Name: Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a preparar cortes congelados de biópsias musculares para histologia, evitando artefatos de congelamento com congelamento rápido em isopentano e técnicas de inclusão. Este método preserva a arquitetura tecidual para análise precisa.

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Gostaríamos de agradecer a Alex Miller pelas revisões do manuscrito. Este trabalho foi apoiado com as bolsas de pesquisa concedidas a M.G. da Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) e Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue Colheita e congelamento dos tecidos musculares <ol><li> Eutanásia o rato com uma overdose de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Execute esta etapa em um exaustor e usar um método de contenção secundária, como um secador ou uma redoma de vidro contendo um cotonete embebido em isoflurano. </li><li> Confirme a morte com firmeza apertando pata. Use um método secundário de eutanásia, como luxação cervical. </li><li> Molhar a pele com álcool a 70% para reduzir a aderência de fios de cabelo soltos sobre os músculos. Descasque a pele fora o membro usando uma pinça fina, tais como # 5. </li><li> Cuidadosamente separar o músculo de interesse (tibial anterior (TA), neste caso) a partir dos ossos por baixo, a partir do tendão e remover. </li><li> Extirpar o músculo, cobri-lo em outubro (de corte ideal composto de temperatura), e coloque-o deitado sobre um molde de congelamento descartável rotulados. Certifique-se de que o músculo está em sua orientação fisiológica normal (cabeça para tail) sem esticar. Alternativamente, congelar o músculo em pequenos quadrados de isopor e fixá-lo utilizando os pinos de insetos para garantir o comprimento correto dos músculos. </li><li> Relaxar 2-metilbutano (isopentano) em um copo de aço usando azoto líquido. Isso leva, em média, 3-5 min. Continue mexendo de forma intermitente até precipitados brancos começam a se formar no fundo e paredes do copo. NOTA: Quando isso ocorre, isopentano tenha alcançado a temperatura ideal de congelamento (-150 ° C) </li><li> Mergulhe os moldes contendo músculos na gelada de 2-metilbutano. Congelar pequenos músculos, como o diafragma e longus extensor digitorum (EDL) para 6-12 seg e músculos maiores, como o sóleo gastrocnêmio (GS) e tríceps para 15 - 20 seg. Não congelar os músculos por muito tempo, pois isso pode levar a fissuras. </li><li> Transfira os tecidos congelados sobre gelo seco e deixe evaporar isopentano (note que este processo leva em média cerca de 15 - 20 min). Enrole os tecidos em papel alumínio e armazená-los em ultra baixa temperatura (-70 ° C a -80 ° C) até o corte. </li></ol> 2. Incorporar os tecidos em outubro de Elaborar bloco de tecido <ol><li> Tecidos de transporte em gelo seco para cyrostat para evitar o descongelamento. Transferência para o tecido criostato câmara (definida a -20 a -24 ° C para evitar o descongelamento completo de tecidos) e deixá-los equilibrar durante 30 min. </li><li> Vire a baía Peltier de refrigeração por diante. Se o cryostat não tem esse resfriamento, use aerosol spray de arrefecimento para congelar rapidamente a outubro Não deixe que o degelo do músculo em qualquer ponto durante a incorporação, pois isso pode resultar em danos causados ​​por congelamento. </li><li> Adicione uma camada fina e uniforme de outubro no disco de amostra e deixe esfriar. Quando a maior parte dos PTU é congelada no fundo enquanto ainda líquido na parte superior, insira o tecido na orientação correta (perpendicular outubro para seções transversais e paralelas para outubro para cortes longitudinais). Use spray de aerosol arrefecimento para congelar rapidamente outubro Toque na parte unembeded do tecido com calor extractor e aguarde 45 segundos. </li><li> Adicionar outra camada fina de outubro em torno do músculo, pulverizador com de aerossol de pulverização de arrefecimento e extrair o calor tal como no passo anterior. </li><li> Continua a adicionar outubro em pequenos incrementos e congelar rapidamente OCT utilizando uma combinação de aerossol de pulverização e extractor de calor de arrefecimento até que todo o músculo é coberto. </li><li> Colocar o extractor de calor na parte superior do bloco de tecido e esperar durante 5 min. </li></ol> 3. Preparar Seções e identificando as secções de Mid-barriga Região dos Músculos <ol><li> Montar o espécime para o cabeçote da amostra. Aperte o botão para fixar o disco. Certifique-se de que o disco de amostra está em bom contato com o cabeçote de amostra. </li><li> Ajuste a temperatura da câmara de entre -21 e -24 ° C e aguarde até que a temperatura definida é alcançada. </li><li> Ajuste as configurações de espessura (7 um); aparar o bloco através do avanço ou retração do bloco usando configurações grossas e finas. </li><li> Recolher as seçõesem pré-aquecido lâminas de microscópio com carga positiva, pressionando a parte superior da lâmina para as secções, utilizando a atracção entre cargas opostas para facilitar a aderência das secções de corte na lâmina. </li><li> Identificar as secções médio-barriga por medição da área da secção transversa (AST) das secções. Faça isso usando software de imagem no computador que está ligado ao microscópio. NOTA: As imagens de contraste de fase são tomadas e circunferência de todo o músculo é medido através de uma função de rastreamento sobre o programa de software. Isto irá proporcionar tanto CSA, bem como diâmetro mínimo furão (medida de fibras de tamanho em corte transversal que é expressa como a menor distância entre duas tangentes paralelas em lados opostos de uma partícula) medições. Nota: Quando CSA e diâmetro mínimo ferret medições começar a platô, mid barriga foi atingido. </li><li> Inventário e arquivar as lâminas a -80 ° C para a coloração futuro. NOTA: o PTU não precisam ser removidos antes da staininprocedimentos de g. Uma vez que as lâminas são lamínulas, eles estão prontos para ser manchado imediatamente. </li></ol> 4. Coloração NOTA: Embora os procedimentos passo a passo detalhadas podem ser encontradas na folha de dados do produto e deve ser seguido por procedimentos de coloração, otimização de pessoal pode ser obrigado a obter a coloração ideal. <ol><li> Como meios de montagem (ver quadro) não seja miscível com água, por meio de lâminas de desidratar graus crescentes de álcool (2 min cada em 70%, 95%, e 100% de etanol) e limpá-las com xileno (100% durante 5 min) para garantir lâminas não se tornam opaca ao longo do tempo. </li><li> Lamela seções e deixe-os secar. Imagem com microscópio equipado com software de imagem. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
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<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
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<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A histologia e imuno-histoquímica têm sido utilizados como ferramentas fundamentais para a compreensão da manifestação e progressão da patologia de várias desordens neuromusculares. Classicamente, biópsias musculares foram fixadas pela primeira vez em formaldeído e depois incorporado com cera de parafina. Enquanto fixação em formol preserva a arquitetura do tecido e permite o armazenamento e transporte de tecido à temperatura ambiente, também inativa enzimas e proteínas ligações cruzadas que obrigariam a novas medidas p...

O exame de histologia muscular desempenha um papel crítico na compreensão de diferentes tipos de distúrbios neuromusculares 1-4. Quando combinado com outras técnicas, permite que pesquisadores para ter uma idéia melhor da manifestação ea progressão da patologia e também pode ser essencial para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica 5-10. No entanto, para ser exato, os tecidos precisam ser preservados de forma adequada, de modo a preservar o estado fisiológico imediatamente antes da excisão. Isso requer muito cuidado durante a remoção, preservação, seccionamento e coloração. Os tecidos podem ser preparados de duas maneiras diferentes para estudo microscópico luz. O método primeiro, fixados em formalina embebidos em parafina (FFPE) seções, requer tecidos fixados em formol 10% tamponado naturais antes de ser incorporado com cera de parafina 11,12. A etapa de fixação ajuda a preservar a morfologia melhor, mas também ligações cruzadas pr endógenooteins necessitando, portanto, de antigénios intrincado procedimentos de recuperação para a imunocoloração e eliminando a possibilidade de coloração enzimática em tais seções 12. As secções congeladas, por outro lado, não precisa de ser pré-fixo ou processado; por conseguinte, as proteínas são capazes de reter conformações nativas biológicos 13,14. Além disso, cortes congelados também permitem rápido tempo de resposta, que às vezes é necessário, por exemplo, no diagnóstico intra-operatório de sarcomas e outras biópsias cirúrgicas 15. No entanto, se não for feito corretamente, este método é propenso a congelar danos, que introduz alterações à arquitetura muscular fazendo as seções impróprios para exame histológico. Este artigo irá delinear o método mais eficaz para preparar biópsias musculares, a fim de alcançar uma óptima coloração para exame adequado.

<table><tbody><tr><td>Criostato</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 EUA, telefone comercial 1-800-248-0123 Alternativa: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 EUA, Telefone: 1-631-547-8500 Alternativa: Olympus</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>Nikon Imaging Software Pesquisa Básica</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, EUA, Telefone: 1-631-547-8500 Alternativas: Imagem J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 EUA</td></tr><tr><td>OUTUBRO</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Fonte alternativa: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Disposable tissue mold</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR</td></tr><tr><td>Scientific Ethyl alcohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

fazer e não fazer na preparação de músculo cortes congelados para análise histológica

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

A avaliação histológica de biópsias do músculo tem servido como uma ferramenta indispensável para a compreensão do desenvolvimento e progressão da patologia de doenças neuromusculares. No entanto, a fim de fazê-lo, o cuidado apropriado deve ser tomado quando excisão e preservar tecidos para alcançar a coloração ideal. Um método de preservação de tecido envolve a fixação tecidos em formaldeído e, em seguida, incorporando-os com cera de parafina. Este método preserva morfologia bem e permite o armazenamento a longo prazo a temperatura ambiente, mas é difícil e requer a manipulação de produtos químicos tóxicos. Além disso, os resultados de fixação em formaldeído antígeno cross-linking, o que exige protocolos de recuperação antigênica para immunostaining eficaz. Pelo contrário, o seccionamento congelado não necessita de fixação e, assim, retém a conformação antigénio biológica. Este método também fornece uma vantagem distinta em volta rápida em torno do tempo, tornando-se especialmente útil em situações que necessitam de avaliação histológica rápido como intraoperativa biópsias cirúrgicas. Aqui nós descrevemos o método mais eficaz de preparação de biópsias musculares para visualização com diferentes colorações histológicas e imunológicas.

A instalação para a colheita e congelamento de tecidos pode ser visto na Figura 1. Tecidos excisados ​​deve ser armazenado em uma gaze embebida em PBS para evitar a secagem (Figura 1A). Quando os tecidos são selecionados para serem utilizados para análise histológica eles devem ser mergulhados em outubro e dispostas em molde crio na orientação adequada e tão perto de comprimento fisiológico possível para garantir a morfologia preciso (Figura 1B). Polpa de isopentano apr...

Aqui demonstramos os métodos mais eficientes para congelamento, incorporação, criossecção e coloração de biópsias musculares para evitar o congelamento de artefatos.

Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

O objetivo geral deste procedimento é evitar armadilhas ao preparar cortes congelados de biópsias musculares, como a criação de artefatos de congelamento. Isso é conseguido primeiramente congelando rapidamente o músculo em dois butanos metílicos resfriados com nitrogênio líquido. Após as biópsias musculares atingirem equilíbrio no criostato, elas são embutidas em temperatura ótima para corte, em meio à temperatura ambiente, em pequenos incrementos, com congelamento rápido utilizando resfriamento por aerossol e extração de calor.A seguir, são cortadas seções de sete mícrons e transferidas para lâminas de vidro positivamente carregadas e aquecidas. O passo final é corar as seções de tecido conforme necessário para avaliar a histologia do tecido. Em última análise, biópsias musculares adequadamente preparadas resultam em histologia tecidual bem preservada, sem artefatos de congelamento.Assim, a principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos existentes, como o corte de tecidos emblocados em parafina, é que ela é muito rápida e não altera a estrutura ou função dos antígenos endógenos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia muscular relacionadas à saúde e à doença, tais como crescimento, regeneração, inflamação, fibrose e necrose. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de distúrbios musculares, pois permitem a determinação do estado do músculo saudável e do músculo doente.Embora este método possa fornecer informações sobre diferentes formas de distrofia muscular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como caquexia associada às fases terminais do câncer e aids e perda muscular em populações idosas. Comece por eutanasiar um camundongo com uma overdose de isoflurano sob uma capela de exaustão e em um nível secundário de contenção, como um frasco de vidro fechado. Confirme a morte do animal pressionando firmemente sua planta do pé.Agora, umedeça o pelo com álcool a 70%. Isso evita que fios soltos de pelo aderem aos músculos. Prossiga removendo a pele da extremidade com uma pinça fina número cinco.Se pare cuidadosamente o músculo de interesse do osso, começando pelo tendão. Neste caso, o tibial anterior é isolado. Após a excisão do músculo, cubra-o com OCT e coloque-o plano sobre uma forma descartável de congelação identificada.Mais OCT será adicionado posteriormente antes do corte. Certifique-se de que o músculo esteja em sua orientação fisiológica normal ao longo do eixo da cabeça à cauda e de que o músculo não esteja esticado. Agora, resfrie.Alguns isop pentano em um béquer de aço usando nitrogênio líquido. Agite intermitentemente por três a cinco minutos com uma espátula de plástico. Quando um precipitado branco se formar, o isop pentano estará em sua temperatura ideal; neste momento, mergulhe as formas carregadas na solução.Músculos pequenos, como o diafragma e o extensor longo dos dedos, exigem de seis a 12 segundos. Músculos maiores exigem de 15 a 20 segundos, pois o congelamento excessivo pode levar a rachaduras. O próximo passo é colocar os tecidos congelados sobre gelo seco para permitir a evaporação do isopentano residual, o que leva cerca de 15 a 20 minutos.Uma vez que o tecido esteja seco, embrulhe-o rapidamente em papel alumínio e armazene-o em um congelador a menos 80 graus Celsius até que possa ser seccionado. Antes do seccionamento, transporte os tecidos congelados sobre gelo seco até o criostato.Transfira o tecido para uma câmara de criostato ajustada entre menos 24 e menos 20 graus Celsius e deixe-os equilibrar por 30 minutos. Os tecidos não descongelarão completamente nesta temperatura. Em seguida, incorpore o tecido primeiramente.Se disponível, ligue o resfriamento da câmara Peltier. Em segundo lugar, aplique uma camada fina e uniforme de OCT sobre o disco do espécime e deixe esfriar. Em terceiro lugar, assim que o OCT tiver congelado na parte inferior, mas ainda estiver líquido na parte superior, insira o tecido, orientando-o perpendicularmente ao OCT para seções transversais e paralelamente ao OCT para seções longitudinais.Agora, use um spray refrigerante aerossol para congelar rapidamente o OCT. Em seguida, toque a parte não congelada do tecido com um extrator de calor e mantenha-o em contato com o tecido por 45 segundos. Não permita que o músculo descongele em nenhuma etapa deste processo.Se o criostato não tiver resfriamento da plataforma por efeito Peltier, use resfriamento com aerossol para congelar rapidamente o OCT ao redor do tecido. Agora, adicione outra camada fina de OCT ao redor do músculo, pulverizando com spray de resfriamento por aerossol e removendo o calor conforme no passo anterior. Continue adicionando OCT em pequenos incrementos e congele rapidamente o OCT usando uma combinação de spray de resfriamento por aerossol e extrator de calor até que todo o músculo esteja coberto.Em seguida, coloque o extrator de calor na parte superior do bloco de tecido e aguarde cinco minutos antes de prosseguir com o corte. O espécime está agora pronto para ser montado na cabeça do espécime. Primeiro, aperte o botão para fixar o disco.Certifique-se de que o disco da amostra esteja em bom contato com a cabeça da amostra enquanto a câmara atinge temperaturas entre menos 24 e menos 20 graus Celsius. Ajuste a espessura do corte para sete mícrons quando a câmara atingir a temperatura, e inicie o aplainamento do bloco. Utilize os ajustes grosso e fino para mover o bloco.Quando os cortes estiverem prontos para serem coletados, pressione suas faces superiores contra lâminas positivamente carregadas aquecidas por lâmpada. Se o congelamento foi feito corretamente, a face do tecido deve apresentar-se branca e esbranquiçada. No entanto, um tecido que foi congelado incorretamente ou que descongelou durante o processo de montagem aparecerá vermelho a róseo.As lâminas podem ser armazenadas no congelador ultracongelador para análises futuras. A seção mediana do ventre do tecido pode ser identificada medindo a área da seção transversal em imagens de contraste de fase, utilizando a função de rastreamento de um software de análise de imagens. Essa análise fornece tanto a medida da área quanto do diâmetro mínimo de Feret.Quando essas medidas começarem a se estabilizar, a região mediana do ventre terá sido alcançada. Embora os fabricantes forneçam instruções passo a passo para a maioria dos protocolos de coloração, pode ser necessária uma otimização individual para obter intensidades ideais de coloração. O OCT não precisa ser removido.Para a coloração, para uma imunocoloração ideal, certifique-se de usar uma câmara umidificada. Ela deve ser coberta com perfil mantido sobre uma toalha de papel úmida e selada em uma caixa pequena para evitar a secagem das seções. Durante o processo de coloração para lâminas montadas permanentemente não imunocoloridas, seguindo o protocolo de coloração, desidrate as lâminas por meio de concentrações crescentes de álcool.Como o meio de montagem não é compatível com a água, limpe as lâminas com uma banho de cinco minutos em xilol a 100%. Isso garante que as lâminas não fiquem opacas com o tempo. Em seguida, prossiga com a montagem e a aquisição de imagens das seções da região mediana do ventre dos tibiais anteriores que foram coradas.Usando hematina e eosina. As seções adequadamente processadas apresentarão morfologia consistente e coloração uniforme em todo o tecido; músculos processados incorretamente, que sofreram dano por congelamento ou descongelamento prematuro, parecem apresentar múltiplas rupturas na morfologia e têm a aparência de flocos de trigo triturados.A imunohistoquímica também foi realizada nessas seções. Essas colorações foram satisfatórias. A fibronectina é corada em verde e o dappy é visto em azul.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão completa de como preparar uma boa seção congelada a partir de biópsias musculares para avaliação da arquitetura muscular. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente quatro a cinco horas, desde que todos esses passos sejam executados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar o descongelamento dos músculos após a realização deste procedimento.Outros métodos, como imunomarcação e hibridização in situ, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como crescimento e regeneração.

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Demonstrado neste vídeo são as técnicas de congelamento instantâneo e secção tecido cerebral embrionário de rato. Dicas úteis para usar o criostato são dadas, incluindo métodos de solução de problemas que podem ser usados ​​durante o corte para garantir que as seções resultantes tecidos estão livres de rachaduras e outras distorções.

Flash Freezing e Cryosectioning E12.5 cérebro de camundongo

Este vídeo descreve o procedimento para congelar o tecido muscular e obter suas seções finas. A técnica pode ajudar a estudar a caquexia relacionada ao câncer em modelos de camundongos com câncer de cólon.

Congelamento instantâneo de tecido muscular para seccionamento: um protocolo para obter cortes ultrafinos de tecido muscular murino rapidamente congelado

A análise dos tecidos musculares esqueléticos para determinar as propriedades estruturais, funcionais e bioquímicas é muito facilitada pela preparação adequada.  Este protocolo descreve métodos apropriados para preparar o tecido muscular esquelético para uma ampla gama de estudos de fenotipagem.

Triagem de Tecidos e Congelamento de modelos de doença do músculo esquelético

Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma de criohistologia semiautomatizada de alto rendimento para produzir imagens compostas alinhadas de múltiplas medidas de resposta de várias rodadas de imagens fluorescentes em seções congeladas de tecidos mineralizados.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para induzir a regeneração do músculo esquelético aguda em ratos adultos e manipulações subsequentes dos músculos, como dissecção, corte, congelação, coloração de rotina e análise de células musculares área de secção transversal.

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Este protocolo descreve um processo para congelar os tecidos musculares, mergulhando-os directamente em azoto líquido. Este protocolo também realça um novo frasco de congelação que pode evitar o "efeito manta" de gás de azoto quando os contactos de azoto líquido da superfície do tecido de um espécime.

Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Descrito aqui é um protocolo para imunorotulagem direta de miofibras necróticas em criosecções musculares. As células necróticas são permeáveis para as proteínas séricas, incluindo a imunoglobulina G (IgG). Revelar a captação de IgG por miofibras permite a identificação e quantificação de miofibras que sofrem necrose, independentemente da condição muscular.

Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

Este protocolo descreve métodos usados para preparar dobras vocais de ratos para estudo neuromuscular histoquímico.

Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares

Evidências crescentes indicam que a infiltração excessiva de lipídios dentro do músculo esquelético resulta em lipotoxicidade e diabetes. Aqui, apresentamos um protocolo completo, incluindo processamento de tecidos, coloração com Bodipy, aquisição de imagens e análise, para quantificar o tamanho, densidade e distribuição subcelular de gotículas lipídicas de forma específica do tipo fibra.

Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético

Aprenda a preparar cortes congelados de biópsias musculares para histologia, evitando artefatos de congelamento com congelamento rápido em isopentano e técnicas de inclusão. Este método preserva a arquitetura tecidual para análise precisa.

Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica

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