A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

O objetivo geral deste procedimento é descrever um sistema para avaliar o início fisiológico da imunidade adaptativa específica da vacina. Isso é feito primeiro, usando genética reversa para gerar vacinas vivas e atenuadas contra influenza contendo um peptídeo imunogênico específico e, em seguida, usando um embrião de galinha para multiplicar o vírus. Em seguida, as células são colhidas dos gânglios linfáticos de camundongos vacinados e a análise por fax é usada para rastrear a migração de células dendríticas.

No próximo ensaio, oito células T positivas CD reativas ao peptídeo imunogênico são marcadas e injetadas em camundongos vacinados, seguidas de análise por fax para medir a proliferação dessas células para analisar a resposta imune com mais detalhes. Um espelho competitivo de carrilhão da medula óssea é feito pela infusão de células da medula óssea que expressam o receptor de toxina diftérica em camundongos congênicos irradiados, que são então expostos à toxina diftérica. Após uma depleção bem-sucedida, o camundongo é vacinado e os anticorpos e tetrâmeros são usados para identificar oito células T positivas para CD.

Reconhecendo o peptídeo específico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da vacinologia, como como uma vacina funciona a nível neurológico, quais são os principais alvos celulares e moleculares da vacina e, o mais importante, como podemos melhorar as estratégias profiláticas atuais. Demonstrando o procedimento estará Sanmen Medina.

Nosso gerente de laboratório e eu Para este protocolo, gere uma vacina contra influenza adaptada ao frio resortida usando a cepa adaptada ao frio. A Ann Arbor seis 60. Como pano de fundo acoplado à hemaglutinina e uma neuraminidase modificada da cepa A PR 8 34.

Uma parte da sequência do pedúnculo da proteína do gene da neuraminidase é substituída por uma sequência curta de CDNA que codifica o peptídeo sinfecal de galinha. Este peptídeo é altamente imunodominante na classe H dois BMHC. Uma resposta restrita de C 57 preto seis camundongos e funciona como um elemento rastreável.

Para começar, a placa 1.000.002 93 células T em cada poço de uma placa de seis poços com DMEM contendo 10% de soro bovino fetal e 1% de estreptococos de caneta. Em seguida, prepare uma mistura de transfecção de plasmídeo suficiente para 100 microlitros por poço. Combine um micrograma de cada plasmídeo e encha o tubo com meio de célula opti MEM pré-aquecido até 50 microlitros em outro tubo.

Adicione o dobro do volume de lipectomia 2000 correspondente à quantidade total de plasmídeo a ser transfectado e complete o tubo para 50 microlitros com opti MEM antes de adicionar a mistura de transfecção às células. Deixe descansar por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros da mistura de transfecção a cada poço e mova a placa para uma incubadora por 16 horas.

No dia seguinte, troque o meio para DMEM com 0,3% BSA e 1% de estreptococos de caneta. Em seguida, mova as células para 33 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Depois de cinco horas.

Adicione uma sobreposição de um milhão de células MDCK permissivas da gripe em DMEM suplementado com tripsina. Mantenha as coculturas por dois a três dias sob o regime de incubação de 33 graus Celsius para gerar e amplificar o vírus Mais tarde, limpe os detritos usando uma centrifugação de 260 G de cinco minutos. Em seguida, colete os sobrenadantes inoculando ovos embrionados de galinha com nove a 10 dias de idade em condições estéreis.

Para fazer isso, faça um furo na parte superior da casca do ovo e adicione o vírus em uma diluição de 100 x 10 x ou um x. Cubra a casca do ovo com cera derretida usando um cotonete e incube os ovos de galinha inoculados por três dias a 33 graus Celsius. Mais tarde, colha o fluido Alan Toic dos ovos infectados.

Lave as cascas dos ovos com 70% de etanol. Abra o ovo com uma rachadura muito suave na parte superior e remova a membrana Alan Toic usando uma pinça estéril. Use uma pipeta de 10 mililitros para coletar o máximo de fluido possível.

Normalmente de seis a 10 mililitros. Centrifugue o fluido a 260 gs por 10 minutos a quatro graus Celsius e transfira o fluido Alan Toic limpo para novos tubos. Depois de anestesiar um camundongo doador e acessar cirurgicamente o mediastino, colha os gânglios linfáticos usando uma pinça curva.

Transfira os gânglios linfáticos para uma placa de seis poços contendo um mililitro de DMEM. Depois que qualquer tecido conjuntivo ou adiposo ao redor do linfonodo for removido, prenda o linfonodo com uma agulha e quebre-o com a outra agulha. Isso deve resultar em células saindo do linfonodo para o meio para coletar as células.

Primeiro, passe todo o material de tecido por um filtro de náilon de 70 mícrons para obter uma suspensão de células prontas para centrifugação. Ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de tampão RBC Lysing. Deixe a reação de lise durar três minutos em temperatura ambiente e termine-a com uma adição de dois mililitros de PBS gelado, prossiga com a coloração das células de acordo com o protocolo de texto.

Certifique-se de usar o movimento da placa para remover e descartar o super nomeado antes da incubação do anticorpo. As células T do doador de camundongos transgênicos TCR disponíveis comercialmente incubam 5 milhões de células em um mililitro de PBS com cinco CFSE micromolares. Deixe a incubação continuar por 20 minutos a 37 graus Celsius no escuro.

Em seguida, colete as células a 2 milhões por 100 microlitros de PBS e infunda camundongos congênicos receptores com um bolus de 100 microlitros por meio de injeção retroorbital no seio. Após três a cinco dias, eutanasiar os camundongos, colher os linfonodos mediastinais e preparar uma suspensão de célula única para citometria de fluxo. Como antes.

Em seguida, identifique as células do doador colorindo as suspensões de células únicas em um coquetel de anticorpos. Para a análise. Deixar aberto o canal FL do citómetro de fluxo para determinar o perfil de diluição da CFSE.

Depois de remover e higienizar as tíbias e o fêmur de um camundongo sacrificado, colete-os em um prato de DMEM. Corte as pontas dos ossos usando uma tesoura afiada e lave a medula óssea no DMEM. Agora, usando métodos padrão, irradiar camundongos fêmeas de seis a oito semanas usando um irradiador de fonte de césio 1 37 duas a quatro horas após a irradiação dos camundongos, anestesiar os camundongos e transplantá-los com células da medula óssea do doador por meio de uma injeção retroorbital de 2 milhões de células em 100 microlitros de PBS pelas próximas duas semanas, fornecer aos ratos 2,5 a cinco miligramas de Baal por quilo em sua água potável.

Começando dois dias antes da vacinação, administrar 50 nanogramas de TD diluídos em 50 microlitros de PBS gota a gota diretamente nas narinas de camundongos anestesiados. Continue este tratamento por três dias após a vacinação. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre como gerar o modelo final do mouse.

Vacine os camundongos com influenza viva atenuada recombinante usando uma injeção intranasal sob anestesia. Entregar 1000 PFU de vacina de uma pipeta de 200 microlitros em 50 microlitros de PBS A geração de vacinas vivas atenuadas recombinantes contra influenza pode ser alcançada pela transfecção de plasmídeos que codificam os oito segmentos do vírus influenza sob o controle de promotores bidirecionais. Uma vacina contra influenza adaptada ao frio geralmente contém seis segmentos de uma cepa adaptada ao frio, bem como o HA e NA da cepa de influenza de escolha, como H one N one.

A adaptação ao frio permite a replicação restrita do vírus a 33 graus Celsius, a temperatura do trato respiratório superior em camundongos e humanos, mas não permite a replicação no trato respiratório inferior, portanto, não pode resultar em fusão de pneumonia. A PCR foi usada para substituir uma região conservada no caule da neuraminidase viral por um peptídeo derivado de OVA rastreável. O modelo de peptídeo rastreável foi inoculado em camundongos entre três e seis dias após a vacinação.

A proteína sinfecal rastreável foi detectada nos linfonodos de drenagem pulmonar. A citometria de fluxo multiparamétrica foi usada para quantificar a apresentação do antígeno derivado da vacina em tempo real. Da mesma forma, a infusão de células T específicas fecais permitiu a quantificação das respostas de oito células T CD específicas da vacina para avaliar as funções específicas do gene durante a vacinação.

Um modelo de camundongo combinando tecnologia DTR e kyira competitiva de medula óssea foi utilizado. Assim, a perda da função do gene foi direcionada a compartimentos celulares específicos ao longo das respostas imunes à vacinação. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como analisar as vias moleculares e fisiológicas envolvidas na modulação da imunidade induzida por vacina no hospedeiro.

Além disso, essa técnica fornecerá uma nova visão na determinação dos alvos celulares da vacina, promovendo assim a valorização de novas plataformas vacinais.