para obter células em fase exponencial ou fase estacionária inicial para experimentos de infecção por fago.Monitore atentamente o estado do crescimento bacteriano para evitar que as células entrem na fase estacionária média a tardia. O OD 600 ideal para o isolamento de fagos está entre 0,5 e 0,7. Como bactérias do gênero Arthrobacter são bactérias comuns do solo, elas e os fagos que as infectam podem ser encontrados na maioria dos tipos de solo.Colete 200 a 400 gramas de solo do local desejado. Adicione pelo menos 400 mililitros de tampão para fagos ao solo em béqueres de tamanho suficientemente grande para que pelo menos 200 mililitros de tampão para fagos fiquem no sobrenadante e possam ser extraídos, misturando suavemente com agitação ou movimentos circulares até que o solo fique suspenso, e deixe o sedimento do solo decantar, normalmente por 30 minutos. Em seguida, remova os detritos do sedimento do solo passando o extrato do solo por um papel filtro por meio de filtração a vácuo.Adicione quatro gramas de pó de LB a 200 mililitros do extrato de solo filtrado e misture para obter uma solução a 2%. Passe a solução através de um filtro de 0,22 mícron por filtração a vácuo para obter um filtrado estéril. Se possível, prossiga imediatamente para o próximo passo.No entanto, se necessário, as amostras filtradas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até uma semana antes de prosseguir. Contudo, o número de partículas de fago viáveis será reduzido utilizando-se técnicas assépticas para aliquotar múltiplas porções de 50 mililitros da mistura de extrato de solo LB filtrado estéril em frascos de cultura individuais de 250 mililitros. Adicione solução estéril de cloreto de cálcio 2,0 molar aos frascos de cultura estéreis com agitação e com chapa defletora até as concentrações finais desejadas.Como diferentes fagos de Arthrobacter crescem de forma ideal sob diferentes condições de cloreto de cálcio, inicie este procedimento adicionando de um a 2,5 mililitros de cultura bacteriana em fase exponencial tardia ou estacionária inicial a cada um dos frascos contendo a mistura de extrato de solo LB esterilizada por filtração. Se a DO 600 da cultura estiver entre 0,5 e 0,7, utilize um mililitro. Se a DO 600 for superior a 0,7, utilize 2,5 mililitros.Agite os frascos a 250 RPM a 30 graus Celsius por aproximadamente 24 horas em um incubador com agitação. Após o período de incubação de 24 horas, remova os frascos de enriquecimento do incubador com agitação. Dilua as amostras de enriquecimento dez vezes em tampão de fago.Prepare tubos de cultura com 0,5 mililitros de cultura bacteriana em fase exponencial tardia ou estacionária inicial. Adicione quantidades variadas, de cinco microlitros a 500 microlitros, da cultura de enriquecimento diluída aos tubos de cultura.Adicione cloreto de cálcio aos tubos de cultura para obter uma concentração final em cinco mililitros igual à concentração presente no frasco original de enriquecimento. Utilize uma faixa de diferentes concentrações de cloreto de cálcio para selecionar diversos fagos com diferentes dependências de cloreto de cálcio. Adicione 4,5 mililitros de ágar LB superior a cada tubo de cultura e despeje a mistura em uma placa de ágar LB.Agite suavemente para distribuir uniformemente pela placa e deixe o ágar superior solidificar por aproximadamente 15 minutos. Inverta as placas e incube a 30 graus Celsius durante a noite até 48 horas. Varie os tempos de incubação para otimizar de acordo com os fagos presentes, verificando após 24 horas de incubação a formação de placas nas placas.A maioria dos fagos isolados provém de placas incubadas a 30 graus Celsius, com concentração de um a 2,5 milimolar de cloreto de cálcio, após um período de incubação de 24 horas, sendo o isolamento de fagos desejados a partir de placas claramente isoladas usando um palito de madeira a parte mais desafiadora deste procedimento. É necessária experiência técnica para espalhar suavemente as placas ao longo da placa de espiral, produzindo uma placa de esgotamento uniforme. Esterilize um palito de madeira passando-o por uma chama e deixe esfriar.Toque brevemente uma placa com o palito de madeira estéril e esfregue o palito na placa de ágar em um movimento suave conforme mostrado. Repita este procedimento usando um palito limpo para cada passagem. Após a placa de ágar LB ter sido esgotada pelo menos três vezes, marque a área com a menor concentração de partículas putativas de fago.Aplique suavemente 0,5 mililitros de arthrobacter e 4,5 mililitros de ágar superior LB fundido na área marcada e deixe espalhar uniformemente pelo platô. Deixe o ágar superior solidificar por pelo menos uma hora; quando o platô estiver solidificado, vire-o e incube durante a noite. Repita a técnica de estriação de placa por pelo menos três iterações para garantir o isolamento de uma espécie pura de fago.As placas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até uma semana, conforme necessário entre estrias, sem perda significativa da viabilidade do fago. Uma vez que as placas desejadas tenham crescido e sido isoladas na placa final de estriação, toque uma placa bem isolada com a ponteira de uma micropipeta e re-suspenda em 100 microlitros de tampão de fago. Dilua seriamente esta solução até a diluição de 10 elevado a menos oito, transferindo 20 microlitros da amostra para 180 microlitros de tampão de fago fresco. Adicione 10 microlitros de cada diluição a 0,5 mililitros de *Arthrobacter* cultivado em um tubo de cultura, durante cinco a 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, plaqueie misturando as bactérias infectadas com 4,5 mililitros de ágar superior LB fundido contendo a mesma concentração de cloreto de cálcio utilizada para isolar o fago da amostra original de solo. Incube as placas durante a noite. Guarde todas as diluições feitas a quatro graus Celsius até o dia seguinte.Determine a diluição bacteriófaga do cereal necessária para produzir um padrão em rede utilizando o ensaio tradicional de titulação em placas. Identifique uma placa com padrão em rede como sendo quase totalmente desprovida de bactérias, mas contendo restos de bactérias que ainda não foram lisadas pelos fagos. Adicione cinco mililitros de cultura de Arthrobacter em fase exponencial tardia ou estacionária inicial a um frasco de cultura estéril de 50 mililitros.Adicione 100 microlitros da diluição que apresentou um padrão em teia à cultura de arthrobacter e deixe os fagos infectarem as células bacterianas por cinco a dez minutos. À temperatura ambiente, adicione ao frasco o agar lb superior fundido contendo a mesma concentração de cloreto de cálcio utilizada inicialmente para identificar a placa de fago. Espalhe cinco mililitros dessa mistura sobre cada uma das 10 placas frescas de LB.Após permitir que o agar superior solidifique, inverta as placas e incube-as a 30 graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Inunde as placas com o padrão em rede com cinco mililitros de tampão de fago por placa e armazene durante a noite a quatro graus Celsius. Filtre o lisado de fago através de um filtro de seringa de 0,22 mícron. Armazene este estoque final de fago a quatro graus Celsius para armazenamento de longo prazo.Adicione uma quantidade igual do lisado de fago a glicerol estéril em pequenos frascos para arquivamento de estoque a menos 80 graus Celsius. No procedimento de enriquecimento demonstrado neste vídeo, o método de estria de placa para isolamento de populações puras de fagos após enriquecimento inicial e plaqueamento em ágar LB, os resultados mostrados são representativos do isolamento de placas para o fago DI em temperatura ambiente, 30 graus Celsius e 37 graus Celsius. Os círculos vermelhos em duas das placas delimitam placas claramente isoladas. O fago Dylan produz placas semelhantes em três temperaturas diferentes.Alternativamente, um ensaio tradicional de titulação por placas pode ser utilizado para isolar um clone puro de fago. Este ensaio foi usado aqui para determinar empiricamente os números de título de fago e o número de unidades formadoras de placas necessárias para formar um padrão de trama em uma placa. Um conjunto de diluições seriadas para o fago banana é apresentado, juntamente com um exemplo de como deve ser a aparência de um bom padrão em trama.Essas são imagens micrográficas eletrônicas de 20 fagos de Arthrobacter isolados utilizando a técnica de enriquecimento. Dos 25 fagos atualmente isolados, 23 deles são vírus cifo com caudas relativamente longas. Dois dos fagos isolados são vírus mío que contêm diâmetros da cabeça semelhantes em comprimento ao de suas caudas.Uma vez dominada, a placa de enriquecimento deverá permitir o isolamento bem-sucedido de fagos de Arthrobacter a partir de diversas amostras de solo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar fagos utilizando o método de esgotamento em ágar a partir de uma amostra ambiental de solo.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Fonte: Watson, D. C., et.al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de vesículas extracelulares (EVs) derivadas da membrana externa de bactérias geneticamente modificadas. O processo envolve a cultura das bactérias para liberar EVs, seguido por etapas sequenciais de centrifugação e filtração para remover células e detritos. Finalmente, a ultrafiltração é usada...

Isolamento e Enriquecimento de Vesículas Extracelulares Derivadas da Membrana Externa de Bactérias

Fonte: Cross, T., et al., Uma Técnica de Enriquecimento Otimizada para o Isolamento de Espécies de Bacteriófagos de Arthrobacter a partir de Isolados de Amostras de Solo. J. Vis. Exp.(2015)Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura bacteriana para a produção de bacteriófagos. Ele cobre as etapas de inoculação de uma bactéria do solo em um frasco com defletor, promovendo crescimento uniforme por aeração e agitação, e monitorando a densidade celular usando medições ópticas de densidade.

Preparando uma Cultura Bacteriana do Solo para Infecção por Bacteriófagos

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

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