Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando

O objetivo geral deste procedimento é analisar a cinética fenotípica da geração e quantidade de linfócitos T produzidos por progenitores colonizadores do timo em E 13 ou E 18. Isso é realizado primeiramente isolando os lobos timicos de embriões de camundongo E 13, E 14 e E 18. Na segunda etapa, os lobos timicos de E 14 são irradiados e, em seguida, colonizados com células de E 13 ou E 18 separadas por citometria de fluxo, durante 48 horas em gota suspensa.

No passo final, os lóbulos colonizados são enxertados sob a cápsula renal de camundongos adultos CD três knockout. Em última análise, a citometria de fluxo pode ser utilizada para avaliar a presença dos progênitos colonizadores do timo em E 13 e E 18 na corrente sanguínea dos animais quiméricos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o cultivo in vitro de células T em células ine so, é que este método combina abordagens que permitem a maturação completa de células T a partir de progênitos definidos em um ensaio tridimensional com o enxerto de culturas de órgãos timicos em camundongos receptores intactos, permitindo a avaliação da diferenciação e da função dos progênitos de fatias timicas e de sua prole.

Como engenheiro de pesquisa com experiência em cirurgia de roedores, demonstrarei o procedimento. Dois dias antes do experimento de enxerto, em uma capela de fluxo laminar, limparei o abdômen de uma fêmea de camundongo grávida com etanol 70% e farei uma incisão longitudinal na pele na linha média, afastarei a pele para abrir a incisão e, em seguida, usarei pinça e tesoura para abrir o peritônio sem tocar no trato digestivo. Em seguida, retirarei o útero bifurcado e usarei a tesoura para separá-lo da vagina. Depois, colocarei o útero em uma placa de Petri de 90 por 15 milímetros contendo 40 a 50 mililitros de DPBS e farei cortes transversais entre as decíduas de cada embrião.

Use uma tesoura de ponta fina e uma pinça fina para remover a membrana muscular do útero, cortando entre a placenta e o saco vitelino, a fim de retirar cada embrião. Em seguida, remova o âmnio, mantendo os embriões, e coloque os embriões em uma nova placa de Petri contendo HBSS mais 1% de FCS. Para isolar o timo, posicione os embriões individualmente em posição supina sob uma lente binocular de aumento.

Em seguida, insira uma pinça longitudinalmente ao longo da cartilagem do esterno e pinça e abra a grade torácica utilizando pinças curvas. Puxe a parede torácica para o lado para visualizar os lóbulos timicos em cada lado da traqueia. Em seguida, pinça abaixo do timo com uma pinça fina para remover cuidadosamente cada lóbulo e coloque-os em uma placa de Petri contendo um mililitro de HBSS mais 1% FCS.

Em seguida, utilize duas pinças finas para remover o tecido conjuntivo ao redor sem danificar os lobos. Depois, lave os lobos em três mililitros de HBSS acrescido de 1% de FCS para eliminar os glóbulos vermelhos e iniciar a cultura de órgão tímico fetal irradiado. Lobos timicos de E14 isolados de embriões CD45.2 conforme demonstrado anteriormente.

Deixe as lóbulos repousarem por cerca de três horas. Em seguida, centrifugue os precursores de assentamento timicos recém-separados E13 ou E18. Re-suspenda o pellet no meio de cultura até uma concentração final de 500 células por 35 microlitros de meio.

Em seguida, coloque uma gota de 35 microlitros de suspensão celular em cada poço alternado de uma placa terasaki de 60 poços e plaque um lobo irradiado sobre a superfície de cada gota. Feche a placa e vire-a de cabeça para baixo para permitir que as células atinjam o polo apical da gota pela ação da gravidade, batendo suavemente no lado superior da placa invertida para forçar os lobos a deslizarem até a borda apical da gota. Em seguida, incube a placa invertida em uma incubadora umidificada por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após os lóbulos timicos terem sido colonizados, verifique o nível de anestesia do animal receptor pela ausência de resposta reflexa. Em seguida, coloque uma gota de pomada oftálmica em cada olho e posicione o camundongo sobre o lado direito sob uma capela de fluxo laminar. Depois, rape a área cirúrgica logo acima da articulação da pata traseira.

Em seguida, coloque um par de luvas estéreis e esterilize o campo cirúrgico com etanol 70% e uma solução de 10% IOD DY DER. Use um bisturi para fazer uma incisão de 1,5 centímetro através do tecido cutâneo, seguida por uma incisão através do tecido muscular. Aplique agora uma leve pressão em ambos os lados da incisão para forçar o rim a sair da cavidade abdominal e mantenha o rim úmido com solução salina.

Mantenha o rim com um cotonete fora da cavidade retroperitoneal e use duas pinças finas para fazer um orifício de dois a três milímetros na cápsula. Em seguida, segurando cuidadosamente a parede da cápsula aberta, deslize cuidadosamente até seis enxertos de lobo timico para baixo, em direção à borda do polo renal e recoloque o rim na cavidade retroperitoneal. Suture o músculo com uma neurose, seguida de sutura da pele com nós cirúrgicos individuais.

Em seguida, umedecer o ferimento com solução de poviodina a 10%, e colocar o camundongo sobre uma placa aquecida a 37 graus Celsius, monitorando o animal e a ferida cirúrgica até que ambos estejam completamente recuperados, para determinar o melhor método para esgotar timócitos endógenos visando o desenvolvimento de precursores colonizadores. Neste experimento, foram comparados os níveis de reconstituição de células T em um lobo tímico colonizado após tratamento com radiação ou com desoxiguanidina por cinco dias. Embora nenhuma diferença no número de linfócitos colonizadores fosse evidente no nono dia de cultura, os lobos irradiados continham mais células T do que aqueles tratados com desoxiguanidina no 12º dia, tornando a irradiação o tratamento preferido para facilitar o desenvolvimento de células T após a colonização tímica, a fim de estudar o potencial de desenvolvimento dos precursores colonizadores do timo em E13 e E18. Neste caso, lobos tímicos irradiados em E14 foram colonizados com um número igual dos dois tipos de precursores. Como observado, os precursores colonizadores do timo em E13 deram origem a menos timócitos e células T duplo-positivas do que os precursores colonizadores do timo em E18.

A frequência de células maduras CD3 positivas, no entanto, foi aumentada e a produção de células T epiteliais dendríticas foi detectada apenas na prole dos progenitores colonizadores do timo no dia E13, para analisar o potencial in vivo dos progenitores colonizadores do timo nos dias E13 e E18. Lobos timicos colonizados com cada tipo de progenitor foram enxertados sob a cápsula renal de receptores knockout para CD3. Conforme acabou de ser demonstrado, como esperado, os progenitores colonizadores do timo no dia E13 deram origem a células T mais rapidamente do que os progenitores do dia E18, embora o número de células T circulantes fosse significativamente menor nos animais colonizados por progenitores colonizadores do timo no dia E13. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia do desenvolvimento explorarem as propriedades de subpopulações de células T, algumas das quais têm origem estritamente embrionária, em um modelo de mamífero.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rastrear as vias diferenciais e funcionais dos progenitores estabelecidos por Timex e sua progênie em um ambiente natural, mesmo sob condições competitivas.