Name: Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a avaliar enxertos de engenharia tecidual para reconstrução do ligamento cruzado anterior utilizando um modelo de rato. Este método permite analisar a integração do scaffold biodegradável e a resistência biomecânica do neo ligamento formado após 16 semanas de implante.

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Os autores gostariam de agradecer Gabriel Arom e Michael Yeranosian por suas contribuições técnicas para iterações anteriores deste projeto. Este projecto foi financiado pelo OREF Clínico Scientist Training Grant (NL), HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR &amp; D Mérito comentário 1 I01 BX00012601 (DM) e Musculoskeletal Transplantation Foundation Young Investigator Award (FP).

NOTA: Todas as cirurgias animais foram aprovados pela equipe e animal veterinário comitê de uso local, antes do início dos experimentos. 1. Preparação de electrospun Policaprolactona Andaimes <ol><li> Pesar e dissolver de grau médico de poli éster terminado (ε-caprolactona) em forma de grânulo em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, para criar uma 10% w / w solução do polímero PCL. Deixe a solução agitar utilizando uma placa de agitação durante pelo menos 3 h para assegurar uma solução homogénea. </li><li> Electrospin a solução PCL para criar um manguito de fibras PCL altamente alinhadas para a fabricação de andaime. <ol><li> Prepare a configuração electrospinning em um exaustor química com o ventilador ligado em todos os momentos. Este consiste em uma grande caixa de acrílico, que servirá como um meio isolado a vácuo para o processo de electrospinning e tem pontos de entrada para a solução de fonte PCL impulsionado por uma fonte de tensão, o mandril coletando a motor, e uma porta de vácuo. Limpe o acrylicaixa c cuidadosamente com etanol e cobrir todas as superfícies com folhas de Parafilm para remover quaisquer impurezas que podem comprometer a qualidade do produto electrospun. </li><li> Carga de aproximadamente 3 ml da solução anterior em uma seringa de 10 ml com um rombo 18 L, 1 ½ polegada agulha. Remova as bolhas de ar, empurrando a seringa para cima. Solução de bloqueio em uma bomba de seringa programável. Insira a agulha através de um pequeno buraco na caixa de acrílico, deixando cerca de ½ polegada da agulha fora da caixa de acrílico para fixação do fio de fonte de tensão. </li><li> Use a 30 milímetros girando mandril Torno como o coletor para as fibras do LCP altamente alinhados; cobrir o mandril firmemente com uma fina tira de papel alumínio. Bloquear o mandril no interior do motor, no lado oposto da caixa de cerca de 15 cm de distância a partir da agulha de uma seringa. </li><li> Insira a mangueira de plástico na porta de vácuo e se conectar à fonte de vácuo coifa. Ligar a fonte de vácuo e cobrir a caixa de acrílico com uma tampa. </li><li> Set a velocidade da bomba de seringa programável de 2,5 ml / h de infusão. Ligue o motor para operar o mandril a 3.450 rpm e anexar o fio positivo da fonte de tensão para a ponta da agulha fora da caixa usando um jacaré. </li><li> Uma vez que a infusão da solução PCL começou, ligue a fonte de tensão e definir a tensão de operação de 20 kV. </li><li> Infundir a solução durante 12 minutos para criar uma braçadeira homogénea a partir de 0,5 ml da solução de PCL. NOTA: Em média, cada canhão tem material de electrospun suficiente para criar duas folhas de seis lâminas, que podem ser utilizados para criar um total de três suportes de quatro camadas. </li></ol></li><li> Laser cortar o manguito PCL para formar várias pequenas folhas em um VersaLaser Cortador 2.3 operado a configuração de baixa vácuo, tensão pouso 10,0 keV, 6,4 mm de distância de trabalho, e diâmetro da sonda de 3,0. NOTA: Neste exemplo, um desenho assistido por computador foi utilizado para instruir o cortador para produzir várias folhas de 1,5 mm x 35 mm x 150 mm com andaimesuniformemente distribuídos 150 mm de diâmetro nos 15% de área de poros. </li><li> Plasma gravar os scaffolds PCL usando um aspirador de plasma para induzir a hidrofilicidade da superfície PCL com aceleração de íons. Defina a vácuo para 450 mTorr e o deleite dos andaimes para 30 segundos a alta potência (29,6 W). </li><li> Banhe os andaimes em etanol a 70% em um ambiente estéril. </li><li> Brasão os andaimes individuais com colágeno para facilitar a adesão e proliferação celular in vivo. <ol><li> Criar uma solução de revestimento de colagénio por diluição de um 8: solução estéril de 2,5 Purecol colagénio de 3 mg / ml de solução-padrão, 10x PBS e NaOH 0,1 N 1:: 1 9 em 1x PBS a 4 ° C. Misturar bem com a solução de assegurar homogeneidade. </li><li> Casaco indivíduo 1,5 milímetros x 35 mm x 150 mm andaimes com uma película de camada fina da solução de colagénio acima. Deixa-se secar durante 24 horas em um ambiente estéril. </li></ol></li><li> Usando 5-0 Vicryl, empilhar e apor quatro indivíduo 1,5 milímetros x 35 mm x 150 mm scaffoldsusando um Krackow pontos para criar uma final 0,6 milímetros multi-camadas, andaime de espessura, revestido de colágeno, que está pronto para a implantação. </li></ol> 2. Rat Cirurgia Protocol <ol><li> Induzir a anestesia, colocando rato na câmara de inalação e entrega de 2% de isoflurano com 2 L / min de oxigênio. Confirme o rato está devidamente anestesiados pela aplicação de pressão a pata traseira e avaliação para qualquer resposta. </li><li> Na mesa de volta não estéril, subcutaneamente injectar 25 mg / kg de ampicilina e 0,03 mg / kg de buprenorfina. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para os olhos. Clipe da pele do membro posterior operatório e preparar o sítio cirúrgico com três esfrega alternadas de clorexidina e etanol 70%. </li><li> Transfira o rato para a mesa de operação, em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Nariz cone seguro e manter a anestesia através do procedimento com 2% de isoflurano em 2 L / min de oxigênio, entregue cone do nariz. Drapejá de uma forma estéril, deixando o membro operativo exposta. </li><li&gt; Antes de iniciar a cirurgia, primeiro, confirmar anesthetization adequada por falta de uma resposta à pressão do pé traseiras. </li><li> Adicione uma 2 cm de comprimento incisão média vertical para o joelho, centrado no nível da rótula. Retirar a pele lateralmente até a incisão é centrado sobre o joelho. </li><li> Usar um bisturi para fazer uma artrotomia parapatelar medial cortando apenas medial para a patela e estendendo-se proximalmente para o nível da junção músculo do quadríceps e distal ao nível da inserção do tendão patelar sobre o tubérculo tibial. Tome cuidado para não cortar os patelares ou quadríceps tendões. </li><li> Patela libertação lateralmente através de uma incisão vertical 1 cm para dentro da cápsula do joelho imediatamente lateral do tendão patelar. </li><li> Verifique se o joelho é estendido. Pegue um par de tesouras finas e passar sob a patela de lateral para medial. Espalhe a tesoura algumas vezes para que o mecanismo extensor pode ser traduzido para ambos os lados. </li><li> Enquanto flexionando tele joelho, traduzir a patela lateralmente para expor o interior da articulação do joelho. Certifique-se de clara visualização da fossa intercondilar e côndilos do fêmur. Usando um bisturi, transecto a ACL e PCL no entalhe. </li><li> Carga furadeira com uma k-wire 1,6 milímetros. Coloque ponta k-fio no ACL origem na fossa intercondilar. Broca superolaterally e visualizar o ponto de saída na face lateral do fêmur, a remoção de todo o tecido macio, se necessário com um bisturi. Passe o fio k dentro e fora algumas vezes para garantir a passagem livre para o enxerto. </li><li> Coloque o fio k sobre a pegada ACL no platô tibial. Broca anterolateralmente e visualizar ponto de saída na tíbia proximal ântero-lateral. Use bisturi para limpar tecidos moles como necessário de modo que o ponto onde o fio de k-sai da tíbia é completamente visualizada. </li><li> Passe uma agulha encurtado Keith (o ideal é não mais do que 2 centímetros de comprimento) através do túnel do osso femoral. Passe as duas pontas de sutura de uma extremidade do enxerto através do olho da Kagulha eith. Usar a agulha para puxar uma extremidade do enxerto através do túnel femoral. </li><li> Repetir o passo anterior para passar a outra extremidade do enxerto através do túnel tibial. </li><li> Use 4-0 Vicryl sutura para fixar o fim femoral do enxerto ao redor periósteo ou outros tecidos moles com um ponto a figura de oito. Tensão manualmente o enxerto com o joelho em extensão. Apor o fim tibial do enxerto de periósteo circundante ou outro tecido mole com um ponto figura em forma de oito. </li><li> Utilize uma tesoura para cortar o excesso de enxerto em ambas as extremidades, deixando 1-2 mm em cada extremidade passado o ponto figura em forma de oito. </li><li> Estenda o joelho e reduzir a patela. Usando 4-0 vicryl, coloque um ponto único figura de oito para fechar a cápsula articular medial, impedindo subluxação lateral da patela. </li><li> Feche a pele com um subcuticular 5-0 Monocryl ou Vicryl sutura contínua, com cuidado para não suturar o músculo subjacente ou ter qualquer sutura visível uma vez que a pele é fechada. </li><li> Inject ratos por via subcutânea com buprenorfina cada 12 horas para um total de três dias de pós-operatório. Verificar local cirúrgico para a drenagem ou deiscência da ferida no momento da injecção. Mancando e algum inchaço é normal nos primeiros dias após a cirurgia, mas prontamente quaisquer preocupações pós-operatórias em conjunto com o pessoal veterinário. O animal pode ser retornar à habitação social em 2 semanas de pós-operatório, quando incisões cirúrgicas são completamente curado. </li></ol> 3. Protocolo de Coleta de Dados <ol><li> No momento do sacrifício, asfixiar ratos individualmente numa câmara fechada de CO 2, seguida por toracotomia. </li><li> Colha os dois membros cirurgicamente reconstruídos e contralateral, separando na articulação do quadril. <ol><li> Para os membros reconstruídos, remover todo o tecido mole, incluindo o ligamento cruzado posterior e os remanescentes da ACL nativa interrompido cirurgicamente, por dissecção fina para isolar apenas o fêmur, tíbia, e enxerto. </li> &lt;li&gt; Para os membros contralaterais, remover todo o tecido mole, exceto o ACL nativa assim como o fêmur ea tíbia por dissecção bem. </li><li> Utilize uma ferramenta rotativa, tais como Dremel, para remover todos, mas ¾ de 1 cm de osso a partir de cada extremidade do fémur complexo tíbia-enxerto. </li><li> Durante este processo, e ao longo do teste biomecânico, regular e frequentemente pulverizar as regiões ligamentares com salino normal para evitar a dessecação do joelho colhidas que podem alterar os resultados falsamente. </li></ol></li><li> Para a análise histológica, fixar cada joelho individualmente em solução de paraformaldeído a 4% a 25 ° C durante 48 h. Em seguida, submergir o joelho em uma solução de reagente para Immunocal descalcificação completa; este processo é dependente do conteúdo de calcificação da amostra e pode levar até cinco dias. Verifique amostras individuais diariamente para avaliar o progresso como descalcificação incompleta pode reduzir a qualidade da amostra. Uma vez completo, executar o corte, montagem de slides, e coloração se o desejar. </li><li> Perform testes biomecânicos para avaliar a capacidade funcional do ligamento da engenharia de tecidos. <ol><li> Prenda o fêmur ea tíbia enrolando 28 G arame de aço galvanizado em torno da epífise de cada osso em separado. Isso é para evitar que os dados de testes biomecânicos imprecisas de falha de tração prematura da amostra com o osso em vez de no ligamento de interesse. </li><li> Pot o fêmur em uma mistura de cimento de polimetilmetacrilato (PMMA) osso. Para fazer isto, misturar os dois componentes de cimento e utilizar imediatamente a mistura viscosa para fixar o fémur no interior do metal, que encerra completamente a diáfise do osso no pote cimentada com a epífise e ligado ligamento saliente livremente. Permitir espontânea polimerização por radicais livres de transformar gradualmente os componentes viscosos misturadas a um material pastoso e, eventualmente, em uma matriz sólida endurecido. NOTA: Este processo leva vários minutos e pode ser monitorado por avaliação manual da temperatura de um bolo feito a partir deo restante cimento; a temperatura deve aumentar transitoriamente durante a reacção de polimerização exotérmica e diminuem para a TA, depois os material solidifica. </li><li> Repita o mesmo processo acima para cimentar a tíbia, com exceção, mantendo o ligamento do joelho em 20 ° de flexão para o teste mecânico ideal. </li><li> Monte o complexo fêmur-enxerto-tibial cimentada em um aparelho de ensaio de tração, e se preparar para carga recorde e deslocamento em função do tempo a partir do início de tensão ao fracasso. Neste exemplo, foi utilizado um modelo Instron 5564 com uma célula de carga de 1 kN. </li><li> Pré-tensão do enxerto a 2 N a uma velocidade de rampa de 0,5 N / min e, em seguida, para testar o enxerto falha a uma velocidade de deformação de 0,5 mm / seg. Durante o processo, certifique-se que o ligamento está falhando em meados da década de substância e que o fêmur e da tíbia óssea são seguras e não prematuramente falhando, o que pode inaccurately avaliar as propriedades biomecânicas do ligamento testado. </li><li> Use a carga-deslocamento geradocurvas para calcular a carga de ruptura e de rigidez do ligamento testado. </li></ol></li></ol>

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<li>Brophy, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+short-duration+low-magnitude+cyclic+loading+versus+immobilization+on+tendon-bone+healing+after+ACL+reconstruction+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model.</a> J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Lesões do LCA é uma condição comum em cirurgia ortopédica de esportes, com opções limitadas de Reconstrução, com o tempo presente. A fim de desenvolver um substituto apropriado da engenharia de tecidos para a ACL que irá permitir a regeneração in vivo, num modelo animal adequado é necessária. Neste estudo, a fabricação de um enxerto de engenharia biodegradável é descrita, como é o seu implante in vivo utilizando um modelo reprodutível de reconstrução ACL em um rato atímico. Este modelo pode ser utiliza...

A ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA) é uma das mais comuns de lesões ligamentares do joelho 1. Porque a ruptura do LCA é incapaz de curar sem intervenção cirúrgica, as limitações nas atividades da vida diária, bem como a participação em esportes de carro mais de 175.000 pacientes submetidos à cirurgia a cada ano 2, com um custo estimado de um bilhão de dólares por ano 3. Atualmente, qualquer auto-enxerto ou enxerto de tendão é usado para a reconstrução do ligamento. Embora altas taxas de sucesso pode ser alcançado com tanto auto-enxerto e enxerto de substituição, complicações graves estão associados com estas opções de reconstrução 4. Tecido auto-enxerto é associado com área doadora morbidade e é limitado em oferta, especialmente em casos de re-ruptura ou lesão multi-ligamentar. Por outro lado, o tecido do enxerto está ligada com a integração do enxerto retardada, a resposta inflamatória adverso, o risco infeccioso teórica, e supp limitadoly 5. Enxertos não degradáveis ​​sintéticos foram desenvolvidos na década de 1970 e 1980, mas foram prejudicados pela ruptura prematura do enxerto, reações de corpo estranho, osteólise, e sinovite 6. Como resultado dessas preocupações sérias, não existem actualmente enxertos sintéticos disponíveis para uso clínico nos Estados Unidos. Devido a essas limitações com opções de enxerto existentes e aos desenvolvimentos recentes em biologia, engenharia e medicina regenerativa, tem havido grande interesse em uma solução de engenharia de tecidos para ACL enxertia. Estratégias de engenharia de tecidos actuais empregam materiais biológicos e sintéticos biodegradáveis ​​para permitir o crescimento interno de tecido do hospedeiro, evitando as limitações associadas com o implante de material sintético permanente 7. Policaprolactona (PCL) é um polímero biodegradável que é aprovado pela FDA para um número de aplicações médicas, incluindo barreira de adesão e curativos 8, que tem sido used em uma ampla variedade de aplicações, incluindo vasculares, osso, cartilagem, nervo, pele, tecido esofágico e engenharia 5,9-16. Biocompatibilidade favorável, relativamente longa in vivo meia-vida, a força mecânica adequada, e uma elevada elasticidade contribuir para a popularidade deste polímero em engenharia de tecidos. Em um modelo de roedor de cicatrização de feridas, implantado PCL electrospun foi demonstrado ser não imunogénico e para integrar no tecido local, sem reacções adversas 13. Uma imagem SEM de electrospun PCL é mostrado na Figura 1. Com atual FDA regulamentar normas, eficácia e segurança em ambos os pequenos e grandes modelos animais seria necessário para um PCL ou qualquer outra ACL enxerto projetado para mover-se em ensaios clínicos nos Estados Unidos. Além disso, condições in vivo pode muitas vezes aumentar as propriedades de um ACL enxerto de tecido in vitro engenharia. Um modelo de rato de reconstrução do LCA autólogo com flexor digitorhum longus tendão foi descrito anteriormente, em que o ACL nativa foi cortada, femorais e tibiais túneis foram perfurados, e o enxerto foi aprovada e fixada no local com sutura 17-22. Neste artigo, iremos descrever uma modificação deste modelo para a avaliação de substituições ACL engenharia em vez de para a reconstrução à base de auto-enxerto (Figura 2). Apesar de existirem muitos modelos animais para a engenharia de tecidos ligamento, o rato é vantajosa em relação aos modelos maiores para um número de razões. Essas vantagens incluem mais fácil criação e manipulação, menos considerações éticas, e reduziu 17,23 custo. Além disso, o modelo do rato tem sido utilizada extensivamente como um modelo para a regeneração do tecido ortopédico, incluindo cartilagem, tendão, e engenharia de tecidos ósseos 24. Em particular, os ratos nus atímicos foram escolhidos devido à sua falta de resposta mediada por células imunes de 25, permitindo a eventual implantação océlulas dadoras xenogénicas f neste modelo para aumentar ainda mais o enxerto engenharia no futuro. Neste trabalho métodos, descrevemos a fabricação e implantação cirúrgica de um acelular, enxerto polímero biodegradável em um modelo de rato atímica de reconstrução do LCA.

<table><tbody><tr><td>éster terminado de poli de grau médico (&amp;epsilon;-caprolactona), forma de grânulo (MW = 110.000)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Polímeros Absorvíveis Lactel</a></td><td></td><td>Polímero sintetizado sob encomenda com peso molecular desejado</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td>Solvente para polímero PCL</td></tr><tr><td>18 G x 1&amp;#189;agulha biselada</td><td>BD Medical</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Seringa Programável para Infusão/Retirada Remota</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser VLS2.30 Gravadora a Laser</td><td>Microgeo EUA</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Expanded Plasma Cleaner 115&amp;nbsp;V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Reativo de plasma imediatamente antes do revestimento com colágeno para modificação da superfície</td></tr><tr><td>Solução Padrão de Colágeno PureCol, 3&amp;nbsp;mg/ml</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5015-A</td><td>Misture uma solução 8:1:2,5 de PureCol, PBS 10x, 0,1&amp;nbsp;N NaOH 1:9 em PBS 1x</td></tr><tr><td>Sutura, Vicryl 5-0</td><td>Henry Schein</td><td>1086471</td><td></td></tr><tr><td>Sutura, Vicryl 4-0</td><td>Henry Schein</td><td>6540072</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação de ponta fina (reta; 4,5&amp;nbsp;polegada</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de buprenorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9275</td><td>Utilize 0,03 mg/kg tanto intraoperatória quanto pós-operatória para controle da dor</td></tr><tr><td>Ampicilina, injetável</td><td>Henry Schein</td><td>1185678</td><td>Usar 25 mg/kg por via subcutânea durante o procedimento</td></tr><tr><td>K-wire, 1,6 mm</td><td>Spectrum Surgical</td><td>SI040062</td><td></td></tr><tr><td>Keith Needle, Reto 1&amp;#189;"</td><td>Delasco Dermatology Lab &amp;amp; Fornecimento</td><td>KE-112</td><td></td></tr><tr><td>Solução Desmineralizante Immunocal</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491030</td><td></td></tr><tr><td>Cimento ósseo de resina acrílica Opticryl (PMMA) (monômero e polímero)</td><td>US Dental Depot</td><td>OPTICRYL 100410&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de Ensaios de Tração Instron Modelo 5564</td><td>Instron</td><td>5564</td><td>Qualquer aparelho de ensaio de tração comparável é adequado</td></tr></tbody></table>

atímica rat modelo de avaliação da engineered ligamento cruzado anterior enxertos

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

A ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA) é uma lesão ligamentar comum que geralmente requer cirurgia porque o LCA não cicatriza bem sem intervenção. As estratégias de tratamento atuais incluem reconstrução ligamentar com autoenxerto ou aloenxerto, cada um com suas limitações associadas. Assim, há interesse em projetar um enxerto de engenharia tecidual para uso na reconstrução do LCA. Descrevemos a fabricação de um enxerto de polímero eletrofiado para uso na engenharia de tecidos do LCA. Este enxerto de policaprolactona é biocompatível, biodegradável, poroso e é composto por fibras alinhadas. Como um modelo animal é necessário para avaliar tal enxerto, este artigo descreve um modelo de reconstrução do LCA em ratos atímicos intra-articulares que pode ser usado para avaliar enxertos projetados, incluindo aqueles semeados com células xenogênicas. São apresentados resultados representativos de histologia e testes biomecânicos com 16 semanas de pós-operatório, com enxertos testados imediatamente após o implante e LCAs nativos contralaterais servindo como controles. O presente estudo fornece um modelo animal reprodutível para avaliar enxertos de LCA com engenharia de tecidos e demonstra o potencial de uma abordagem de medicina regenerativa para o tratamento da ruptura do LCA.

Em nossa experiência de 92 cirurgias de ratos por um único cirurgião, o tempo médio operatório da incisão para a conclusão da ferida foi de 16,9 min, com um desvio padrão de 4,7 min. No momento do sacrifício, os ratos pesavam 356 ± 23 g. Todos os ratos toleraram bem a cirurgia, e experiente sem complicações. Imediatamente após a cirurgia, os ratos foram anotados para suportar o peso sobre a extremidade operatório, mas exibiu um ligeiro coxear. Por uma semana de pós-operatório, todos os ratos foram deambulando sem mancar...

Modelos animais são ferramentas importantes para a avaliação de enxertos de engenharia tecidual. Este trabalho apresenta o protocolo de preparação de um enxerto de polímero biodegradável eletrofiado para uso na engenharia de tecidos do ligamento cruzado anterior, bem como um protocolo cirúrgico para implantação em modelo de rato.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é utilizar um modelo roedor para avaliar enxertos de tecido engenheirado para substituição do ligamento cruzado anterior. Isso é realizado primeiramente fabricando um suporte polimérico biodegradável. Na segunda etapa, o suporte é implantado no joelho de um rato.Após 16 semanas, os ligamentos neoformados a partir do suporte são coletados para análise histológica. Em última instância, a resistência biomecânica do colágeno é testada para avaliar a qualidade desses enxertos produzidos por engenharia tecidual para uso na reconstrução do LCA. As principais vantagens desta técnica em comparação com outros métodos de avaliação de suportes são que este modelo expõe o suporte ao complexo ambiente in vivo, sendo ao mesmo tempo economicamente viável e mais fácil de manipular do que modelos animais maiores.Este modelo pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da engenharia de tecidos, como, por exemplo, como um suporte projetado irá se integrar ao ambiente in vivo para formar um neo-ligamento? Esta técnica pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos e à reconstrução do ligamento cruzado anterior. Como modelos animais pequenos são o primeiro passo rumo à aplicação clínica, este método pode ser utilizado para avaliar nosso suporte específico.Ele também pode ser aplicado a outros enxertos bioengenheirados, como aqueles com células e fatores de crescimento. Otimizamos a técnica cirúrgica modificando os métodos empregados pelo Dr. Scott Rodeo e colegas no Hospital for Special Surgery em Nova York. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de eletrofiação e cirúrgicas podem ser difíceis de aprender apenas com instruções escritas.Ao eletrofiar scaffolds de policaprolactona, será necessário um grande recipiente de acrílico com pontos de entrada para a solução fonte de policaprolactona, um mandril coletor movido a motor e uma saída de vácuo acionada por uma fonte de tensão, colocados dentro de uma cabine de exaustão química, para atuar como um meio de vácuo isolado para o processo de eletrofiação. Antes de iniciar o procedimento, limpe o recipiente cuidadosamente com etanol 70% e cubra todas as superfícies com folhas de filme parafilm para remover quaisquer impurezas que possam comprometer a qualidade do produto eletrofiado.Em seguida, ligue o ventilador e carregue três mililitros de polímero de policaprolactona recém-preparado em uma seringa de 10 mililitros com agulha romba de 18 calibres. Após remover todas as bolhas de ar, fixe a solução em uma bomba de seringa programável e insira a agulha na caixa de acrílico através da porta de entrada, deixando cerca de meio centímetro da agulha fora da caixa. A seguir, cubra firmemente o mandril rotativo com uma tira fina de papel alumínio e fixe o mandril no motor no lado oposto da caixa, a cerca de 15 centímetros de distância da agulha da seringa, para atuar como coletor; insira uma mangueira plástica na porta de vácuo.Em seguida, conecte a mangueira à fonte de vácuo da capela e ligue-a. Agora, cubra a caixa de acrílico com a tampa e ajuste a taxa de infusão da bomba de seringa programável para 2,5 mililitros por hora. Depois, aterre o cabo negativo, ligue o motor para operar o mandril a 3.450 RPM e use um clipe de crocodilo para conectar o cabo positivo da fonte de tensão à ponta da agulha fora da caixa.Uma vez iniciada a infusão da solução de policaprolactona, ligue a fonte de tensão e ajuste-a para uma tensão operacional de 20 quilovolts. Após 12 minutos de infusão, uma bainha homogênea será formada a partir de 0,5 mililitros da solução de policaprolactona. Desligue todos os equipamentos, incluindo tensão, fonte, motor, vácuo e bomba de seringa.Remova o mandril do motor, remova a bainha polimérica do mandril e faça um único corte transversal, obtendo um tapete eletrofiado retangular. Em seguida, corte o tapete com laser para formar várias folhas pequenas, que posteriormente são cortadas em tiras empilhadas com quatro camadas de espessura e suturadas para formar os suportes antes do início da cirurgia. Primeiro, confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta à pressão no pé traseiro.Em seguida, faça uma incisão vertical de dois centímetros de comprimento medial ao joelho, centrada ao nível da patela, retratando a pele lateralmente conforme necessário. A seguir, use um bisturi para realizar uma artrotomia medial para-patelar logo medial à patela, estendendo-se proximalmente até o nível da junção músculo-tendínea do quadríceps e distalmente até o nível da inserção do tendão patelar na tuberosidade tibial. Agora, faça uma incisão vertical de um centímetro através da cápsula do joelho logo lateral ao tendão patelar para liberar a patela lateralmente.Em seguida, garantindo que o joelho esteja estendido, passe uma tesoura fina sob a patela de dentro para fora, da lateral para a medial, e abra e feche a tesoura algumas vezes para que o mecanismo extensor possa ser deslocado para um dos lados durante a flexão do joelho. Desloque a patela lateralmente para expor o interior da articulação do joelho, confirmando uma visualização clara do entalhe intercondilar e dos côndilos femorais. Em seguida, seccione o ligamento cruzado anterior (LCA) e o ligamento cruzado posterior (LCP) no entalhe.Agora, posicione a ponta de um fio K de 1,6 milímetro acoplado a um tornozeleira na origem do LCA na escotadura intercondilar e fure em direção superolateral enquanto um assistente estabiliza o joelho. Em seguida, passe o fio K para dentro e para fora algumas vezes para garantir uma passagem livre para o enxerto. Visualize o ponto de saída na face lateral do fêmur, removendo qualquer tecido mole conforme necessário com uma lâmina de bisturi.Quando o túnel estiver livre, posicione o fio de Kirschner na inserção do LCA na placa tibial e fure lateralmente enquanto um assistente estabiliza o joelho. Em seguida, visualize o ponto de saída na tíbia proximal anterolateral utilizando o bisturi para remover o tecido mole conforme necessário, de modo que o ponto onde o fio de Kirschner sai da tíbia fique totalmente visível, e passe uma agulha de Keith encurtada, com no máximo dois polegadas de comprimento, através do túnel ósseo femoral. Agora, passe as duas extremidades da sutura de uma das pontas do enxerto através do olho da agulha e use a agulha para puxar uma extremidade do enxerto através do túnel femoral.Em seguida, use a agulha para passar a outra extremidade do enxerto através do túnel tibial utilizando um fio de sutura Vicryl quatro zero. A seguir, fixe a extremidade femoral do enxerto ao tecido mole circundante com um ponto em oito, mantendo o joelho em extensão para criar tensão manual no enxerto. Utilize outro ponto em oito para fixar a extremidade tibial do enxerto ao tecido mole adjacente, cortando o excesso do enxerto em ambas as extremidades com uma tesoura e deixando um a dois milímetros além do ponto em cada extremidade.Finalmente, estenda o joelho e reduza a patela. Em seguida, utilizando um fio de Vicryl 4-0, faça um único ponto em oito para fechar a cápsula articular medial, prevenindo a subluxação lateral da patela, e feche a pele com um ponto subcuticular contínuo de Monocryl 5-0 ou Vicryl. Aos 16 semanas após a reconstrução, a análise histológica do joelho seccionado demonstra que a matriz do suporte torna-se amplamente infiltrada por fibroblastos, que secretam colágeno eosinófilo com boa integração nos túneis ósseos.Neste experimento, as propriedades biomecânicas da articulação foram avaliadas imediatamente após o sacrifício. Todas as amostras testadas falharam na substância média, utilizando curvas de baixo deslocamento geradas a partir do ensaio de tração. A carga de falha e a rigidez foram calculadas para cada grupo.Após 16 semanas do implante, o enxerto de polímero esponja eletro tinha aproximadamente dobrado a carga máxima e a rigidez do enxerto testado imediatamente após o implante. Embora esses valores ainda fossem inferiores aos do LCA nativo, uma vez dominada, a cirurgia em animais pode ser realizada em aproximadamente 15 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar um bom fechamento no qual nenhum ponto seja visível do lado externo.Após este procedimento, outras análises finais, como colorações adicionais e ensaios bioquímicos, podem ser realizadas. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de engenharia de tecidos avaliarem múltiplas opções de enxertos para a reconstrução do LCA. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar um suporte polimérico para implante em um modelo roedor de reconstrução do LCA.Não se esqueça de que trabalhar com animais vivos pode ser perigoso, e que precauções, como seguir as recomendações veterinárias e usar equipamentos de proteção individual, devem ser tomadas em todos os momentos durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Para aplicações futuras como um remendo para reparar ruptura parcial do ligamento cruzado anterior (LCA), LCA humano células derivadas foram isolados a partir de tecidos obtidos durante procedimentos reconstrutivos, expandidas in vitro e cultivados em engenharia de tecidos andaimes. Adesão celular e morfologia foi então realizada para confirmar a biocompatibilidade na superfície andaime.

Recuperação cirúrgica, isolamento e<em&gt; In vitro</em&gt; Expansão de humanos anteriores Cruciate células do ligamento derivados para aplicações em engenharia de tecidos

Aprenda a avaliar enxertos de engenharia tecidual para reconstrução do ligamento cruzado anterior utilizando um modelo de rato. Este método permite analisar a integração do scaffold biodegradável e a resistência biomecânica do neo ligamento formado após 16 semanas de implante.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

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