Modelo rato de rejeição vascular induzida por Aloimune e Transplante Arteriosclerose

O objetivo geral deste procedimento é realizar um enxerto de interposição aórtica completo em camundongos para estudar a rejeição vascular e a arteriosclerose do transplante. Isso é conseguido primeiramente colhendo um segmento da aorta abdominal do camundongo doador. Em seguida, o segmento é enxertado ortotopicamente na aorta infrarrenal de um receptor alogênico geneticamente distinto do doador.

No passo final, o segmento vascular transplantado é ressecado e analisado quanto ao desenvolvimento da arteriosclerose do transplante. Por fim, o grau de arteriosclerose do transplante e da rejeição vascular mediada por resposta imune pode ser avaliado por meio da mensuração do espessamento íntimo e do estreitamento luminal, bem como pela análise imunohistoquímica do tecido para detecção do acúmulo de células imunológicas.

De modo geral, indivíduos novos neste procedimento precisam de tempo para se familiarizarem com a técnica microcirúrgica, pois é exigido um alto nível de destreza e prática para dominá-la. No entanto, o método deve ser acessível à maioria dos pesquisadores com prática e diligência em pacientes. Assim, demonstraremos o procedimento com a Dra. Winnie End, neurocirurgiã talentosa, e Adam Roso, um estudante de doutorado talentoso do meu laboratório. Comece posicionando o camundongo doador em posição supina sobre uma placa fina e limpa de plexiglass, coberta com um campo estéril, sob o microscópio cirúrgico com ampliação de 30x.

Após confirmar anestesia cirúrgica adequada por meio da compressão do dedo do pé, use tesoura estéril para fazer uma única incisão mediana do púbis até o processo ZipID. Em seguida, use um pequeno retrator para abrir as paredes abdominais, expondo a cavidade abdominal. Então, use aplicadores estéreis com ponta de algodão para retrair suavemente os intestinos superiormente para o lado esquerdo do animal.

Cubra o tecido com gaze umedecida com solução salina e mova os órgãos reprodutivos inferiormente para localizar a aorta infrarrenal e a veia cava inferior ou VCI. Agora, use pinças cirúrgicas número cinco para separar a aorta da VCI na artéria renal esquerda, próxima à bifurcação. Em seguida, utilize suturas de poliamida monofilamento 10-0 para ligar os pequenos ramos próximos à aorta.

Quando a aorta doadora e a VCI tiverem sido separadas, sature o vaso com soro fisiológico, cubra a cavidade exposta com gaze umedecida e coloque o doador de lado em uma área estéril. Agora, posicione o camundongo receptor sob o microscópio e separe a aorta receptora da VCI, conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, coloque dois clipes microvasculares de quatro milímetros, proximal e distal ao segmento de interesse, aproximadamente cinco milímetros um do outro.

Em seguida, utilizando microtesouras cirúrgicas para tubos horizontais, faça uma única incisão aórtica horizontal e ressecione não mais do que 0,5 milímetros da aorta abdominal para acomodar o enxerto aórtico doador. Retorne ao microscópio com o doador e seccione um segmento do enxerto de três a quatro milímetros, conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, utilize uma agulha 25×5/8 para lavar a aorta ressecada com solução salina heparinizada.

Tendo o cuidado de que a ponta da agulha não entre em contato com o vaso, coloque o vaso em um recipiente com solução salina heparinizada sobre gelo. Dentro de 30 minutos após a excisão, posicione o enxerto aórtico do doador na posição ortotópica no receptor, alinhando a orientação anatômica respectiva do enxerto com a do receptor. Em seguida, segure suavemente a túnica externa do vaso e use a pinça número cinco para afastá-la levemente.

Agora, use a pinça para introduzir uma agulha acoplada a um fio de sutura monofilamento de poliamida 10-0 através da espessura total da parede do vaso, a fim de fixar o enxerto aórtico do doador ao vaso ressecado do receptor para a colocação de pontos contínuos. Posicione pontos de fixação às nove horas em ambas as extremidades, superior e inferior, do enxerto. Em seguida, iniciando na extremidade superior do enxerto, realize a anastomose a partir das três horas.

Os extremos ressecados com dois pontos contínuos e fixe o fio ao ponto de sustentação. Em seguida, vire o enxerto e continue o ponto contínuo até a parte dorsal do vaso. Encontrando a origem.

Ponto de sustentação. Fixe o fio sem aplicar muita pressão sobre o vaso e repita a sutura para a anastomose inferior. Uma vez que a anastomose esteja completa.

Solte o grampeador microvascular distal para permitir o fluxo sanguíneo retrógrado através do vaso. Se não for observado sangramento, solte o grampeador proximal. Se não forem observadas obstruções sanguíneas, use um par de pinças para segurar suavemente uma extremidade dos pontos de fixação e desviar levemente o vaso para inspecionar a parede posterior do vaso.

Nenhuma ondulação deve ser observada se um padrão de pulso vigoroso for observado em ambos os vasos doador e receptor; use aplicadores com ponta de algodão para retornar os intestinos à cavidade abdominal. Finalmente, use uma pinça para agulha e pinças grof para fechar a parede abdominal com suturas contínuas de polipropileno cinco zero. Feche a camada da pele com o mesmo tipo de sutura, utilizando fechamento subcuticular.

A função motora dos membros posteriores pode ser observada para avaliar o sucesso da cirurgia. A quantidade de dano vascular alogrênico mediado pelo sistema imunológico é examinada, quantificando o espessamento íntimo e o estreitamento luminal em segmentos aórticos enxertados no dia 30 pós-transplante.

De fato, conforme observado, os segmentos arteriais alogênicos desenvolvem espessamento íntimo significativo e oclusão luminal, enquanto nenhuma alteração é observada nos segmentos arteriais controle de enxerto ISO. Além disso, o recrutamento de leucócitos para a artéria alogênica pode ser avaliado mediante a análise do acúmulo de linfócitos T positivos para CD quatro e CD oito e macrófagos por imunohistoquímica. Conforme esperado, os três tipos de células imunes foram detectados na íntima dos tecidos arteriais doadores após o desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de transporte explorarem a redução vascular mediada por aloimunidade e a esclerose arterial de transplante.