Name: Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a medir fluxos iônicos extracelulares in vivo usando microeletrodos íon-seletivos de auto-referência. Esta técnica não invasiva permite avaliar dinâmicas iônicas em células e tecidos vivos com precisão.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation grant MCB-0951199, e em parte pela bolsa NIH EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grant RB1-01417 e pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. íon-seletivo de auto-referência microeletrodos Preparação <ol><li> Preparação de microeléctrodos selectivo de iões <ol><li> Calor puxar finas capilares de borosilicato murados sem filamentos (diâmetro externo 1,5 milímetros, 1,12 mm de diâmetro interno), utilizando um extrator de microeletrodos. Nota: Isto dá dicas de 3-4 m de diâmetro. Dicas menores têm maior resistência que torna mais microeléctrodos sensíveis ao ruído electrónico e também está associada com uma resposta mais lenta para uma alteração na concentração de iões. Informações úteis pode ser encontrado no artigo publicado por Smith et ai. 26. </li><li> Silanizar os eletrodos para tornar o hidrofóbico superfície interna para auxiliar a retenção do cocktail ionóforo lipofílico. Colocar os microeléctrodos em uma cremalheira e do calor do metal O / N num forno a&gt; 100 ° C para secá-las. O rack é uma placa de metal com buracos de 2 mm de diâmetro perfurados parte do caminho. Coloque os eletrodos nos buracos ponta para cima com uma 250 ml gproveta moça sobre eles. </li><li> Na parte da manhã, desligar o forno e, enquanto vestindo luvas isolantes, retire cuidadosamente a prateleira de metal com os eletrodos e copo no lugar. Fechar a porta do forno para reter o calor. </li><li> Usar luvas de látex ou borracha nitrílica, jaleco e óculos de protecção. Com uma pipeta de Pasteur de plástico, colocar uma gota da solução de silanização I na base de cada um dos eléctrodos (manter o copo no lugar; utilizar o lábio de vazamento para o acesso de pipeta). A solução de silanização é vaporizado por a placa de aquecimento e silanizes o interior dos eléctrodos. Use um exaustor de fumos químicos para esta fase. Coloque o rack / copo / eletrodos de volta no forno quente por algumas horas para permitir que qualquer solução de silanização restante evaporar. Nota: Por razões de segurança, não ligue o forno novamente. Coloque uma etiqueta no forno indicando que não tem de estar ligado, pois pode conter vapor nocivo e inflamável. </li><li> Após arrefecimento, armazenar as microeletrodos em um frasco insi armazenamento de microeletrodosDe a dessecador de vidro com 400 g de dessecante. Microeletrodos pode ser armazenado assim durante muitas semanas. Nota: Um método alternativo de silanização é descrito em Smith et ai 26. </li><li> Voltar-encher o microeléctrodo com 50 a 100 mL (um comprimento de cerca de 1 cm) de uma solução contendo 100 mM de ião a ser medido (ver Quadro 1 e Figura 1B). Use uma pipeta de plástico descartável Pasteur calor puxado em um bico de Bunsen a uma multa de filamentos. Enxaguar a pipeta em dH2O depois para impedir o bloqueio. Nota: Em alternativa, ajustar a concentração de iões da solução de aterro para coincidir com a concentração de ião na solução externa 27. </li><li> Observar o microeléctrodo sob um microscópio de dissecação para assegurar a ausência de bolhas de ar. <ol><li> Se as bolhas estão presentes torneira de microeléctrodos o levemente com uma unha, mantendo o eletrodo vertical (ponta para baixo) e / ou empurrar a bolhaé a ponta através da aplicação de contra-pressão, utilizando uma seringa modificado com um tubo de silicone de trocar a agulha. </li></ol></li><li> Tip-encher o microeléctrodo com 15 a 20 nl (um comprimento de 30-50 um) de ionóforo cocktail-ião específico (ver Tabela 1). Coloque uma pequena gota de ionóforo cocktail na borda curta de uma lâmina de microscópio. Observe a ponta de microeletrodos sob um microscópio de dissecação e movê-lo em direção a lâmina de microscópio até que a ponta de microeletrodos toca o cocktail ionóforo para apenas cerca de meio segundo. Desenhe o cocktail ionóforo na microeletrodos pela pressão capilar. Nota: Evite uma longa coluna de ionóforo cocktail pois isso aumenta a resistência elétrica da sonda, que pode torná-lo suscetível a interferência eletrônica (ruído) e também diminui o tempo de resposta. </li><li> Montar o microeléctrodo em um suporte de microeléctrodos linear com um conector macho de ouro de 1 mm e de AgCl (Ag +) fio (Figura 1B). &lt;/ Li&gt; <li> Montar o suporte do microeléctrodo para a fase cabeça montada sobre um microposicionador controlado por computador tridimensional electrónica (Figura 1A). </li><li> Colocar a ponta microeléctrodo em solução adequada para a medição da amostra a ser medida (solução fisiológica salina, meio de cultura, etc.) para permitir que o microeléctrodo para estabilizar durante uma hora ou duas, ou mesmo durante a noite. </li></ol></li><li> Preparação do eléctrodo de referência <ol><li> Eléctrodos de referência (Figura 1C) são as mesmas como acima capilares. Corte o capilar com um lápis de diamante em 5 cm de comprimento e fogo-polido em cada extremidade para 1-2 sec em uma chama de Bunsen. </li><li> Encha estes eléctrodos com ~ 200 mL de uma solução de NaCl 3 M, CH 3 CO 2 K (acetato de potássio) ou de KCl com 2% de agarose. Escolha da solução, dependendo do ião a ser medido (o eléctrodo de referência não devem conter o ião a ser medido, ver Tabela 1). Misturara agarose e a solução e aquece-se quase a ferver em um forno de microondas. Mexa para dissolver a agarose (a solução passa claro). </li><li> Conecte o eletrodo de referência a um Pasteur pipeta de plástico e chamar a solução quente no capilar. </li><li> Gota o eléctrodo em 3 M de NaCl fria, CH 3 CO 2 K ou solução de KCl e armazenar nesta solução 3 M em tubos selados antes da sua utilização. Descarte qualquer eletrodos de referência com bolhas de ar. </li><li> Monte o eletrodo de referência em um suporte de microeletrodos em linha reta (pré-preenchido com solução 3 M) com um AgCl (Ag +) pelota dentro e um ouro 2 milímetros conector macho (Figura 1C) e anexar o eléctrodo e titular em um micro-posicionador manual do montado em um suporte magnético. </li></ol></li></ol> 2. íon-seletivo de auto-referência Calibração microeletrodos <ol><li> Preparar soluções de calibração contendo o ião de interesse como na solução de referência; ver Tabela 1 </strong&gt;. Suporte a concentração que se encontra na solução da amostra estará em (por exemplo, meios de cultura, soro fisiológico). Isto é, uma solução de calibração deve conter uma concentração mais baixa do ião do que na solução de medição, e uma mais elevada. <ol><li> Por exemplo, utilizar soro fisiológico que contém 1 mM de K +. Para esta concentração entre parênteses, dissolver KCl pó em água desionizada a uma concentração de 10, 1 e 0,1 mM em diluições em série. Use essas soluções de calibração. Em alternativa, utilizar, pelo menos, duas destas soluções. </li></ol></li><li> Mergulha-se o microeléctrodo selectivo de iões e do eléctrodo de referência em cada uma das soluções de calibração e deixar que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes de gravar a tensão correspondente utilizando o software dedicado (ver Tabela 1). </li><li> Como o software salva os dados de saída (amplificador) como um arquivo txt, copiar os dados para um arquivo de planilha. Traçar a saída de microeletrodos (mV) contra o logaritmoa concentração de ião molar (Figura 2A). </li><li> Aplicar uma regressão linear e calcular a inclinação de Nernst, interceptar e R valor 2. Aceite o microeletrodos se a inclinação é de 58 Nernst ± 11 mV / década para íons monovalentes e 29 ± 11 mV / década para íons bivalentes (para cátions, a inclinação de Nernst é positivo, para ânions é negativo). Além disso, deve ter boas microeléctrodos uma correlação linear forte (R2&gt; 0,9; Figura 2B). Nota: A saída de mV do amplificador usado aqui dá a leitura mV com um ganho dez vezes. Os valores têm de ser divididos por um factor de dez. </li><li> Utilizar a fórmula de regressão linear para converter a saída em mV em bruto do microeléctrodo em concentração de ião real (Figura 2B). </li></ol> 3. Validação da técnica de microeletrodos íon-seletivo <ol><li> Preparar uma fonte artificial <ol><li> Capilares fonte artificial são os mesmos como capilaresacima. Calor puxe o capilar usando um extrator de microeletrodos como no passo 1.1.1. </li><li> Backfill estes capilares com 200 ul de uma solução de NaCl, KCl 1 M, CaCl2 2 H2O ou tampão de pH 4. Escolha da solução fonte artificial de acordo com o ião a ser medido (veja Tabela 1). Nota: Como alternativa, puxe eletrodos com maior diâmetro da ponta (~ 20 mm) e ponta-preencher com as mesmas soluções mas contendo 0,5-1% de agarose (agarose vai impedir que qualquer fluxo de grandes quantidades de solução). </li><li> Montar o capilar fonte artificial de um micromanipulador e mergulhá-lo na solução usada para medir o fluxo do ião nas amostras. Deixar a fonte artificial na solução durante 30 min a 1 h para permitir a estabilização do gradiente. </li></ol></li><li> Validação do microeletrodos íon-seletivo <ol><li> Mergulha-se o microeléctrodo selectivo de iões cerca de um centímetro de distância da fonte artificial capilar na solução usada para measure o fluxo de ião nas amostras e fechar o circuito com o eléctrodo de referência, tal como antes. Que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes de gravar a tensão correspondente utilizando o software dedicado para 1 a 2 min. Este valor corresponde ao valor de tampão (também referida na literatura como referência, o fundo ou valor em branco). </li><li> Mover o microeléctrodo selectivo de iões a cerca de 5 mm a partir da origem artificial e deixar que o valor de tensão estabilizar durante 1 a 3 minutos antes da gravação da tensão correspondente, utilizando o software de 1 a 2 min. </li><li> Repetir o procedimento acima, colocando o microeléctrodo selectivo de iões 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 e 1280 uM de distância do capilar fonte artificial. </li><li> Extrair os dados como um arquivo txt e copie os valores em um arquivo de planilha. </li></ol></li><li> Calcula-se a concentração de iões correspondentes aos valores mV na mesma forma que para os valores de calibração. A partir do valor. NãoTE: Se um fluxo de iões está presente, o microeléctrodo detecta uma diferença na concentração de iões entre as duas posições (Figura 3B). Se a fonte artificial contém mais iões da espécie medida que a solução, a concentração deve ser maior próximo da fonte de longe, validando a capacidade do microeléctrodo selectivo de iões para detectar correctamente a direcção de um fluxo de iões (neste caso efluxo; para uma pia artificial, com concentração de iões específica menor do que meio de medição, deve ser influxo). <ol><li> Calcular o fluxo de iões utilizando a lei de difusão de Fick: J = c μ (dc / dx) em que c é a concentração de iões na solução (mol cm -3), μ é a mobilidade de iões (mol cm N -1 seg -1) e dc é a diferença de concentração ao longo distância dx (cm) (Figura 2C). Dados de fluxo de iões são geralmente apresentados em pmol cm -2 s-1 Ou -2 cm nmol seg -1. Nota:.. Um método alternativo para o cálculo de fluxo de iões descrito por Smith et al 26 pode ser usado. As principais diferenças incluem o uso do coeficiente de difusão em vez de a mobilidade iónica e a subtracção do fluxo de iões fundo (também tensão deriva ou factor de correcção), calculado a partir de medições de fluxo de iões na solução salina sem amostra. </li><li> Traça-se a média dos fluxos de iões de cada etapa contra a distância a partir da fonte (Figura 2D). Afastando-se da fonte, observar um decréscimo exponencial do valor do fluxo validar a capacidade do microeléctrodo selectivo de iões para detectar diferentes magnitudes de fluxos de iões. </li><li> Fazer a validação fonte artificial uma vez para cada íon específico destinado a ser gravadas, a fim de validar as suas medições de direção e magnitude corretas com um grande sinal-nrácio Oise. Nota: Medição de fluxo de iões do tampão sem amostras indica o nível de fundo ou ruído. Normalmente, a medição tampão não apresenta qualquer flutuação clara da concentração de íons levando a muito pequeno de fluxo que exibe direcção variável. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de medição Câmara Nota: antes de experiências, considere a amostra a ser medida e como a amostra é para ser montado e imobilizado para medições de microeléctrodos. <ol><li> Para Xenopus laevis medições de ovócitos corte de 1 cm quadrado de uma malha de 800 mm de nylon (malha Nitex) e colá-lo em uma placa de Petri de plástico (Figura 1E). </li></ol> 5. Ion Flux Medição <ol><li> Medir a concentração de iões presentes no tampão usado para realizar as medições na amostra da mesma maneira que para a solução de calibração. X. oócitos laevis exigem modificação da campainha de Mark (MMR). Dissolve de NaCl, KCl, CaCl, e MgCl HEPES em água desionizada de modo a atingir uma concentração final de (mM): NaCl 100, KCl 2, CaCl 2, MgCl 1 e 5 HEPES. Ajustar o pH do tampão a 7,5 usando NaOH. </li><li> Colocar a amostra na câmara de medição e trazer o microeléctrodo selectivo de iões perto da amostra (cerca de 10 um de distância) usando o microposicionador para definir a posição perto do microeléctrodo (Figura 3A). </li><li> Iniciar a excursão de baixa frequência (0,3 Hz) (100 uM) do microeléctrodo entre a posição próxima e uma posição de distância a partir da amostra (distância) usando o software dedicado. Certifique-se de que o movimento do microeléctrodo é perpendicular à superfície da amostra. Nota: A excursão do microeletrodos podem ser definidas no software. Excursão grande aumenta o gradiente de ler permitindo uma mais fácil detecção de pequenos fluxos durante a medição enquanto prolonga o intervalo de amostragem e diminui a resolução temporal. Vejo <strong&gt; Figura 3A para um exemplo. </li><li> Inicie a gravação usando o software. O microeléctrodo pausa em cada posição e o potencial eléctrico em mV é registada no computador. Obter medições durante pelo menos 2 minutos, permitindo que a estabilização do sinal. Para experiências de lapso de tempo curtos, as variações potenciais recorde na posição de interesse para todo o curso do tempo. </li><li> Extrair os dados como um arquivo txt e copie os valores em um arquivo de planilha. </li><li> Calcula-se a concentração de iões correspondentes aos valores mV na mesma forma que para os valores de calibração. A partir do valor. Nota: Se um fluxo de iões está presente, o microeléctrodo detecta uma diferença na concentração de iões entre as duas posições (Figura 3B). </li><li> Calcular o fluxo de iões utilizando a lei de Fick da difusão, como anteriormente (passo 3.3.1). </li><li> Repita a medição tampão antes de medir uma nova amostra e repita o procedimento de medição e cálculo de fluxo para cada novoamostra. </li></ol> 6. Análise Estatística e Dados Apresentação <ol><li> Testar os efeitos independentes da posição e / ou do tempo nos fluxos iônicos sob a condição de controle usando um modelo de ANCOVA com efeitos mistos 28. Nota: Análise de covariância (ANCOVA) é um modelo linear geral que mistura ANOVA regular e regressão, permitindo que tanto as medidas categóricas e contínuos para serem utilizadas como variáveis ​​independentes. Além disso, na presença de erros correlacionados induzidas por medidas repetidas por efeitos aninhados individuais e eventuais, modelos de efeitos mistos são utilizados para modelar estimativas precisas de ambos os efeitos fixos e aleatórios. </li><li> Calcule comparações de pares usando teste t Student entre os níveis de grupo com correção de Bonferroni para múltiplos testes 28. </li><li> Gerar boxplots para resumir medições de fluxo de iões de acordo com a posição ea hora. Incluem os valores de p do t de Student pares descritoacima (Figura 3D) e indicam níveis de significância de p valores como se segue: *: p &lt;0,05; **: P &lt;0,01; ***: P &lt;0,001 29 </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos para a medição de fluxos de iões bem sucedida extracelulares in vivo são os seguintes: a redução do ruído, o fabrico correcto do micro-eléctrodos selectivos de iões e do eléctrodo de referência, e o posicionamento da amostra e ambos os eléctrodos. A fim de minimizar o ruído, o sistema de gravação deve estar em uma ligação à terra (aterrada) gaiola de Faraday de preferência com um (isolamento de vibração) mesa com tampo de metal que também está ligado à terra....

<html> Todas as células animais estão rodeados por uma membrana de bicamada lipídica que separa o citoplasma a partir do ambiente exterior. A célula mantém um potencial de membrana elétrica, negativa no interior, por transporte ativo de íons um. O potencial de membrana é uma fonte de energia que a célula pode utilizar para operar vários dispositivos moleculares na membrana 2. Neurônios e outras células excitáveis ​​têm grandes potenciais de membrana. Rápida abertura dos canais de sódio recolhe o potencial de membrana (despolarização) e produz o potencial de acção que é transportado ao longo do comprimento do neurónio 2. Aparte destas alterações eléctricos rápidos, muitos tecidos e órgãos gerar e manter potenciais eléctricos significativos a longo prazo. Por exemplo, a pele e os epitélios da córnea gerar e manter potenciais trans-epiteliais e correntes eléctricas extracelulares por bombagem de iões direccional (principalmente cloreto de sódio e) 3. tenda &quot;&gt; Enquanto as medições de corrente eléctrica extracelular endógena utilizando a sonda de vibração 4-6 e medições de membrana ou trans-epitelial potenciais utilizando o sistema de microeléctrodos 7-10 permitem a medição dos parâmetros eléctricos de membranas celulares e camadas de células epiteliais, eles não dão indicação da espécie iónicos envolvidos. Microeletrodos com ionóforo seletivo pode medir a concentração de íon específico em solução. Gradientes de iões ou de fluxo podia ser medido com dois ou mais eléctrodos em diferentes posições. No entanto, o desvio de tensão intrínseco de cada sonda seria diferente, fazendo medições imprecisas ou mesmo a detecção de um gradiente que não estava presente. Um único eletrodo usado em modo &quot;auto-referência&quot;, pelo qual ele se move em baixa frequência entre dois pontos resolve este problema. Agora o fluxo de iões pode ser visto no contexto de um relativamente lento e estável desvio de sinal (veja a Figura 3B). </p&gt; O sistema de medição sensível-ion utiliza microeletrodos de auto-referência de íon-seletivo para detectar pequenos fluxos extracelulares de íons perto de tecidos ou células individuais. O sistema é composto por um amplificador que processa o sinal a partir do microeléctrodos e um motor passo a passo e micro controlador para controlar o movimento do microeléctrodo. O microeléctrodo selectivo de iões e do eléctrodo de referência que fecha o circuito está ligado ao amplificador de andar de entrada por meio de um pré-amplificador (Figura 1A). O software de computador determina os parâmetros do movimento de microeléctrodos (frequência, distância) e também regista a saída do amplificador. O motor de passo controla o movimento através de um microeléctrodo microposicionador tridimensional. A baixa freqüência de vibração de microeletrodos íon-seletivo foi desenvolvido pela primeira vez em 1990 para medir o fluxo de cálcio específica 11. Bem como cálcio, cocktails ionóforos comercialmente acessíveis estão agora disponíveis para fazer microelectrodes sensíveis ao sódio, cloreto, potássio, hidrogénio, magnésio, nitrato, amónio, fluoreto, lítio ou mercúrio. Basicamente, o ião-selectivo técnica de microeléctrodo auto-referenciar converte a actividade de um ião específico dissolvido numa solução para um potencial eléctrico, que pode ser medida por um voltímetro. O coquetel de ionóforo é um líquido imiscível (lipofílico orgânico,) fase com propriedades de permuta iónica. O ionóforo de complexos (se liga selectivamente iões específicos reversivelmente) e transfere-os entre a solução aquosa contida no microeléctrodo (electrólito) e a solução aquosa em que o microeléctrodo é imerso (Figura 1D). Esta transferência de iões leva a um equilíbrio electroquímica e uma variação do potencial eléctrico entre os microeléctrodos e o eléctrodo de referência é medido pelo voltímetro. A tensão é proporcional ao logaritmo da actividade específica de iões de acordo com a Nernst equation permitindo o cálculo da concentração de iões (Figura 2A e B). Actualmente, vários sistemas de permitir a medição do fluxo de iões utilizando um conceito ou princípio semelhante. Por exemplo, a técnica do eletrodo íon-seletivo Scanning (SIET) 12,13 ou o microeletrodos Ion Flux Estimação (MIFE) técnica desenvolvida por Newman e Shabala 14-16 estão comercialmente disponíveis e amplamente utilizado pela comunidade de investigação a fim de determinar íon específico fundentes ocorrendo a membrana da célula e do tecido através de uma variedade de animais, plantas e modelos de células de estar solteiro. Microeletrodos íon-seletivo têm sido usados ​​para medir hidrogênio, potássio e fluxo de cálcio através de raízes de plantas 17, cloreto de fluxo em artérias cerebrais de ratos 18 e em tubos polínicos 19, fluxo de hidrogênio em células da retina de skate 20, o fluxo de cálcio no osso do rato 21, vário íon fluxos em 22 de hifas fúngicas e no ra córnea 23, e, finalmente, o fluxo de cálcio durante a cura da ferida célula única 12,24. Veja também a seguinte análise para obter informações detalhadas sobre auto-referência microeletrodos íon-seletivo 25. O artigo a seguir descreve em detalhes como preparar e realizar a medição de fluxos de iões extracelulares endógenos utilizando a auto-referência técnica microeletrodos íon-seletivo no nível da célula única.

<table><tbody><tr><td>IonAmp&nbsp;</td><td>&nbsp; Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA</td><td>nenhum</td><td>amplificador criado pelo Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>IonAmp32&nbsp;</td><td>&nbsp; BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EUA</td><td>nenhum</td><td>software criado pelo BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Pré-amplificador Headstage</td><td>&nbsp; Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA</td><td>INA116</td><td>BSR Voltage Follower INA116, projetado pelo BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>MicroStep Driver</td><td>&nbsp; Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA</td><td>nenhum</td><td>três drivers MicroStep são necessários para o posicionamento X, Y e Z; criado pelo Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Microposicionador manual&nbsp; &nbsp;</td><td>Instrumentos de Precisão Mundiais</td><td>Modelo KITE-R</td><td>Sistema semelhante pode ser adquirido na Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Suporte magnético&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Modelo M10</td><td>Sistema semelhante pode ser adquirido na Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Tabela de isolamento de vibração&nbsp; &nbsp;</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Modelo VW-3036-OPT-023040</td><td>Sistema semelhante pode ser adquirido na Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Parte de três microposicionadores dimensionais: suporte angular, 90&deg;, faces ranhuradas</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Modelo 360-90</td><td>A montagem dos três microposicionadores dimensionais requer também Três motores rotativos elétricos para controle X, Y, Z, braço de montagem MPH-1 com poste de ângulo ajustável MCA-2 e Vários conectores e parafusos Newport para aparafusar na mesa</td></tr><tr><td>de vibração Parte de três microposicionadores dimensionais: Estágio de Junção de Pinos 0,5 polegada X Travel</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Parte de três microposicionadores dimensionais: Estágio Linear de Montagem Rápida, 0,5 polegadas XY Travel</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Kwik-Fil capilares de vidro borossilicato de parede fina sem filamento&nbsp;</td><td>Instrumentos de Precisão Mundiais</td><td>TW150-4</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Extrator de eletrodo&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Rack de metal</td><td>Feito internamente</td><td>nenhum</td><td>Suporte de eletrodo de metal feito internamente perfurando furos de 2 mm de largura meio centímetro espaçados em uma base retangular de aço de 10cm por 15cm</td></tr><tr><td>Forno</td><td>QL</td><td>Modelo 10 Forno</td><td>de laboratório nenhum</td></tr><tr><td>Solução de silanização I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>Perigoso, manuseie conforme recomendado pelo provedor&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro; Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>316060</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Frasco de armazenamento de eletrodo/micropipeta</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>E215</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Dessecador de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-595E</td><td>Contém dessecante de drierita (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, EUA). Coloque vaselina na vedação para torná-la hermética.</td></tr><tr><td>Pipeta de plástico Pasteur&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597722</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Bico de Bunsen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S97329</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Suporte de microeletrodo reto</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-A15P</td><td>com um conector macho dourado de 1 mm e fio Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Suporte de microeletrodo reto&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>com um gêmulo AgCl(Ag+)interno e um conector macho dourado de 2 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 6 cm</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>nenhuma</td></tr><tr><td>malha Nitex</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX750</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Cola; Epóxi Loctite</td><td>VWR</td><td>500043-451</td><td>Misture a cola e o endurecedor em partes iguais num recipiente de pesagem de plástico e misture bem. Endurece rapidamente, mas deixa em RT por 24 h para cura total</td></tr><tr><td>Água deionizada&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de Potássio Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de Cálcio Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Acetato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>nenhum</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>nenhum</td></tr></tbody></table>

medição de extracelular ion fluxos usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

As células de animais, plantas e células individuais são envolvidas por uma barreira chamada a membrana celular que separa o citoplasma a partir do exterior. Camadas de células, tais como os epitélios também formam uma barreira que separa o interior a partir do exterior ou diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Uma característica chave destas barreiras é a distribuição diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas de células. Duas propriedades permitem que esta distribuição: 1) membranas e epitélios exibir permeabilidade seletiva de íons específicos; 2) são transportados através de bombas de iões através das membranas celulares e camadas de células. Estas propriedades desempenham um papel crucial na manutenção da fisiologia do tecido e agir como sinalização sinais de avaria, durante o reparo, ou sob condição patológica. A auto-referenciar microeléctrodo selectivo de iões permite medições de fluxos de iões específicos, tais como cálcio, potássio ou sódio em níveis de células e tecidos individuais. O microeléctrodo contém um ionóforo que é cocktailselectivamente permeável a um ião específico. A solução de enchimento interno contém um conjunto de concentração do íon de interesse. O potencial eléctrico do microeléctrodo é determinada pela concentração do ião exterior. À medida que a concentração de ião varia, o potencial do microeléctrodo muda como uma função do log da actividade de iões. Quando mudou-se para trás e perto de uma fonte ou sumidouro de íon (ou seja, em um gradiente de concentração devido ao fluxo de iões) o potencial flutua microeletrodos a uma amplitude proporcional ao fluxo de iões / gradiente. O amplificador amplifica o sinal de microeléctrodos e a produção é registada no computador. O fluxo de iões pode então ser calculado pela lei de Fick da difusão utilizando a flutuação potencial de eléctrodo, a excursão de microeléctrodo, e outros parâmetros, tais como a mobilidade de iões específica. Neste artigo, descreve em detalhes a metodologia para medir fluxos de iões extracelulares utilizando a auto-referência de microeletrodos um íon-seletivod apresentar alguns resultados representativos.

Temos anteriormente demonstrado que o influxo de cálcio aparece depois de uma única célula ferindo 24. Nós, portanto, perguntado se outros fluxos de iões ocorrer após ferimento única célula. Utilizou-se o X. laevis oócito, um modelo bem estabelecido para única célula a cicatrização de feridas 30-34 e gravação eletrofisiológico 24,35-39. Curiosamente, íons de potássio são mais concentrados dentro X. oócitos laevis (cerca de 110 mM) de 40 na solução ex...

Os transportadores nas membranas celulares permitem a segregação diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas celulares e desempenham papéis cruciais durante a fisiologia, reparo e patologia dos tecidos. Descrevemos o microeletrodo de auto-referência íon-seletivo que permite a medição de fluxos de íons específicos em células e tecidos individuais in vivo.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

O objetivo geral deste procedimento é medir os fluxos iônicos extracelulares in vivo utilizando a técnica de microeletrodos autoreferentes seletivos a íons. Isso é realizado primeiramente montando os microeletrodos seletivos a íons e o microeletrodo de referência. O segundo passo é calibrar e validar os microeletrodos autoreferentes seletivos a íons.Em seguida, as medições do fluxo iônico específico são realizadas na amostra biológica na forma de gravações de voltagem. Por fim, a gravação de voltagem é convertida em fluxo iônico. Em última análise, esta técnica permite a medição precisa e não invasiva de fluxos iônicos extracelulares específicos em células ou tecidos vivos.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em fisiologia e envelhecimento, bem como em regeneração ou patologia. Por exemplo, este método permite a identificação de fluxos iônicos específicos, que controlam processos biológicos como o crescimento, a morfogênese tecidual ou a diferenciação. Demonstrará este procedimento o Dr. Gim Ardi, pós-doutorando do laboratório do Dr. Benjas. Antes da montagem para calibração do eletrodo, monte um eletrodo seletivo para íons pré-preenchido em um suporte para microeletrodos equipado com um conector macho de ouro de um milímetro e um fio de prata revestido com cloreto de prata.Em seguida, fixe o porta-eletrodo microscópico a um posicionador microeletrônico controlado por computador de três eixos. O eletrodo seletivo a íons deve conter previamente o eletrólito e a solução de coquetel de íons específica para os íons de interesse. Após a montagem, o eletrodo deve ser imerso em uma solução contendo um milimolar de cloreto de potássio.Além disso, monte o eletrodo de referência em um suporte reto para microeletrodos contendo uma solução salina de três mols em ágar, um pellet de prata revestido com cloreto de prata e um conector macho de ouro de dois milímetros para o eletrodo de referência. A escolha da solução salina depende das espécies iônicas a serem medidas. Após preparar o eletrodo de referência, fixe o suporte do eletrodo a um microposicionador manual que está previamente montado em um suporte magnético.Uma vez montado, o eletrodo deve ser imerso em uma solução contendo um milimolar de cloreto de potássio. Antes de iniciar, o conjunto do eletrodo iônico seletivo deve ter preparado uma série de diluição de padrões eletrolíticos para calibração contendo os íons de interesse. Por exemplo, se cátions potássio devem ser detectados em uma concentração fisiológica de cerca de um milimolar, prepare uma série de três ordens de grandeza de soluções de cloreto de potássio nas concentrações de dez, um e 0,1 milimolar.Isso maximiza a faixa dinâmica de detecção exigida pelo ensaio. Para calibrar o eletrodo seletivo por íons, comece imergindo ambos os eletrodos, o seletivo por íons e o de referência, na solução de calibração de menor concentração, neste caso, 0,1 milimolar. Após um breve período de estabilização de um a três minutos em temperatura ambiente, meça e registre a tensão em estado estacionário.Repita as medições de tensão para os demais padrões de calibração, plotando as tensões medidas contra o logaritmo das concentrações iônicas molares. Para cada solução-padrão, aplique regressão linear para determinar o coeficiente angular, o intercepto e o valor de R² da curva de calibração. Para calcular o coeficiente angular de Nernst, lembre-se de dividir as tensões medidas pelo ganho total do amplificador de tensão.Para demonstrar o protocolo de medição, o fluxo de íons potássio de um oócito de rã perfurado será caracterizado utilizando um microeletrodo sensível ao potássio. Antes de iniciar a montagem do eletrodo seletivo a íons, corte um pedaço de um centímetro de um malha de náilon de 800 mícrons e cole-o a uma placa de Petri de plástico. Além disso, prepare previamente a solução de Ringer modificada de Mark com a seguinte formulação: 100 milimolar de cloreto de sódio, dois milimolar de cloreto de potássio, dois milimolar de cloreto de cálcio, um milimolar de cloreto de magnésio e cinco milimolar de HEPES. Ajuste o pH do tampão para 7,5 com hidróxido de sódio e adicione uma alíquota do tampão preparado à placa de Petri.Coloque cuidadosamente o citoplasma do sapo, o eletrodo seletivo a íons e o eletrodo de referência na placa de Petri. Em seguida, perfure o citoplasma e acione o microposicionador, de modo que o eletrodo seletivo a íons fique a cerca de 10 micrômetros de distância da amostra. Em termos de nomenclatura, a distância atual entre a amostra e o eletrodo será denominada posição próxima.Em seguida, acione o microposicionador de modo que o eletrodo seletivo de íons percorra periodicamente da posição próxima de 10 mícrons até uma posição mais distante de 100 mícrons, e depois retorne à posição próxima a uma frequência de 0,3 hertz, ou seja, três trajetos completos a cada 10 segundos. Durante a atuação do microposicionador, verifique se o movimento do eletrodo é verdadeiramente perpendicular à superfície tangencial lesionada do citócito, e ative o software de medição e registro de tensão. O microposicionador é programado para pausar brevemente nas posições próxima e distante enquanto os dados de tensão são coletados.Os dados são registrados continuamente durante a cicatrização de feridas em ovócitos, o que leva cerca de 15 minutos em experimentos mais longos, como na observação de processos ao longo de vários dias durante medições da regeneração da cauda de girinos de opus, sendo os dados registrados por dois minutos em diferentes pontos temporais. Por exemplo, 1, 3, 6, 12 e 24 horas. Após a conclusão do experimento, extraia os dados de tensão como um arquivo de texto e copie os valores em uma planilha.Utilize a curva de calibração previamente determinada para converter os valores de voltagem medidos em suas concentrações iônicas correspondentes. Represente graficamente as concentrações iônicas extrapoladas em função da distância em relação à amostra biológica. Por fim, calcule o fluxo iônico utilizando a lei fixa de difusão.Onde C é a concentração de íons na solução, MU é a mobilidade iônica e DC DX é a diferença de concentração ao longo da distância dx. Antes da experimentação biológica, o valor do intercepto da inclinação do NER e toda a curva de calibração do eletrodo seletivo a íons podem ser validados contra um gradiente iônico artificial gerado a partir de uma fonte iônica de um molar colocada em uma placa de Petri. Quando as alterações nas concentrações de íons de potássio são representadas graficamente a uma distância próxima ou distante do local da ferida em annu.Os dados sugerem que um evento maciço de fluxo de potássio ocorre no início da lesão celular, e à medida que a cicatrização progride, o fluxo de potássio diminui gradualmente até retornar aos níveis de repouso após 15 minutos, quando a lesão está completamente cicatrizada. Além disso, quando as concentrações medidas de íons potássio são convertidas em fluxo iônico, o aumento súbito e a diminuição gradual do fluxo de potássio após a lesão parecem representar um efeito estatisticamente significativo quando comparado a um oócito controle intacto. Após este procedimento, outros métodos, como a marcação fluorescente de bioeletricidade, podem ser realizados para responder questões adicionais sobre as características dos fluxos iônicos intercelulares e subcelulares.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo fornece uma abordagem bioquímica para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) de células leucêmicas primárias com ensaio de fluxo extracelular. A avaliação do perfil metabólico dessas células ajuda a caracterizar suas demandas, levando a uma terapia personalizada.

Ensaio de Fluxo Extracelular: Um Método para Medir o Perfil Metabólico das Células

Neste vídeo, culturas de células renais embrionárias que expressam proteínas de canal iônico dependentes de luz fundidas com um repórter fluorescente demonstram o efeito da luz no movimento iônico. O patch clamp de célula inteira é usado para monitorar o movimento de íons.

Eletrofisiologia Optogenética Registro de Células com Canais Iônicos Dependentes de Luz

Este vídeo demonstra como caracterizar o espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos seletivos de íons e iontoforese para medir e comparar sinais elétricos. Esse processo ajuda a determinar a fração de volume e o grau de torção do espaço.

Caracterização do espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos íon-seletivos e iontoforese

A primeira parte deste artigo mostra como selecionar linhagens celulares mutantes que expressam trocadores vesiculares de Na+/H+ em sua membrana plasmática. A segunda parte fornece protocolos baseados em medições de pH intracelular e rápida absorção de íons, que são usados para determinar a seletividade de íons e os parâmetros cinéticos desses trocadores.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Demonstramos a fabricação, calibração e propriedades de dois tipos de microeletrodos seletivos de íons (de cano duplo e concêntricos) para medição de concentrações de íons no tecido cerebral. Estes são então usados na preparação da fatia do hipocampo de camundongos para mostrar que a atividade excitatória altera as concentrações extracelulares de potássio e sódio.

Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

Este protocolo descreve a utilização do ensaio de Ramsay para medir as taxas de secreção de fluidos de Malpighi (túbulos renais) isolado a partir de Drosophila melanogaster. Além disso, a utilização de eléctrodos específicos de iões para medir as concentrações de sódio e potássio no líquido segregado, que permite o cálculo do fluxo de iões transepitelial, é descrito.

A utilização do Ramsay ensaio para medir secreção de fluidos e Ion Flux Preços no<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Tubule Malpighian

Este artigo descreve como a seletividade iônica da channelrodopsina é determinada com registros eletrofisiológicos de patch-clamp de células inteiras usando células HEK293. Aqui, o procedimento experimental para investigar a seletividade de cloreto de uma channelrodopsina seletiva de ânions é demonstrado. No entanto, o procedimento é transferível para outras canalrodopsinas de seletividade distinta.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

Íons de potássio contribuem para o descanso potencial de membrana das células e a concentração extracelular de K+ é um regulador crucial da excitabilidade celular. Descrevemos como fazer, calibrar e usar monopolar K+-seletivos microeletrodos. Usar tais eletrodos permite a medição da dinâmica de concentração de K+ eletricamente evocada em fatias hippocampal adultas.

Fazendo, testando e usando potássio íon seletivo microeletrodos em fatias de tecido do cérebro de um adulto

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Este protocolo descreve metodologias por trás do ensaio ramsay, microeletrodos seletivos de íons, técnica de eletrodo seletivo de digitalização (SIET) e ensaios de contração in vitro, aplicados para estudar o sistema excretório de mosquitos adultos, composto pelos túbulos e traseiros malpighianos, para medir coletivamente as taxas de íons e secreção de fluidos, atividade contratil e transporte transepitelial.

Estudando a Atividade de Neuropeptídeos e Outros Reguladores do Sistema Excretório no Mosquito Adulto

Aprenda a medir fluxos iônicos extracelulares in vivo usando microeletrodos íon-seletivos de auto-referência. Esta técnica não invasiva permite avaliar dinâmicas iônicas em células e tecidos vivos com precisão.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

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