Name: Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando In Vivo E In Vitro Os ensaios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a caracterizar progenitores timicos em embriões de rato usando ensaios in vivo e in vitro. Este método permite analisar a cinética de geração e fenótipo das células T derivadas desses progenitores.

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Compatível com o Instituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant &#39;Linfopoiese&#39;), a REVIVE Programa de Investimento e Futuro &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Declaração de ética: todos os experimentos foram realizados de acordo com a Carta Ética Instituto Pasteur, aprovado pelo Ministério da Agricultura francês, e com as orientações da UE. Um manipulador com formação em cirurgia pequeno roedor, certificado pelo Ministério da Agricultura francês, executa todas as intervenções cirúrgicas. NOTA: Ver em anexo Quadro 1 mostra o procedimento plano de 5 passos. 1. Selecção dos embriões <ol><li> Use 36 fêmeas C57BL / 6 CD45.2, 12 fêmeas CD45.1, 12 C57BL / 6 do sexo masculino e 12 CD45.1 C57BL / 6 machos CD45.2. Cruzando os fêmeas com qualquer genótipo masculino irá produzir embriões CD45.1 / 2 e CD45.1 usado como uma fonte de TSP CD45.2 ou usado como uma fonte de receptores lóbulos do timo. Casa todos os machos individualmente. </li><li> Para obter embriões para E18 TSP isolamento, coloque 2 fêmeas em uma gaiola com um macho CD45.1 às 6 da tarde, 21 dias antes do experimento enxertia. Verifique a presença de um tampão vaginal no dia seguinte, antes do meio-dia. Sepaavaliar as fêmeas conectados. </li><li> Para obter embriões E14 a ser colonizada por TSP, repita o procedimento acima (1.2), utilizando machos CD45.2, 17 dias antes do experimento enxertia. </li><li> Para obter embriões para isolar E13 TSP, repita o procedimento acima (1.2), utilizando machos C57BL / 6 CD45.1, 16 dias antes do experimento enxertia. </li></ol> 2. Dissecção da Embriões Sob um Horizontal capela de fluxo laminar NOTA: Dois dias antes do experimento enxertia. <ol><li> Sacrificar as fêmeas prenhes por deslocamento cervical ou por administração progressiva de gás CO2 durante pelo menos 5 minutos, numa câmara fechada saturação. Certifique-se de morte por prisão definitiva dos movimentos cardio-respiratória. Molhar o abdômen com etanol 70%. </li><li> Adicione uma incisão longitudinal na pele na linha média do abdómen e abri-lo por puxar a pele separados. Abra o peritoneu com fórceps e tesouras, sem tocar no tracto digestivo. Puxe o uter bífidanos e separá-lo da vagina com a tesoura. </li><li> Inserir o útero num prato de 90 x 15 mm de Petri contendo 40-50 ml de DPBS e cortar transversalmente entre decídua de cada embrião. </li><li> Com a tesoura de ponta fina e uma pinça fina remover a membrana muscular do útero, tirar os embriões cortando entre a placenta eo saco vitelino, e remover os amnios, que está retendo os embriões. </li><li> Colocar os embriões numa placa de Petri de 90 x 15 mm contendo HBSS + 1% de soro fetal de vitelo (FCS). Para os embriões mais velhos do que E15, retire as cabeças com um par de tesouras antes de qualquer outra dissecação. </li></ol> 3. Isolamento do timo <ol><li> Sob a lupa binocular, coloque o embrião, deitado em decúbito dorsal (vista ventral), em uma cama gaze molhada. </li><li> Insira um fórceps longitudinalmente ao longo da cartilagem do esterno, beliscar e abrir a grade torácica. Com uma pinça curva, puxe a parede torácica de lado para visualizar o thymic lóbulos de cada lado da traqueia. </li><li> Segure cuidadosamente cada lobo por beliscar por baixo com uma pinça fina e colocá-los em uma placa de Petri contendo 1 ml de HBSS + FCS a 1%. Isolar os lobos e remover o tecido conjuntivo adjacente com duas seringas de 1 ml + 26 G ⅜ &quot;agulhas, sem danificar a cápsula. </li><li> Lavar os lóbulos em 3 mL de HBSS + FCS a 1% para eliminar as células do sangue. NOTA: Antes E15, lóbulos tímicos estão localizados em cada lado da traqueia e depois fusível no meio para constituir um órgão de bi-lobar. </li></ol> 4. As suspensões celulares <ol><li> Separar os lóbulos sob a lupa binocular, com duas agulhas 26 G montados em seringas de 1 ml, em HBSS + FCS a 1%. Filtra-se a suspensão de células através de uma malha de nylon. </li></ol> 5. Coloração com anticorpos fluorescentes e Seleção celular NOTA: Todos os anticorpos são previamente titulado para obter definição óptima das populações (o titratde iões pode variar de acordo com o lote de anticorpo). <ol><li> Incubar os timócitos (E13 ou E18) durante 15-30 min a 4 ° C com 100 uL de um cocktail de anticorpos biotinilados para corar as células de linhagem positivos (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Para lavar o excesso de anticorpos girar os tubos com 4 mL de HBSS + FCS a 1% a 280 xg durante 7 minutos, para eliminar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em HBSS + FCS a 1%. Voltar a centrifugar. </li><li> Incubar as células marcadas com biotina E18 com microesferas de estreptavidina durante 15 min a 4 ° C e lavar as células duas vezes em HBSS 1% de FCS. Re-suspender as células em 2 ml de HBSS + FCS a 1%. A maioria dos timócitos E13 são linhagem negativa e, portanto, não precisa de MACS enriquecimento antes da separação de células. </li><li> Passar as células na coluna LS, de acordo com as instruções do fabricante. Quando toda a suspensão de células entrou na coluna de adicionar 2 mL de HBSS + FCS a 1%. Recuperar o4 ml da coluna de fluxo, através de centrifugação e as células durante 7 minutos a 280 x g. </li><li> Re-suspender o grânulo de qualquer das empobrecido E18 ou E13 total de timócitos em 50 ul da mistura de TSP anticorpo (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 e estreptavidina APCCy7 Pacific Blue ) e incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Lavam-se as células com 4 mL de HBSS + FCS a 1% e re-suspender as células em 1 mL de HBSS + FCS a 1% com iodeto de propídio. </li><li> Ordenar a TSPs Lin - CD135 + células CD44 + CD117 + CD24 + CD127 baixo em um FACS (com 4 lasers) sobre uma tubos de 1,5 ml contendo 200 ul de meio completo + 20% FCS. Portão primeiro as células de acordo com seu tamanho e granulosidade na FSC e canais ES. Eliminar as células mortas (coloração com iodeto de propídio), porta para fora parelhas e marcar a fluorescência em escalas exponenciais. Cerca de 100 ou 600 TSPs pode ser obtido a partir de um E13 ou E18 um timo, respectivEly. </li></ol> 6. A colonização da E14 Thymic Lobes com Progenitores: Suspensão técnica da gota <ol><li> Irradiar (30 Grays = 30 Gy) E14 lóbulos timo a partir de embriões CD45.2, 3 horas antes da cultura. NOTA: E14 ou E15 lóbulos do timo foram usados ​​com sucesso como receptor de progenitores de células T. Usando receptores de lobos do timo posteriores dias de gestação resulta em necrose prematura devido ao tamanho maior do órgão enquanto lobos do timo nos dias gestacionais mais precoces desenvolver mal, provavelmente devido ao desenvolvimento incompleto das células epiteliais. </li><li> Centrifugar classificados TSP e suspender novamente as células em meio de cultura (meio OPTI-MEM meio completo com 10% de FCS, penicilina (50 unidades / ml), estreptomicina (50 ug / ml) e 2β-mercaptoetanol (50 pM)) de tal modo que 35 ul conter 500 TSP. </li><li> Colocar uma gota de 35 ul de suspensão de células a cada poço de uma outra placa de 60 bem Terasaki. NOTA: 35 gotas ul podem fundir-se se eles são colocados em poços contíguos. </li><li> Inserir um lóbulo irradiado sobre a superfície de cada gota. Feche a placa Terasaki e vire a placa de cabeça para baixo para deixar as células atingem o pólo apical da queda por gravidade. </li><li> Bater suavemente na parte lateral superior da placa invertida para forçar os lóbulos para deslizar para a extremidade apical da gota. Incubar a placa Terasaki invertida numa incubadora humidificada, durante 48 horas a 37 ° C + 5% de CO 2. Após a colonização, ou cultura E14 thymi em FTOC 7, ou enxerto sob a cápsula renal de um rato adulto destinatário 8. </li></ol> 7. Fetal Thymic Órgão Cultura <ol><li> Colocar 3 ml de meio completo numa placa de Petri de 35 mm. Inserir um filtro de membrana isopore flutuante no meio. Colocar os lóbulos reconstituídos na extremidade da membrana com uma pinça (não mais do que oito lóbulos sobre uma membrana). </li><li> Colocar as placas de Petri contendo os lóbulos do timo dentro de um prato de 90 milímetros de Petri, em conjunto com um prato de 35 mm, sem tampa, contendo 2 ml de water, para assegurar a humidade óptima. Incubar 12 dias a 37 ° C + 5% de CO 2. </li></ol> 8. Os enxertos sob a cápsula renal em condições estéreis NOTA: O parênquima renal está rodeado por um tecido conjuntivo que forma uma cápsula. A região sub-capsular é particularmente rica em vasos sanguíneos e linfáticos, proporcionando assim um ambiente adequado para o desenvolvimento de enxertos (por exemplo, lobos do timo, ilhotas pancreáticas ou corações recém-nascidos). Enxertos se realiza no rim esquerdo, porque é mais acessível do que o rim direito. CD3 - / - camundongos machos foram usados ​​como destinatários evitando assim enxerto contra reacção do hospedeiro devido a antígenos de histocompatibilidade menores ligados ao cromossomo Y, porque a determinação do sexo antes de E15 não é feito facilmente. <ol><li> Esterilizar os instrumentos e usa luvas esterilizadas ao longo da cirurgia. Anestesiar o rato por injecção intra-peritoneal de uma solução de cetamina 10 mg / ml + xilazina 1 mg /ml diluído em PBS: (50 a 100 mL por 10 g de peso corporal), utilizando uma seringa de 1 ml. Verifique anestesia, verificando falta de reflexos interdigitais. Coloque uma gota de gel hidro-Optimune em cada olho para prevenir o ressecamento durante a anestesia. NOTA: A solução deve ser preparada extemporaneamente e aquecida à temperatura ambiente antes da injecção. A anestesia dura pelo menos 20 min. O grau de anestesia deve ser controlada ao longo de toda a cirurgia. A anestesia pode ser prolongada por injecção intra-peritoneal de metade da dose a cada 20 min. </li><li> Posicione o mouse sobre o seu lado direito, em uma capela de fluxo lâmina horizontal. Esteriliza-se o campo cirúrgico com etanol a 70% e 10% de solução de iodeto de dérmica. Com uma peça pinça o cabelo do rato ao longo de um comprimento de apenas dois centímetros acima da articulação da perna traseira. Raspar a área cirúrgica. </li><li> Com um bisturi, fazer uma incisão de 1,5 centímetros de comprimento em primeiro lugar, o tecido cutâneo, em seguida, com uma tesoura cortar o tecido muscular. Aplicar uma ligeira pressão a ambos os lados da incisão, O que forçará o rim para fora da cavidade abdominal. </li><li> Aplicar soro fisiológico com um algodão-broto para manter o rim úmido. Se você tiver dificuldades em expor o órgão, use uma pinça planos para retirar o tecido circundante para adipócitos que o rim está ligado. Manter o rim para fora da cavidade retroperitoneal por um cotonete colocado por baixo do órgão. </li><li> Com dois pinça fina, faça um furo 2-3 mm na cápsula (evite tocar no parênquima para evitar sangramento). Durante todo o procedimento cirúrgico manter a cápsula renal exposta continuamente humedecido. </li><li> Insira cuidadosamente os lóbulos sob a cápsula renal, mantendo a parede da cápsula aberta e o enxerto deslize sob a cápsula para o pólo borda. Coloque até 6 lóbulos por rim. </li><li> Substitua o rim na cavidade retro-peritoneal. Suturar as aponeuroses do músculo, em seguida, a pele com nós cirurgião individuais. Molhar a ferida com uma solução de iodeto de povidona 10%. Posicione o mouse em um pa aquecidad a 37 ° C. </li><li> Inquérito sobre o mouse transplantado até a recuperação completa da anestesia pelo controle de cardíacas, respiratórias e suiça movimentos, cores da mucosa até a recuperação total de visto por auto contidos movimentos. NOTA: Recomendamos a injeção de solução analgésica (buprenorfina, 0,1 mg / kg) de músculo intra logo após a cirurgia e os 2 dias após a cirurgia para evitar a dor pós-operatória. </li><li> Mantenha o animal operado em isolamento até que esteja totalmente recuperado. Inspeccionar a cada dois dias os pontos de malha da ferida para verificar e prevenir a infecção. Nunca observada infecção da ferida seguindo este procedimento. NOTA: análise semanal de células de sangue periférico a partir do CD3 - / - murganhos enxertados nos permite detectar o timo populações derivados originado a partir de qualquer E13 ou E18 progenitores usando o marcador CD45 alotípica linhagem de células T e anticorpos específicos (figura 3). </li></ol> 9. Análise da progénie de TSP por Citometria de Fluxo <ol><li&gt; Tease os FTOCs individualmente obter suspensões de células individuais (ver secção protocolo 4). </li><li> Suspensões de células mancha de lobos individuais com uma mistura de anticorpos contendo anticorpos que reconhecem CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE e incubar conforme descrito no capítulo 5. </li><li> Re-suspender as células em HBSS + FCS a 1% + iodeto de propídio e análise de citometria de fluxo (ver resultados na Figura 2). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Dois ensaios principais podem ser usadas para analisar a diferenciação de células T ex vivo. O mais recentemente relatada é a co-cultura de células progenitoras hematopoiéticas, com células estromais da BM, OP9, expressar os ligandos de Noth1 delta, como 1 ou 4 12. Este ensaio de 2-D é fácil de executar, altamente eficientes e sensíveis, permitindo a análise o nível de uma única célula. No entanto, isso nem apoia o desenvolvimento de células T além da fase de DP nem a geração de γδ DETC 13,</sup...

Linfócitos T, tendo o αβ ou o receptor de células T γδ (TCR), em diferenciar um órgão especializado, o timo. O timo totalmente desenvolvido está organizado em duas regiões distintas: o córtex, onde progenitores timo desenvolver e onde timócitos que produtivamente reorganizar a β TcR e genes da cadeia α são resgatados da morte programada (um processo conhecido como seleção positiva); e da medula, onde selecionado timócitos com demasiado forte reatividade a auto-ligantes são excluídos (seleção negativa) 1,2. O timo tem origem a partir da camada endodérmica do terceiro bolsa faríngea posterior que está rodeado por células mesenquimais 3. Ele é colonizada por células progenitoras hematopoiéticas a partir de dia embrionário E12 e, depois disso, o recrutamento contínua é necessária para o desenvolvimento das células T normais 4. Imigrantes timo evoluir através de sucessivos estágios de desenvolvimento, orquestrada por um programa bem regulamentado, iniciado e maintained pela activação da via de sinalização de Notch em timócitos após interacção com o seu ligando, como Delta 4, expressa em células epiteliais tímicas (TEC) 5. Desenvolvimento de timócitos começa no chamado CD4 - CD8 - (DN) estágios dupla negativos. Timócitos DN pode ser subdividida de acordo com a expressão de CD25 e CD44 em DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) e DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) subdivide ainda mais o compartimento DN1 em cinco subconjuntos onde DN1a e b correspondem aos progenitores timo primeiros (PTE). Timócitos reorganizar as δ, β e α cadeias de TCR na fase DN e passam por pré-seleção TcR (estágios DN3-DN4). Eles ainda mais trânsito para o compartimento duplo positivo (DP) CD4 + CD8 +, onde a cadeia α TcR reorganiza antes da sele positivo e negativoction. Nesta fase, a maioria dos timócitos são eliminadas e apenas uma pequena percentagem (3-5%) chegar ao CD4 + ou CD8 + T maduras compartimento da célula. A via de diferenciação linfóide progride através dos estágios de HSCs que geram progenitores multipotentes (MPP) e progenitores multipotentes ferrado-linfóides (LMPP) que perderam o eritrócitos e megakaryocyte potencial 6. LMPP são fenotipicamente definida pela ausência de marcadores celulares no sangue diferenciadas (linhagem negativa, Lin -), a expressão de c-Kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e a ausência de níveis detectáveis ​​de interleucina ( IL) -7 receptor α cadeia (IL-7rα ou CD127). LMPPs diferenciar ainda mais em progenitores comuns linfóides (CLP) 7 que por essa fase perderam a capacidade de gerar células mielóides. CLP reter de linfócitos (células T e B), células NK, células linfóide e DC inata (ILC) potencial, e diferem de LMPP pela expressão de CD127 e a ausência de níveis elevados de Sca-1. Embora a natureza dos timo resolver progenitores (PTS) tem sido amplamente debatido 8, tornou-se recentemente claro que a mudança TSP fenótipo, potencial e função de diferenciação, ao longo do desenvolvimento 9. Foram realizadas in vitro e in vivo em ensaios para caracterizar o TSP, isolado por separação de células a partir de FACS ou E13 (primeira onda) ou E18 (segundo grupo). Fetais culturas de órgãos timo (FTOC) com lobos do timo irradiados colonizados por um número igual de E13 e E18 progenitores, tendo diferentes marcadores alotípicos, autorizada após sua progênie em um ambiente de desenvolvimento semelhantes e revelou propriedades intrínsecas celulares, diferentes entre ambos os tipos de células progenitoras. Lobos do timo colonizados por qualquer E13 ou E18 TSP permitiu o desenvolvimento sem seleção devido à concorrência entre ambos os progenitores. In vivo transplante dos lobos do timo colonizados revelou ainda que também tele progênie madura de E13 e E18 TSP têm diferentes propriedades biológicas in vivo. TSPs da primeira onda gerar rapidamente as células T, mas dar origem a baixos números de células T γδ e αβ. Entre estes últimos foram detectados Vγ5Vδ1 células epiteliais dendríticas T (DETC), que têm um TcR invariante, migrar para a epiderme onde exercem uma função na cicatrização de feridas e só são produzidos durante o desenvolvimento embrionário 10. Em contraste, TSP a partir da segunda onda demorar mais tempo para gerar números elevados de células T + TcR e são incapazes de gerar DETC.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri para cultura de tecidos plásticos de 90 x 15 mm e 35 x 15 mm.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Amostragem</td></tr><tr><td>26 G &frac38; " Seringas de 0,45 x 10 mm com agulhas</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell suspensão</td></tr><tr><td>Pano de aparafusamento de malha de nylon esterilizado peças de 50/50 mm.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtração de células</td></tr><tr><td>Etanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Ações de esterilidade</td></tr><tr><td>Iodeto Povidona 10% (Betadina)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Ações de esterilidade</td></tr><tr><td>Cetamina 100 mg/ml (solução estoque)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/ml em PBS (solução estoque)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Relaxante anestésico e muscular</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/ml solução estoque</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Analgésico morfínico</td></tr><tr><td>Gel oftálmico (0,2% ciclosporina)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Proteção ocular</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>para isolar embriões</td></tr> Solução <tr><td>salina balanceada HBSS Hanks (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>para lavar o sangue e dissecar os embriões</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Meio para culturas</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>aditivo para culturas</td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibióticos para culturas</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>aditivo para culturas</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Microscópio de dissecação</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Fonte de lâmpada fria</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Duas fibras de pescoço de ganso adaptadas</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Almofada de dissecação</td></tr><tr><td>Colher, redonda e perfurada</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>10370-18</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Fine tesoura de íris</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Ferramentas de dissecção</td></tr><tr><td>Fórceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>2 pares de pinças finas retas de relojoeiro Dumont #5 pontas finas de 11 cm.</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>11295-20</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Fio de poliamida com agulha 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>para suturas</td></tr><tr><td>Porta-agulha</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>para suturas</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>Para manter a temperatura do rato durante a anestesia</td></tr><tr><td>Membrana Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>Para</td></tr><tr><td>FTOC Terasaki 60 poços placas</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>Para técnica de gota suspensa</td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze estéreis 7,5 x 7,5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>Para aplicar solução desinfetante</td></tr><tr><td>Anticorpos marcados com fluorescência ou biotina</td><td>BD Biosciences, Biolegend ou e-Biocsiences&nbsp;</td><td>Número do clone veja a tabela abaixo</td><td>Células de coloração</td></tr><tr><td>MACS Colunas / Estreptavidina Microesferas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401 / 130-048-101</td><td>Depleção celular</td></tr><tr><td></td><td>Camundongos Charles Rivers Laboratories (CD45.1) e Janvier Labs&nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OU CD45.2</td><td>Fonte de células e lobos tímicos Camundongos</td></tr><tr><td></td><td>CDTA Orl&eacute; ans, França</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Experiência de enxerto</td></tr></tbody></table>

caracterização de thymic settling progenitores no embrião do rato usando<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; in vitro</em&gt; os ensaios

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Caracterização do timo resolver progenitores é importante compreender as fases de pré-timo de desenvolvimento de células T, essencial para elaborar estratégias de substituição de células T nos pacientes linfopênicos. Foram estudados timo decantação progenitores de murídeo dia embrionário 13 e 18 por dois timos complementar in vitro e in vivo técnicas, ambos com base no método &quot;gota em suspensão&quot;. Este método permitiu colonizar lobos do timo fetal irradiados com E13 e / ou E18 progenitores timo distinguidos por CD45 marcadores alotípicos e, portanto, após a sua progênie. A colonização com populações mistas permitem analisar as diferenças celulares autônomos em propriedades biológicas dos progenitores enquanto colonização tanto com população remove possíveis pressões seletivas competitivos. Os lobos do timo colonizados também podem ser enxertados em ratos imunodeficientes beneficiários do sexo masculino que permitam a análise da progênie de células T maduras in vivo, tais como a dinâmica populacional de tele periféricos do sistema imunitário e colonização de diferentes tecidos e órgãos. Culturas de órgãos timo fetal revelou que progenitores E13 desenvolveu-se rapidamente a toda a amadurecer células CD3 + e deu origem ao subconjunto de células T γδ canônica, conhecidas como células T epiteliais dendríticas. Em comparação, os progenitores E18 tiver uma diferenciação retardada e não foram capazes de gerar células epiteliais dendríticas T. A monitorização do sangue periférico de enxertados do timo CD3 - / - ratos mostraram também que progenitoras E18 tímico sedimentação gerar, com o tempo, um maior número de células T maduras do que as suas contrapartes E13, uma característica que não pode ser apreciado no timo fetal de curto prazo culturas de órgãos.

A fim de escolher um método para esgotar lobos do timo de timócitos endógenos que permitam o melhor desenvolvimento de células progenitoras colonizadoras, comparamos os níveis de T reconstituição celular nos lobos do timo colonizados após a irradiação ou um desoxi-guanosina 5 dias (d-Gua) tratamento. Os resultados mostram que, enquanto não há nenhuma diferença no dia 9 de cultura, lobos irradiados continham mais células T do que aqueles tratados com d-Gua, no dia 12. Assim, a irradiação é mais apropriado do que d-Gua tr...

Este artigo descreve a metodologia in vivo e in vitro para caracterizar os progenitores de decantação tímica pela análise da cinética de geração, fenótipo e número de suas progênies de células T.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a cinética fenotípica da geração e quantidade de linfócitos T produzidos por progenitores colonizadores do timo em E 13 ou E 18. Isso é realizado primeiramente isolando os lobos timicos de embriões de camundongo E 13, E 14 e E 18. Na segunda etapa, os lobos timicos de E 14 são irradiados e, em seguida, colonizados com células de E 13 ou E 18 separadas por citometria de fluxo, durante 48 horas em gota suspensa.No passo final, os lóbulos colonizados são enxertados sob a cápsula renal de camundongos adultos CD três knockout. Em última análise, a citometria de fluxo pode ser utilizada para avaliar a presença dos progênitos colonizadores do timo em E 13 e E 18 na corrente sanguínea dos animais quiméricos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o cultivo in vitro de células T em células ine so, é que este método combina abordagens que permitem a maturação completa de células T a partir de progênitos definidos em um ensaio tridimensional com o enxerto de culturas de órgãos timicos em camundongos receptores intactos, permitindo a avaliação da diferenciação e da função dos progênitos de fatias timicas e de sua prole.Como engenheiro de pesquisa com experiência em cirurgia de roedores, demonstrarei o procedimento. Dois dias antes do experimento de enxerto, em uma capela de fluxo laminar, limparei o abdômen de uma fêmea de camundongo grávida com etanol 70% e farei uma incisão longitudinal na pele na linha média, afastarei a pele para abrir a incisão e, em seguida, usarei pinça e tesoura para abrir o peritônio sem tocar no trato digestivo. Em seguida, retirarei o útero bifurcado e usarei a tesoura para separá-lo da vagina. Depois, colocarei o útero em uma placa de Petri de 90 por 15 milímetros contendo 40 a 50 mililitros de DPBS e farei cortes transversais entre as decíduas de cada embrião.Use uma tesoura de ponta fina e uma pinça fina para remover a membrana muscular do útero, cortando entre a placenta e o saco vitelino, a fim de retirar cada embrião. Em seguida, remova o âmnio, mantendo os embriões, e coloque os embriões em uma nova placa de Petri contendo HBSS mais 1% de FCS. Para isolar o timo, posicione os embriões individualmente em posição supina sob uma lente binocular de aumento.Em seguida, insira uma pin&ccedil;a longitudinalmente ao longo da cartilagem do esterno e pin&ccedil;a e abra a grade tor&aacute;cica utilizando pin&ccedil;as curvas. Puxe a parede tor&aacute;cica para o lado para visualizar os l&oacute;bulos timicos em cada lado da traqueia. Em seguida, pin&ccedil;a abaixo do timo com uma pin&ccedil;a fina para remover cuidadosamente cada l&oacute;bulo e coloque-os em uma placa de Petri contendo um mililitro de HBSS mais 1% FCS.Em seguida, utilize duas pinças finas para remover o tecido conjuntivo ao redor sem danificar os lobos. Depois, lave os lobos em três mililitros de HBSS acrescido de 1% de FCS para eliminar os glóbulos vermelhos e iniciar a cultura de órgão tímico fetal irradiado. Lobos timicos de E14 isolados de embriões CD45.2 conforme demonstrado anteriormente.Deixe as lóbulos repousarem por cerca de três horas. Em seguida, centrifugue os precursores de assentamento timicos recém-separados E13 ou E18. Re-suspenda o pellet no meio de cultura até uma concentração final de 500 células por 35 microlitros de meio.Em seguida, coloque uma gota de 35 microlitros de suspensão celular em cada poço alternado de uma placa terasaki de 60 poços e plaque um lobo irradiado sobre a superfície de cada gota. Feche a placa e vire-a de cabeça para baixo para permitir que as células atinjam o polo apical da gota pela ação da gravidade, batendo suavemente no lado superior da placa invertida para forçar os lobos a deslizarem até a borda apical da gota. Em seguida, incube a placa invertida em uma incubadora umidificada por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após os lóbulos timicos terem sido colonizados, verifique o nível de anestesia do animal receptor pela ausência de resposta reflexa. Em seguida, coloque uma gota de pomada oftálmica em cada olho e posicione o camundongo sobre o lado direito sob uma capela de fluxo laminar. Depois, rape a área cirúrgica logo acima da articulação da pata traseira.Em seguida, coloque um par de luvas estéreis e esterilize o campo cirúrgico com etanol 70% e uma solução de 10% IOD DY DER. Use um bisturi para fazer uma incisão de 1,5 centímetro através do tecido cutâneo, seguida por uma incisão através do tecido muscular. Aplique agora uma leve pressão em ambos os lados da incisão para forçar o rim a sair da cavidade abdominal e mantenha o rim úmido com solução salina.Mantenha o rim com um cotonete fora da cavidade retroperitoneal e use duas pinças finas para fazer um orifício de dois a três milímetros na cápsula. Em seguida, segurando cuidadosamente a parede da cápsula aberta, deslize cuidadosamente até seis enxertos de lobo timico para baixo, em direção à borda do polo renal e recoloque o rim na cavidade retroperitoneal. Suture o músculo com uma neurose, seguida de sutura da pele com nós cirúrgicos individuais.Em seguida, umedecer o ferimento com solução de poviodina a 10%, e colocar o camundongo sobre uma placa aquecida a 37 graus Celsius, monitorando o animal e a ferida cirúrgica até que ambos estejam completamente recuperados, para determinar o melhor método para esgotar timócitos endógenos visando o desenvolvimento de precursores colonizadores. Neste experimento, foram comparados os níveis de reconstituição de células T em um lobo tímico colonizado após tratamento com radiação ou com desoxiguanidina por cinco dias. Embora nenhuma diferença no número de linfócitos colonizadores fosse evidente no nono dia de cultura, os lobos irradiados continham mais células T do que aqueles tratados com desoxiguanidina no 12º dia, tornando a irradiação o tratamento preferido para facilitar o desenvolvimento de células T após a colonização tímica, a fim de estudar o potencial de desenvolvimento dos precursores colonizadores do timo em E13 e E18. Neste caso, lobos tímicos irradiados em E14 foram colonizados com um número igual dos dois tipos de precursores. Como observado, os precursores colonizadores do timo em E13 deram origem a menos timócitos e células T duplo-positivas do que os precursores colonizadores do timo em E18.A frequência de células maduras CD3 positivas, no entanto, foi aumentada e a produção de células T epiteliais dendríticas foi detectada apenas na prole dos progenitores colonizadores do timo no dia E13, para analisar o potencial in vivo dos progenitores colonizadores do timo nos dias E13 e E18. Lobos timicos colonizados com cada tipo de progenitor foram enxertados sob a cápsula renal de receptores knockout para CD3. Conforme acabou de ser demonstrado, como esperado, os progenitores colonizadores do timo no dia E13 deram origem a células T mais rapidamente do que os progenitores do dia E18, embora o número de células T circulantes fosse significativamente menor nos animais colonizados por progenitores colonizadores do timo no dia E13. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia do desenvolvimento explorarem as propriedades de subpopulações de células T, algumas das quais têm origem estritamente embrionária, em um modelo de mamífero.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rastrear as vias diferenciais e funcionais dos progenitores estabelecidos por Timex e sua progênie em um ambiente natural, mesmo sob condições competitivas.

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós apresentamos o passo-a-passo para a geração de quimeras neonatal, bem como a dissecação e preparação do timo ex vivo de imagens por 2-Photon Microscopia.

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Este vídeo demonstra um protocolo para gerar células T funcionais específicas do antígeno a partir de células T imaturas derivadas de iPSC usando um sistema de cultura tímica tridimensional. A co-cultura de células T imaturas derivadas de iPSC com lobos tímicos fetais de camundongos empobrecidos de linfócitos endógenos resultou em maturação bem-sucedida das células T para formar emigrantes tímicos derivados de iPSC CD8αβ + MHC classe I + iPSC.

Sistema de cultura tímica tridimensional para gerar emigrantes tímicos derivados de iPSC

As células-tronco embrionárias de camundongos podem ser diferenciadas em células T in vitro usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. O sucesso neste procedimento requer atenção cuidadosa à manutenção do reagente/célula e às principais etapas sensíveis à técnica. Aqui, discutimos esses parâmetros críticos e fornecemos um protocolo detalhado para incentivar a adoção dessa tecnologia.

Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias

O estudo de células epiteliais tímicas medulares in vitro não teve sucesso, pois os sistemas de cultura 2D atuais não imitam o cenário in vivo. O sistema de cultura 3D aqui descrito - um modelo de cultura organotípica de pele modificada - provou ser superior na recapitulação da proliferação, diferenciação e manutenção da expressão gênica promíscua.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

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Este artigo fornece um método para isolar tecidos embrionários puros de codorna e galinha de embriões que podem ser combinados para formar ex vivo de órgãos quimérico.

Isolamento de tecidos embrionários e formação de órgãos quiméricoes codorna-frango, usando o exemplo do Timo

Aprenda a caracterizar progenitores timicos em embriões de rato usando ensaios in vivo e in vitro. Este método permite analisar a cinética de geração e fenótipo das células T derivadas desses progenitores.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando

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