Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando In Vivo E In Vitro Os ensaios

O objetivo geral deste procedimento é analisar a cinética fenotípica de geração e o número de células T produzidas por progenitores de sedimentação tímica E 13 ou E 18. Isso é feito isolando primeiro os lobos tímicos dos embriões de camundongos E 13, E 14 e E 18. Na segunda etapa, os lobos tímicos E 14 são irradiados e, em seguida, colonizados com células E 13 ou E 18 classificadas por fluxo por 48 horas em uma gota suspensa.

Na etapa final, os lobos colonizados são enxertados sob a cápsula renal de camundongos adultos nocaute para CD três. Em última análise, a citometria de fluxo pode ser usada para avaliar a presença da progênie progenitora de sedimentação tímica E 13 e E 18 no sangue dos animais quiméricos. A principal vantagem desta técnica de nossos métodos existentes, como a cultura de células T in vitro em células ine, é que esta técnica combina os métodos que permitem a maturação completa de células T a partir de progenitores definidos em um ensaio tridimensional com a enxertia de culturas de órgãos tímicos em camundongos receptores intactos, permitindo a avaliação da diferenciação e função dos progenitores de fatias tímicas e da progênie.

Como engenheiro de pesquisa com experiência em cirurgia de roedores, estarei demonstrando o procedimento Dois dias antes do experimento de enxerto em uma capela de fluxo laminar, o que o abdômen de uma rata grávida com 70% de etanol e fazer uma incisão longitudinal na pele na linha média, separar a pele para abrir a incisão e, em seguida, usar fórceps e tesouras para abrir o peritônio sem tocar o trato digestivo. Em seguida, retire o útero bífido e use uma tesoura para separá-lo da vagina. Em seguida, coloque o útero em uma placa de Petri de 90 por 15 milímetros contendo 40 a 50 mililitros de DPBS e corte transversalmente entre a decídua de cada embrião.

Use uma tesoura de ponta fina e uma pinça fina para remover a membrana muscular do útero cortando entre a placenta e o saco vitelino para retirar cada embrião. Em seguida, remova o amnio que retém os embriões e coloque os embriões em uma nova placa de Petri contendo HBSS mais 1% FCS. Para isolar o timo, coloque os embriões um de cada vez na posição supina sob uma lente de aumento binocular.

Em seguida, insira uma pinça longitudinalmente ao longo da cartilagem do esterno e aperte e abra a grade torácica usando uma pinça curva. Puxe a parede torácica para o lado para visualizar os lobos tímicos de cada lado da traqueia. Em seguida, aperte embaixo do timo com uma pinça fina para remover cuidadosamente cada lóbulo e coloque-os em uma placa de Petri contendo um mililitro de HBSS mais 1%FCS.

Em seguida, use duas pinças finas para remover o tecido conjuntivo circundante sem danificar os lóbulos. Em seguida, lave os lóbulos em três mililitros de HBSS mais 1%FCS para eliminar os glóbulos vermelhos para iniciar a irradiação da cultura de órgãos tímicos fetais. E 14 lobos tímicos isolados de embriões CD 45.2 como acabamos de demonstrar.

Deixe os lóbulos descansarem por cerca de três horas. Em seguida, gire para baixo os progenitores de decantação tímica E 13 ou E 18 recém-classificados. Suspender novamente o sedimento em meio de cultura até uma concentração final de 500 células por 35 microlitros de meio.

Em seguida, coloque uma gota de 35 microlitros de suspensão celular em todos os outros poços de uma placa terasaki de 60 poços e coloque um lóbulo irradiado na superfície de cada gota. Feche a placa e vire-a de cabeça para baixo para permitir que as células alcancem o pólo apical da gota por gravidade, atingindo suavemente o lado superior da placa invertida para forçar os lóbulos a deslizar para a borda apical da gota. Em seguida, incube a placa invertida em uma incubadora umidificada por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após a colonização dos lobos tímicos, verificar o nível de anestesia do animal receptor por falta de resposta reflexa. Em seguida, coloque uma gota de pomada ocular em cada olho e coloque o mouse do lado direito sob uma capa de fluxo laminar. Em seguida, raspe a área cirúrgica logo acima da articulação da perna traseira.

Em seguida, foi feito um par de luvas estéreis e esterilizou o campo cirúrgico com etanol a 70% e uma solução de DY DER a 10%. Use um bisturi para fazer uma incisão de 1,5 centímetro através do tecido cutâneo, seguida de uma incisão através do tecido muscular. Agora aplique uma leve pressão em ambos os lados da incisão para forçar o rim para fora da cavidade abdominal e manter o rim úmido com solução salina.

Mantenha o rim com um cotonete fora da cavidade retroperitoneal e use duas pinças finas para fazer um orifício de dois a três milímetros na cápsula. Em seguida, mantendo a parede da cápsula aberta com cuidado, deslize até seis enxertos de lobo tímico sob a borda do pólo renal e coloque o rim de volta na cavidade retroperitoneal. Sutura do músculo, uma neurose seguida de sutura da pele com nós individuais do cirurgião.

Em seguida, molhe a ferida com solução de povidona a 10% de iodeto e coloque o camundongo em uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius, monitorando o animal e a ferida cirúrgica até que ambos estejam totalmente recuperados para determinar o melhor método para esgotar os timócitos endógenos para o desenvolvimento de progenitores colonizadores. Neste experimento, os níveis de reconstituição de células T em um lobo tímico colonizado após uma radiação ou um tratamento de cinco dias com desoxiguine foram comparados. Embora nenhuma diferença no número de linfócitos colonizadores tenha sido evidente no nono dia de cultura, os lobos irradiados continham mais células T do que aqueles tratados com desoxiguina no dia 12, tornando a irradiação o tratamento preferido para facilitar o desenvolvimento de células T após a colonização tímica para estudar o potencial de desenvolvimento de progenitores de sedimentação tímica E 13 e E 18 aqui, Os lobos tímicos irradiados E 14 foram colonizados com um número igual dos dois tipos de progenitores, conforme observado, os progenitores de sedimentação tímica E 13 deram origem a menos timócitos e células T duplamente positivas do que os progenitores de sedimentação tímica E 18.

A frequência de células positivas para CD três maduras, no entanto, foi aumentada e a produção de células T epiteliais dendríticas foi detectada apenas na progênie dos progenitores de sedimentação tímica E 13 para analisar o potencial in vivo dos lobos tímicos de sedimentação tímica E 13 e E 18 colonizados com cada tipo de progenitores foram enxertados sob a cápsula renal de receptores de DC três nocaute. Como acabei de demonstrar como esperado. Os progenitores de sedimentação tímica E 13 deram origem a células T mais rapidamente do que os progenitores E 18, embora o número de células T circulantes tenha sido significativamente menor nos animais colonizados por progenitores tímicos E 13 em geral Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia do desenvolvimento explorarem as propriedades do subconjunto de células T, alguns dos quais são de origem embrionária estrita em um modelo de mamífero.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como rastrear os caminhos diferenciais e funcionais dos progenitores de assentamento Timex e sua progênie em um ambiente natural e em condições competitivas.