Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de Arthrobacter Bacteriophage Espécie de amostra de solo Isolados

O objetivo geral deste procedimento é isolar as fases da bactéria arthrobacter de amostras de solo usando um protocolo de enriquecimento. Isso é feito primeiro coletando amostras de solo e isolando partículas de fagos viáveis de microrganismos contaminantes do solo. O segundo passo é infectar as células bacterianas arthrobacter do hospedeiro com as partículas de fago isoladas.

Em seguida, as células bacterianas infectadas são plaqueadas em placas helicoidais para identificar o fago, conforme evidenciado pela formação de placas. A etapa final é purificar os fagos desejados de placas claramente isoladas usando o método da placa de listra. Em última análise, esta técnica de enriquecimento é otimizada para o isolamento relativamente fácil de fagos de arthrobacter de espécies de arthrobacter KY 3 9 0 1.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos de enriquecimento existentes é a adição de uma amostra de solo finamente filtrada a uma cultura pura de bactérias hospedeiras para evitar o crescimento de bactérias concorrentes. Embora este método tenha se mostrado eficaz para o isolamento de fagos arthrobacter, ele deve ser aplicável para o isolamento de fagos de outras bactérias hospedeiras. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando soubemos que outros pesquisadores estavam tendo dificuldade em encontrar fagos de arthrobacter.

Com técnicas tradicionais de enriquecimento. Meus alunos demonstrarão as técnicas usadas para isolar com sucesso os fagos arthrobacter. As células de Arthrobacter são cultivadas a partir de colônias listradas em uma placa de trado LB, incubadas a 30 graus Celsius por dois a três dias.

Use um laço estéril para escolher uma colônia e adicione-a a 50 mililitros de caldo. Em uma cultura perplexa, o frasco incuba o frasco em uma incubadora agitada a 225 RPM a 30 graus Celsius por aproximadamente 24 horas. Obter células de fase estacionária exponencial ou precoce para experimentos de infecção por fagos.

Monitore o estado de crescimento bacteriano de perto para evitar que as células entrem no crescimento estacionário médio ou tardio. Estado. O OD 600 ideal para isolamento de fagos está entre 0,5 e 0,7. Como as bactérias do gênero arthrobacter são bactérias comuns do solo, elas e os fagos que as infectam podem ser encontrados na maioria dos tipos de solo.

Reúna 200 a 400 gramas de solo do local desejado. Adicione pelo menos 400 mililitros de tampão de fago ao solo em copos grandes o suficiente para que pelo menos 200 mililitros de tampão de fago estejam no sobrenadante e possam ser extraídos misturados mexendo suavemente ou girando até que o solo esteja suspenso e permita que o sedimento do solo assente normalmente por 30 minutos. Em seguida, remova os detritos de sedimentos do solo passando o extrato do solo por um papel de filtro por filtração a vácuo.

Adicione quatro gramas de LB em pó a 200 mililitros do extrato de solo filtrado e misture para fazer uma solução a 2%. Passe a solução por um filtro de 0,22 mícron por filtração a vácuo para obter um filtrado estéril. Se possível, continue para a próxima etapa imediatamente.

No entanto, se necessário, as amostras filtradas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até uma semana antes de prosseguir. No entanto, o número de partículas de fagos viáveis será reduzido usando como técnicas sépticas alíquotas múltiplas porções de 50 mililitros da mistura de extrato de solo LB esterilizada por filtro em 250 mililitros individuais. Frascos de cultura esterilizados, agitados e defletores adicionam solução estéril de cloreto de cálcio molar 2,0 às concentrações finais desejadas.

Uma vez que diferentes fagos de arthrobacter crescem de maneira ideal sob diferentes condições de cloreto de cálcio, inicie este procedimento adicionando um a 2,5 mililitros de cultura de bactérias de fase exponencial tardia ou estacionária inicial a cada um dos frascos contendo mistura de extrato de solo LB esterilizado por filtro. Se o OD 600 da cultura for de 0,5 a 0,7, use um mililitro. Se o OD 600 for superior a 0,7, use 2,5 mililitros.

Agitar os frascos a 250 rpm a 30 graus Celsius durante cerca de 24 horas numa incubadora agitável. Após o período de incubação de 24 horas, retirar os frascos de enriquecimento da incubadora agitada. Diluir as amostras de enriquecimento dez vezes em tampão de fago.

Configure tubos de cultura com 0,5 mililitros de exponencial tardio ou estacionário inicial. Cultura de bactérias em fase. Adicione várias quantidades de cinco microlitros a 500 microlitros da cultura de enriquecimento diluída aos tubos de cultura.

Adicionar cloreto de cálcio aos tubos de cultura para perfazer uma concentração final em cinco mililitros igual à concentração presente no balão de enriquecimento original. Use uma variedade de diferentes concentrações de cloreto de cálcio para selecionar muitos fagos com dependências variadas de cloreto de cálcio. Adicione 4,5 mililitros de broca superior LB a cada tubo de cultura e despeje a mistura em uma placa de broca LB.

Agite suavemente para distribuir uniformemente pela placa e deixe a broca superior solidificar por aproximadamente 15 minutos. Inverta as placas e incube a 30 graus Celsius durante a noite para 48 horas. Varie os tempos de incubação para otimizar os fagos presentes após uma incubação de 24 horas, verifique a formação de placas nas placas.

A maioria dos fagos isolados vem de placas incubadas a 30 graus Celsius a uma concentração milimolar de cloreto de cálcio de um a 2,5 milimolares após um período de incubação de 24 horas, purificando os fagos desejados de placas claramente isoladas usando uma vara de madeira como a parte mais desafiadora deste procedimento. É necessário conhecimento técnico para espalhar suavemente as placas pela placa helicoidal para produzir uma placa de listras uniforme. Esterilize um palito de madeira passando-o por uma chama e deixando-o esfriar.

Toque brevemente em uma placa com o bastão de madeira estéril e esfregue o bastão na placa helicoidal com movimentos suaves, conforme mostrado. Repita isso usando um bastão limpo para cada passagem. Uma vez que a placa do sem-fim LB seja listrada pelo menos três vezes, marque a área com a menor concentração de partículas de fago putativas.

Aplique suavemente 0,5 mililitros de arthrobacter e 4,5 mililitros de trado superior LB fundido na área marcada e deixe espalhar uniformemente pela placa. Deixe a broca superior solidificar por pelo menos uma hora quando a placa estiver solidificada, inverta e incuba-a durante a noite. Repita a técnica de placa estriada por pelo menos três iterações para garantir que uma espécie de fago puro seja isolada.

As placas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até uma semana, conforme necessário, entre as estrias, sem perda significativa da viabilidade do fago. Uma vez que as placas desejadas tenham sido cultivadas e isoladas na placa de estria final, toque em uma placa bem isolada com uma ponta de micropipeta e ressuspenda em 100 microlitros de tampão de fago em série Dilua esta solução para a diluição de 10 a oitavo negativo, passando 20 microlitros da amostra em 180 microlitros de tampão de fago fresco. Adicione 10 microlitros de cada diluição a 0,5 mililitros de arthrobacter cultivada em um tubo de cultura por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, coloque a placa misturando as bactérias infectadas com 4,5 mililitros de trado superior LB fundido contendo a mesma concentração de cloreto de cálcio usada para isolar o fago da amostra original do solo. Incube as placas durante a noite. Guarde toda a diluição feita a quatro graus Celsius até o dia seguinte.

Determine a diluição do cereal fago necessária para fazer um padrão de teia usando o ensaio tradicional de título de placa. Identifique uma placa de padrão de teia como desprovida de bactérias, mas contendo restos de bactérias que ainda não foram misturadas por fagos. Adicionar cinco mililitros de cultura de arthrobacter exponencial tardia ou estacionária precoce a um balão de cultura estéril de 50 mililitros.

Adicione 100 microlitros da diluição que deu um padrão de teia à cultura de arthrobacter e permita que os fagos infectem as células bacterianas por cinco a 10 minutos. À temperatura ambiente, adicione ao frasco uma broca superior de libra derretida contendo a mesma concentração de cloreto de cálcio usada para identificar inicialmente a placa de fago. Cinco mililitros desta mistura em cada uma das 10 placas LB frescas.

Depois de permitir que a broca superior solidifique, inverta e incube as placas a 30 graus Celsius durante a noite no dia seguinte, inunde as placas de padrão de teia com cinco mililitros de tampão de fago por placa e armazene durante a noite a quatro graus Celsius. Filtre o lisado de fago através de um filtro de seringa de 0,22 mícron. Armazene este estoque final de fagos a quatro graus Celsius para armazenamento a longo prazo.

Adicione uma quantidade igual de lisado de fago ao glicerol estéril em pequenos frascos para arquivamento de estoque a menos 80 graus Celsius no procedimento de enriquecimento demonstrado neste vídeo, o método de listras de placas para isolar populações de fagos puros após o enriquecimento inicial e o plaqueamento no trado LB mostrado são resultados representativos do isolamento de placas para fago DI à temperatura ambiente, 30 graus Celsius e 37 graus Celsius. Os círculos vermelhos em duas das placas circundam placas claramente isoladas. Phage Dylan produz placas semelhantes em três temperaturas diferentes.

Alternativamente, um ensaio de título de placa padrão tradicional pode ser usado para isolar um isolado de fago puro. Este ensaio foi usado aqui para determinar empiricamente o número de títulos de fagos e o número de unidades formadoras de placas para formar um padrão de teia em uma placa. Um conjunto de diluição em série para a banana do fago é mostrado com um exemplo de como um bom padrão de teia deve ser.

Estas são imagens micrográficas eletrônicas de 20 fagos arthrobacter isolados usando a técnica de enriquecimento. Dos 25 fagos atualmente isolados, 23 deles são vírus cifo com caudas bastante longas. Dois dos fagos isolados são mio vírus contendo diâmetros de cabeça semelhantes em comprimento aos de suas caudas.

Uma vez dominado, o revestimento de enriquecimento deve permitir o isolamento bem-sucedido de fagos de arthrobacter de uma variedade de amostras de solo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar o fago é usado no método de pintura de listras a partir de uma amostra de solo ambiental.