Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

O objetivo geral deste procedimento é medir os fluxos iônicos extracelulares in vivo utilizando a técnica de microeletrodos autoreferentes seletivos a íons. Isso é realizado primeiramente montando os microeletrodos seletivos a íons e o microeletrodo de referência. O segundo passo é calibrar e validar os microeletrodos autoreferentes seletivos a íons.

Em seguida, as medições do fluxo iônico específico são realizadas na amostra biológica na forma de gravações de voltagem. Por fim, a gravação de voltagem é convertida em fluxo iônico. Em última análise, esta técnica permite a medição precisa e não invasiva de fluxos iônicos extracelulares específicos em células ou tecidos vivos.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em fisiologia e envelhecimento, bem como em regeneração ou patologia. Por exemplo, este método permite a identificação de fluxos iônicos específicos, que controlam processos biológicos como o crescimento, a morfogênese tecidual ou a diferenciação. Demonstrará este procedimento o Dr. Gim Ardi, pós-doutorando do laboratório do Dr. Benjas. Antes da montagem para calibração do eletrodo, monte um eletrodo seletivo para íons pré-preenchido em um suporte para microeletrodos equipado com um conector macho de ouro de um milímetro e um fio de prata revestido com cloreto de prata.

Em seguida, fixe o porta-eletrodo microscópico a um posicionador microeletrônico controlado por computador de três eixos. O eletrodo seletivo a íons deve conter previamente o eletrólito e a solução de coquetel de íons específica para os íons de interesse. Após a montagem, o eletrodo deve ser imerso em uma solução contendo um milimolar de cloreto de potássio.

Além disso, monte o eletrodo de referência em um suporte reto para microeletrodos contendo uma solução salina de três mols em ágar, um pellet de prata revestido com cloreto de prata e um conector macho de ouro de dois milímetros para o eletrodo de referência. A escolha da solução salina depende das espécies iônicas a serem medidas. Após preparar o eletrodo de referência, fixe o suporte do eletrodo a um microposicionador manual que está previamente montado em um suporte magnético.

Uma vez montado, o eletrodo deve ser imerso em uma solução contendo um milimolar de cloreto de potássio. Antes de iniciar, o conjunto do eletrodo iônico seletivo deve ter preparado uma série de diluição de padrões eletrolíticos para calibração contendo os íons de interesse. Por exemplo, se cátions potássio devem ser detectados em uma concentração fisiológica de cerca de um milimolar, prepare uma série de três ordens de grandeza de soluções de cloreto de potássio nas concentrações de dez, um e 0,1 milimolar.

Isso maximiza a faixa dinâmica de detecção exigida pelo ensaio. Para calibrar o eletrodo seletivo por íons, comece imergindo ambos os eletrodos, o seletivo por íons e o de referência, na solução de calibração de menor concentração, neste caso, 0,1 milimolar. Após um breve período de estabilização de um a três minutos em temperatura ambiente, meça e registre a tensão em estado estacionário.

Repita as medições de tensão para os demais padrões de calibração, plotando as tensões medidas contra o logaritmo das concentrações iônicas molares. Para cada solução-padrão, aplique regressão linear para determinar o coeficiente angular, o intercepto e o valor de R² da curva de calibração. Para calcular o coeficiente angular de Nernst, lembre-se de dividir as tensões medidas pelo ganho total do amplificador de tensão.

Para demonstrar o protocolo de medição, o fluxo de íons potássio de um oócito de rã perfurado será caracterizado utilizando um microeletrodo sensível ao potássio. Antes de iniciar a montagem do eletrodo seletivo a íons, corte um pedaço de um centímetro de um malha de náilon de 800 mícrons e cole-o a uma placa de Petri de plástico. Além disso, prepare previamente a solução de Ringer modificada de Mark com a seguinte formulação: 100 milimolar de cloreto de sódio, dois milimolar de cloreto de potássio, dois milimolar de cloreto de cálcio, um milimolar de cloreto de magnésio e cinco milimolar de HEPES. Ajuste o pH do tampão para 7,5 com hidróxido de sódio e adicione uma alíquota do tampão preparado à placa de Petri.

Coloque cuidadosamente o citoplasma do sapo, o eletrodo seletivo a íons e o eletrodo de referência na placa de Petri. Em seguida, perfure o citoplasma e acione o microposicionador, de modo que o eletrodo seletivo a íons fique a cerca de 10 micrômetros de distância da amostra. Em termos de nomenclatura, a distância atual entre a amostra e o eletrodo será denominada posição próxima.

Em seguida, acione o microposicionador de modo que o eletrodo seletivo de íons percorra periodicamente da posição próxima de 10 mícrons até uma posição mais distante de 100 mícrons, e depois retorne à posição próxima a uma frequência de 0,3 hertz, ou seja, três trajetos completos a cada 10 segundos. Durante a atuação do microposicionador, verifique se o movimento do eletrodo é verdadeiramente perpendicular à superfície tangencial lesionada do citócito, e ative o software de medição e registro de tensão. O microposicionador é programado para pausar brevemente nas posições próxima e distante enquanto os dados de tensão são coletados.

Os dados são registrados continuamente durante a cicatrização de feridas em ovócitos, o que leva cerca de 15 minutos em experimentos mais longos, como na observação de processos ao longo de vários dias durante medições da regeneração da cauda de girinos de opus, sendo os dados registrados por dois minutos em diferentes pontos temporais. Por exemplo, 1, 3, 6, 12 e 24 horas. Após a conclusão do experimento, extraia os dados de tensão como um arquivo de texto e copie os valores em uma planilha.

Utilize a curva de calibração previamente determinada para converter os valores de voltagem medidos em suas concentrações iônicas correspondentes. Represente graficamente as concentrações iônicas extrapoladas em função da distância em relação à amostra biológica. Por fim, calcule o fluxo iônico utilizando a lei fixa de difusão.

Onde C é a concentração de íons na solução, MU é a mobilidade iônica e DC DX é a diferença de concentração ao longo da distância dx. Antes da experimentação biológica, o valor do intercepto da inclinação do NER e toda a curva de calibração do eletrodo seletivo a íons podem ser validados contra um gradiente iônico artificial gerado a partir de uma fonte iônica de um molar colocada em uma placa de Petri. Quando as alterações nas concentrações de íons de potássio são representadas graficamente a uma distância próxima ou distante do local da ferida em annu.

Os dados sugerem que um evento maciço de fluxo de potássio ocorre no início da lesão celular, e à medida que a cicatrização progride, o fluxo de potássio diminui gradualmente até retornar aos níveis de repouso após 15 minutos, quando a lesão está completamente cicatrizada. Além disso, quando as concentrações medidas de íons potássio são convertidas em fluxo iônico, o aumento súbito e a diminuição gradual do fluxo de potássio após a lesão parecem representar um efeito estatisticamente significativo quando comparado a um oócito controle intacto. Após este procedimento, outros métodos, como a marcação fluorescente de bioeletricidade, podem ser realizados para responder questões adicionais sobre as características dos fluxos iônicos intercelulares e subcelulares.