Name: A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda a avaliar a imunidade adaptativa vacinal usando vacinas recombinantes de influenza atenuadas em camundongos quiméricos. Este método rastreia migração de células dendríticas e proliferação de linfócitos T CD8+ para compreender respostas imunes.

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Agradecemos a Sergio Gómez-Medina pelo excelente suporte técnico com experimentos com camundongos. Este trabalho foi apoiado por fundos da Associação Leibniz e do Centro de Infecção Leibniz. A.L. recebeu uma bolsa de pré-doutorado da Leibniz Graduate School.

Experimentos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados e seguir as orientações da lei alemã de protecção animal. Todos os funcionários que realizam experiências com animais passaram programas de treinamento de acordo com a categoria B ou C da Federação das Associações Europeias de Ciências Animais de Laboratório. 1. Geração de recombinante vivo atenuado Vacinas contra Influenza por genética reversa NOTA: O protocolo detalhado para a geração de vírus influenza recombinantes por genética reversa foi descrito em estudos anteriores 5 e está fora do âmbito do presente relatório. Resumidamente, resgate de vacinas contra a gripe adaptados ao frio (CAV) é feito em um armário de biossegurança classe II sob nível de biossegurança 2 contenção (BSL2), e envolve etapas detalhadas abaixo. O protocolo de transfecção e a infecção resulta que de Martinez-Sobrido et al. 5. <ol><li> Gerar um influenza adaptada ao frio reassortantvacina utilizando como fundo do adaptado ao frio estirpe A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), bem como a hemaglutinina (HA) e neuraminidase uma modificado (AN) da A / PR / 8/34 (H1N1), a linhagem A ( Figura 1A). A alteração no gene de NA consiste de uma substituição com base em PCR de uma sequência conservada no talo proteína (resíduos 65-72) por uma sequência de ADNc que codifica a curto ovalbumina de galinha (OVA) péptido -derived SIINFEKL (Figura 1B). O péptido SIINFEKL é um péptido altamente imunodominante no contexto do MHC de classe H-2b resposta de ratinhos C57BL / 6 12 I-restringida. </li><li> Placa 10 6 293T células por poço em placas de 6 poços, usando DMEM 10% de soro fetal de bovino (FBS), suplementado com 1% de penicilina / estreptomicina (P / E). </li><li> Prepare a mistura de transfecção de plasmídeo: Adicione 1 ug de cada um dos plasmídeos que codificam para os ADNc de PB2, PB1, PA, NP, M, NS de influenza A / Ann Arbor / 6/60 e uma estirpe ug dos plasmídeos que codificam para o NA -SIINFEKL eHA de influenza A / PR / 8/34. Adicionar pré-aquecido OptiMEM (15 ul, para um volume final de 100 ul / poço). </li><li> Incubar mistura de transfecção durante 30 min à TA. </li><li> Adicionar 100 ul da mistura de transfecção / cavidade e incubar durante 16 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Mudar meio celular por DMEM 0,3% BSA 1% P / L a 33 ° C e 5% de CO 2 durante 5 h. </li><li> Adiciona-se 10 6 influenza células MDCK permissivas em DMSO contendo 1 ug / ml de tripsina de pâncreas de bovino tratada com L-1-tosilamida-2-feniletil-clorometilcetona (TPCK-tripsina). Manter as co-culturas 293T-MDCK para 2-3 dias a 33 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Recolher os sobrenadantes de células MDCK-293T co-culturas e clara por centrifugação a 260 xg durante 5 min. </li><li> Inocular 9 - galinha 10 dias de idade, ovos embrionados em condições estéreis. Para fazer isso, fazer um furo na parte superior da casca do ovo, tal como indicado por Martinez-Sobrido et ai. 5. </li><li> Cubra a sagacidade casca de ovoh cera derretida usando um cotonete de algodão e incubar os ovos de galinha inoculadas durante 3 dias a 33 ° C. </li><li> Colher o fluido alantóico dos ovos embrionados infectados: Lavam-se as cascas com etanol a 70%. Abra o ovo com uma rachadura muito suavemente na parte superior e remover a membrana alantóide usando uma pinça estéril. Use uma pipeta de 10 ml para recolher tanto líquido quanto possível (tipicamente 6-10 ml). Centrifuga-se a 260 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir o fluido alantóico foi afastada para novos tubos. </li></ol> Imunidade 2. Rastreamento vacina específica- <ol><li> Rastreamento de células dendríticas portadores de péptidos (DCs) <ol><li> Para a vacinação rato, anestesiar ratos com 5% de isoflurano em oxigênio, utilizando um vaporizador de precisão. Usar uma pipeta de 200 uL para administrar 50 uL de PBS contendo 10 3 unidades formadoras de placas (pfu) da vacina expressando o ptido SIINFEKL através de gotículas directamente para as narinas do rato. </li><li> Três dias após a vacinação, euthanize ratinhos através de anestesia de isoflurano, seguido por deslocação cervical. </li><li> Levante a pele do rato na linha média, logo abaixo da caixa torácica com uma pinça e cortar uma pequena incisão através da pele com uma tesoura. Do ponto de incisão, fazer um 3-5 cm de comprimento cortar através da pele em direção a cabeça eo rabo, em seguida, duas incisões de 2 cm da linha média lateralmente a partir de cada extremidade. Retire a pele para revelar as cavidades peritoneal e torácica. Cuidadosamente cortar através das membranas que rodeiam o peritoneu para expor o tórax. </li><li> Para aceder ao mediastino cortar o diafragma e a parte inferior da caixa torácica. Encontrar e remover dois gânglios linfáticos do mediastino (MLNS), ligeiramente dorsal e lateralmente ao lado do timo, medially adjacente à artéria braquiocefálica, perto do lado ventral da traquéia. </li><li> Para colher os MLNS usar uma pinça curva. Coloque uma pinça debaixo dos gânglios linfáticos e puxá-los para cima suavemente. Coloque gânglios linfáticos em uma placa de 6 poços contendo 1 ml de DMEM e remover quaisquer connective ou tecido gordo em torno do nó. <ol><li> Amole cada amostra cuidadosamente com duas agulhas 26 G ligados a seringas de 1 ml. Para provocar o linfonodo, segure-a com uma agulha ao quebrar aberto o linfonodo com a outra agulha. Quando isso for feito corretamente, as células concentradas estourando a partir do nó de linfa são facilmente observado na mídia. Passe todo o material de tecido através de um filtro de nylon de 70 mm para obter suspensões de células individuais. </li></ol></li><li> As suspensões de células únicas de centrífuga de 10 min a 260 xg numa centrifugadora refrigerada. Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de glóbulos vermelhos de Lise (RBCL) Tampão para lisar as células vermelhas do sangue. Permitir que a lise continuar durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Neutralizar RBCL tampão através de centrifugação e ressuspensão de células em 2 ml de PBS gelado. </li><li> Células da placa em forma de U-placas de 96 poços a uma concentração de 10 7 células / ml num volume final de 100 ul. </li><li> Para análise de citometria de fluxo, de células bloco Fc-receptores usando1 ug de anticorpos CD16 / CD32 anti-rato por 10 6 células durante 15 minutos em gelo. </li><li> Placas de centrífuga e descartar sobrenadantes por placa passar rapidamente. Incubar poços individuais com a combinação de anticorpo superfície de escolha. Normalmente para a detecção de células dendríticas em nódulos linfáticos, o cocktail de anticorpos deve incluir: 0,25 ug de anticorpos anti-CD11c, 0,25 ug de CD11b, 0,5 ug de MHC de classe II, 0,25 ^ g de CD103 e 0,15 ug de CD8a em um volume final de 100 ul. </li><li> Para gating negativo, adicionar 0,25 ug de anticorpos anti-CD3, CD19, ou NK1.1 uma linhagem de cocktail (Figura 2A). Estratégias de propagação alternativas, bem como os protocolos para uma compensação adequada de vários corantes fluorescentes podem ser encontradas no site do Projeto Genoma imunológica. Para além dos marcadores de superfície de escolha, adicionar 1 ug de um anticorpo contra H-2K b obrigado a SIINFEKL para o cocktail. Este anticorpo disponível comercialmente irá permitir a visualização de DCs in que o péptido SIINFEKL é ligado à superfície de MHC de classe I. </li><li> Incubar as células com anticorpos de superfície durante 30 minutos em gelo. Proteja placa da luz. Placas de centrifugar a 260 xg durante 5 minutos e lavar com 2 ml de PBS, duas vezes. Células transferir para tubos de citometria de fluxo para análise. </li></ol></li><li> Avaliação de proliferação de células T específicas de vacina <ol><li> Obtenção de células T dadoras de ratinhos disponíveis comercialmente TCR transgénica (murganhos OT-I) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / J) em que todas as células T CD8 + geradas são específicos para o péptido SIINFEKL. Eutanásia ratinhos por anestesia com isoflurano seguido por deslocação cervical. Colheita do baço através da realização de uma incisão na cavidade abdominal. Coloque baço / s em 2 ml de DMEM / baço e remover tecido conjuntivo e gordura. </li><li> Gerar suspensões de células individuais de baço a seguir o procedimento descrito no 2.1.2 e 2.1.3. </li><li> Para enriquecer ainda mais a suspensão de células individuais em células T, se aplicam os protocolos de separação de esférulas magnéticasutilizando tanto os procedimentos de selecção positiva ou negativa 12. Para diferenciar doador de células receptoras, utilize ratos congï¿½icas de modo que, por exemplo, ratinhos receptores expressar a CD45.1 marcador de leucócitos, enquanto as células T do doador expressar CD45.2 12. </li><li> Para identificar as células T, incubá-las em 1 ml de PBS contendo 5 uM de éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) numa densidade celular óptima de 5 x 10 6 células / ml. Incubar as células durante 20 min a 37 ° C, protegido da exposição à luz. Após a incubação, as células de centrifugação a 260 xg durante 5 min, o sobrenadante de descarte, e ressuspender as células em 3 ml de soro fetal de bovino (FBS) para neutralizar CFSE. </li><li> Células centrifugar a 260 xg durante 10 min e ressuspender em o volume adequado de PBS de modo a que 100 uL de solução contém 2 x 10 6 células. Infundir beneficiários ratos congï¿½icas com 2 x 10 6 células / rato via retro-orbital injeção sinusal 13. </li><li> Euthanize ratos receptores nos dias 3, 4 e 5 de pós-vacinação utilizando anestesia de isoflurano, seguido por deslocação cervical. Colher gânglios linfáticos do mediastino e preparar suspensões de células individuais para citometria de fluxo, tal como indicado na 2.1.2-2.1.5. </li><li> Identificar células dadoras por coloração das suspensões de células individuais em 100 uL de um cocktail contendo anticorpos: 0,25 ug de anticorpos, CD4 e CD8 anti-ratinho CD3; 0,5 ug de anti-murganho ou anticorpo CD45.1 CD45.2 (dependendo do fenótipo das células do doador). Deixar o canal FL-1 do citómetro de fluxo aberto (FITC) para determinar o perfil de diluição CFSE 12 (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 3. ratos quiméricos para dissecar Responses vacina específica do gene NOTA: A geração de quimeras de medula óssea competitivos utilizando modelos de rato com base em DTR permite a discriminação de funções específicas de células durante a resposta imune às vacinas. Aqui nós mostramos uma estratégia adicional pelo qual combinação de DTR-expressando doador cells com células de ratos knockout licenças para estudar funções específicas de genes durante a imunidade em compartimentos celulares específicos. No exemplo que geramos camundongos com deleção específica de receptor toll-like 3 (TLR3) em Langerina + CD103 + DCs. <ol><li> Preparação de células de medula óssea dadoras <ol><li> Trabalhar sob um armário de biossegurança nível II. Evitar a contaminação por meio de instrumentos exclusivamente autoclavados. </li><li> Para gerar medula óssea ratos quiméricos, use CD45.1 congénica + camundongos C57BL / 6 do sexo feminino como destinatários, e usar TLR3 - / -, Langerina-DTR / EGFP, ou ratinhos wt expressar CD45.2 + como doadores. Utilizando murganhos dadores e receptores congï¿½icas permite a diferenciação de células dadoras e receptoras através de citometria de fluxo e isso permite que o enxerto a ser avaliada. </li><li> Para a obtenção de células de medula óssea do dador, eutanásia ratinhos dadores com anestesia isoflurano seguido por deslocação cervical. Com uma tesoura afiada realizar incisões em torno dos tornozelos, de modo que o mmusculatura ouse está exposto. </li><li> Utilizando uma pinça sem corte puxar a pele do rato e pele delicadamente do tornozelo em direção aos quadris de modo que os músculos das pernas são visíveis. </li><li> Com uma tesoura afiada cortar rato pernas na altura dos quadris e acima da cabeça do fêmur. </li><li> Coloque as pernas numa placa de Petri e em gelo. Trabalhar rápido e remover todos os músculos para expor os ossos. </li><li> Fêmures e tíbias distintas. Inserir os ossos, numa solução de etanol a 70% durante 5 minutos para remover possíveis bactérias e colocá-los imediatamente na outra placa de Petri contendo 5 ml de DMEM isento de soro. Osso cortar termina usando uma tesoura afiada e lave a medula óssea para a DMEM. Para fazê-lo, descarga 1 ml de DMEM para dentro do osso através da inserção de uma agulha de 26 G ligada a uma seringa de 5 ml. Certifique-se de que os ossos olhar branco (vazio) após a lavagem. </li><li> Recolhe todas as células da medula óssea de ratos dadores em 10 ml de DMEM. Gerar suspensões de células isoladas a partir de células de medula óssea por passagem da colheita por meio de um filtro celular de 70? M. </li><li> Clorelha suspensões de células únicas de células de medula óssea por centrifugação a 260 xg durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga refrigerada. Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de PBS. Destroem glóbulos vermelhos usando solução RBCL como descrito em 2.1.3 e 2.1.4. </li><li> Contagem de células de medula óssea utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado. Avaliar a viabilidade celular por determinação de células mortas através de coloração com azul de tripano 13. Idealmente, uma única produz animais cerca de 3 x 10 7 células brancas do sangue / rato, com uma viabilidade de pelo menos 80%. </li><li> No caso de quimeras totais de medula óssea, preparar TLR-3 - células doadoras ou em peso - /. A concentração óptima de células é de 2 x 10 7 células / ml desde 2 x 10 6 células em 100 ul de PBS vai ser utilizado para transplante. Se não for utilizada imediatamente, preservar células doadoras a -80 ° C, utilizando técnicas de congelação lenta e com FBS a 10% de DMSO. Para o modelo quimérico mista, misture pilhas Langerina-DTR-doadores e TLR3 - / - </sup&gt; Células do doador em uma proporção 75:25. Prepara-se uma mistura de 75: 25 Langerina-DTR: em peso de células da medula óssea para gerar ratinhos de controlo. </li></ol></li><li> Rato irradiação e transplante <ol><li> Irradiar camundongos fêmeas entre 6-8 semanas de idade em uma fonte de irradiador de césio-137. Dê camundongos duas doses de 550 rad 4 horas de intervalo. Irradiação de Split minimiza toxicidade hepática aguda e, portanto, reduz a letalidade do rato devido ao protocolo de irradiação. </li><li> Após a irradiação, manter os ratos sob tratamento com antibióticos para duas semanas. Dar antibióticos com a água potável a 2,5 - 5 mg de Baytril / kg. </li><li> 2-4 horas após a segunda irradiação, os ratinhos transplantados com células de medula óssea do dador, por via intravenosa. Realizar a injecção de células de dador através de retro-orbital injecção seio 13 e sob anestesia com isoflurano utilizando o volume máximo de 100 uL de PBS contendo 2 X 10 6 células. </li><li> Quatro semanas após o transplante, enxerto em avaliar uma amostra de 100ul de sangue periférico por citometria de fluxo utilizando uma máquina capaz de ler pelo menos duas cores. Para distinguir entre o dador e células de receptores de rádio-resistentes, disponíveis comercialmente usam CD45.1 marcado por fluorescência e anticorpos anti-ratinho CD45.2 utilizando diluições entre 1/100 e 1/200. O enxerto de células dadoras óptima deve ser de pelo menos 80% do total de células hematopoiéticas no sangue periférico. </li></ol></li><li> Depleção de vacinação e direcionados <ol><li> Vacinar os ratos com a vacina contra influenza viva atenuada recombinante via intranasal. Para a vacinação rato, anestesiar ratos com 5% de isoflurano em oxigênio, utilizando um vaporizador de precisão. Usar uma pipeta de 200 uL para administrar 50 uL de PBS contendo 10 3 unidades formadoras de placas (pfu) da vacina. </li><li> Para gerar o modelo final do rato, o tratamento de ratinhos com 50 ng de DT diluída em 50 ul de PBS, intranasalmente. Administrar DT gota a gota, directamente para as narinas de ratinhos anestesiados, tal como descrito em 3.3.1. Tratar miCE com doses diárias que iniciam o tratamento no dia -2 antes da vacinação até o dia 2 pós-vacinação (Figura 3B). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste estudo, descrevemos como genética e modelos quiméricos ratinho inversa pode ser utilizada para elucidar os mecanismos fisiológicos e moleculares de imunidade induzida pela vacina. Genética reversa Influenza é estabelecida em muitos laboratórios e tem desempenhado um papel principal na compreensão patogênese da gripe, replicação e transmissão 17. Um ponto-chave em nosso protocolo é resgate de vacinas contra a gripe adaptados ao frio que expressam epitopos estrangeiros. Embora a estratégia de introdução d...

A geração de memória imunológica, na ausência de doença é a base fisiológica de vacinação eficiente 1. Recentemente, sistemas de abordagens baseadas em biologia têm revelado que as vacinas de sucesso, como a vacina contra a febre amarela, induzir uma forte indução de resposta imune inata e ativação de vários subconjuntos de células dendríticas (DCs), que por sua vez, levam a multilinhagens ativação de antígeno células T específicas 2,3. Uma vez que as DCs são a única população de células imunitárias, com a capacidade para activar células T ingénuas específicas de antigénio 4, o estudo da sua função durante a vacinação é fundamental para compreender as respostas imunitárias a vacinas e para conceber estratégias futuras contra patógenos desafiantes. Um sistema que permite o rastreio de diferentes subconjuntos DCs durante as respostas imunitárias a vacinas seria desejável, a fim de estabelecer uma cinética precisas de migração DC para tecidos linfóides, e, por conseguinte, para fornecerinsights sobre os mecanismos fisiológicos responsáveis ​​pela iniciação da imunidade adaptativa específicas de vacina. Com base genética inversa abordagens oferecem a possibilidade de gerar modificado, as vacinas vivas atenuadas que podem ser utilizadas experimentalmente com esta finalidade. Desde sua implantação, em investigação sobre a gripe, genética inversa à base de plasmídeo tem sido amplamente utilizada para gerar linhagens recombinantes de gripe, incluindo LAIVs. Os protocolos padrão para resgatar os vírus influenza recombinantes requerem multi-transfecção de linhas celulares altamente transfectáveis ​​com plasmídeos que produzem ambisense (tanto positivo como negativo de ARN senso) contendo os segmentos virais oito da gripe, bem como um sistema de amplificação no permissiva tais como Madin-Darby de rim canino ( ) células MDCK e / ou frango ovos embrionados 5. No entanto, a aplicação da genética reversa para gerar ferramentas moleculares para o estudo dos mecanismos imunológicos das vacinação permanece inexplorado. A geraçãode novos modelos de ratos, permitindo a depleção específica de subconjuntos de células imunes, incluindo CDs, abriu novas possibilidades para compreender os mecanismos imunológicos básicos subjacentes proteção provocada por vacina. A comparação entre as funções de subconjunto DC em camundongos e humanos revelou que, em grande medida, mouse e DCs humanas são funcionalmente homóloga 6,7, estes resultados sugerem fortemente que o desenvolvimento de modelos de mouse que permite a depleção específica de DCs no estado estacionário e durante condições inflamatórias, pode servir para entender a fisiologia das respostas DC em seres humanos. Nos últimos anos uma série de modelos de ratos têm sido gerado transportando transgenes que expressam o receptor da toxina da difteria de símio (DT) (DTR) sob o controlo da região do promotor de um gene de interesse 8,9. Desde tecidos de ratinho não expressam naturalmente DTR, estes modelos permitem esgotamento condicional de subconjuntos de células que carregam o gene alvo de interesse sobre inoculação em camundongos com DT. Assim, a nossa ability para esgotar as DCs específicas e outros leucócitos in vivo durante processos fisiológicos, foi grandemente melhorada pelo desenvolvimento de ro baseado no DTR. No entanto, enquanto estes modelos de ratinhos transgénicos têm sido amplamente utilizados para compreender a ontogenia do sistema imunitário, a sua aplicação para o desenvolvimento de vacinas tem sido pouco testada. Aqui, através da combinação de gripe genética reversa e quimeras de medula óssea competitivos baseados em DTR, propomos um método para estudar a cinética de imunidade da vacina, bem como a função do gene individual durante as respostas imunes às vacinas in vivo. A aplicação desta tecnologia para a avaliação pré-clínica de novas vacinas contra doenças infecciosas desafiadoras poderia ajudar a racionalizar o desenho da vacina e para testar vacinas candidatas in vivo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&agudo; s Meio Eagle Modificado (DMEM 1x)</td> <td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U / ml)</td> <td>PAA</td><td>p11-010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ovos embrionados</td><td>Valo biomedia Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtros de Nylon</td><td>M Greiner-Biorad</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBCL) 10x</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td><td>Biolegend</td><td>141605</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md / 114.15.2)</td> <td>eBioscience</td><td>48-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1 / 70)</td> <td>Biolegend</td><td>101216</td><td></td></tr><tr><td>PerCp / Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td> <td>Biolegend</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td> <td>eBioscience</td><td>12-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td> <td>BD Bioscience</td><td>562130</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>46-0081-80</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&epsilon; (145-2611)</td><td>Biolegend</td><td>100325</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td><td>eBioscience</td><td>48-0041-80</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Corante de proliferação</td><td>eBioscience</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 2.5%</td><td>Bayer</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumina&nbsp;</td><td>Sondas moleculares</td><td>O23020</td><td></td></tr><tr><td>Toxina Diphteria (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-TPCK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>BD FACsCanto II Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software de análise de células 9.5</td><td>Flowjo inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0,4%)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Contador Automático de Células Countess</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

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Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

As vacinas são uma das maiores conquistas da humanidade e salvaram milhões de vidas no último século. Paradoxalmente, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos que medeiam as respostas imunes às vacinas, talvez devido ao sucesso geral da vacinação, que reduziu o interesse nos mecanismos moleculares e fisiológicos da imunidade vacinal. No entanto, vários patógenos humanos importantes, incluindo o vírus influenza, ainda representam um desafio para a vacinação e podem se beneficiar de estratégias imunológicas. 
Embora a genética reversa da gripe tenha sido aplicada com sucesso à geração de vacinas vivas atenuadas contra influenza (LAIVs), a adição de ferramentas moleculares em preparações vacinais, como componentes traçadores para acompanhar a cinética da vacinação in vivo, não foi abordada. Além disso, a recente geração de modelos de camundongos que permitem a depleção específica de leucócitos durante estudos cinéticos abriu uma janela de oportunidade para entender os mecanismos imunológicos básicos subjacentes à proteção induzida pela vacina. Aqui, descrevemos como a combinação de genética reversa e modelos quiméricos de camundongos pode ajudar a fornecer novos insights sobre como as vacinas funcionam nos níveis fisiológico e molecular, usando como exemplo uma vacina contra influenza viva atenuada (LAIV) recombinante, adaptada ao frio e viva. Utilizamos LAIVs gerados em laboratório que abrigam traçadores celulares, bem como quimeras competitivas da medula óssea (BMCs) para determinar a cinética inicial da imunidade vacinal e os principais mecanismos fisiológicos responsáveis pelo início da imunidade adaptativa específica da vacina. Além disso, mostramos como essa técnica pode facilitar estudos de função gênica em animais únicos durante as respostas imunes às vacinas. Propomos que esta técnica possa ser aplicada para melhorar as estratégias profiláticas atuais contra patógenos para os quais são necessárias contramedidas médicas urgentes, por exemplo, influenza, HIV, Plasmodium e vírus da febre hemorrágica, como o vírus Ebola.

Geração de vacinas contra a gripe vivos atenuados recombinantes pode ser conseguida por transf ecção de plasmídeos que codificam os oito segmentos de vírus influenza, sob o controlo de promotores bidireccionais 5. Uma vacina contra a gripe adaptada ao frio geralmente contém seis segmentos de uma estirpe adaptada ao frio, assim como a HA e NA da gripe de estirpe de escolha (por exemplo, H1N1) (Figura 1A). O princípio de frio adaptação baseia-se na replicação de vírus restrito a 33 ° C...

Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever um sistema para avaliar o início fisiológico da imunidade adaptativa específica induzida por vacinas. Isso é realizado inicialmente por meio da genética reversa para gerar vacinas atenuadas contra a influenza, contendo um peptídeo imunogênico específico, e posteriormente utilizando um embrião de galinha para multiplicar o vírus. Em seguida, células são coletadas dos linfonodos de camundongos vacinados e a análise por citometria de fluxo é utilizada para rastrear a migração de células dendríticas.No próximo ensaio, linfócitos T CD8 positivos reativos ao peptídeo imunogênico são marcados e injetados em camundongos vacinados, seguido por análise de FACS para medir a proliferação dessas células e analisar a resposta imune com maior detalhe. Um quadro competitivo de quimera de medula óssea é criado pela infusão de células da medula óssea que expressam o receptor da toxina diftérica em camundongos congenéricos irradiados, os quais são então expostos à toxina diftérica. Após uma depleção bem-sucedida, o camundongo é vacinado e anticorpos marcados e tetraméricos são utilizados para identificar linfócitos T CD8 positivos.Reconhecendo o peptídeo específico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de vacinologia, como, por exemplo, como uma vacina atua no nível neurológico, quais são os principais alvos celulares e moleculares da vacina e, mais importante ainda, como podemos melhorar as estratégias profiláticas atuais. Quem demonstrará o procedimento será Sanmen Medina.O nosso gestor de laboratório e eu, para este protocolo, geramos uma vacina influenza reassortida adaptada ao frio utilizando a cepa adaptada ao frio Ann Arbor A/6/60 como base, acoplada à hemaglutinina e a uma neuraminidase modificada da cepa A/PR/8/34.Uma parte da sequência da haste proteica do gene da neuraminidase é substituída por uma curta sequência de cDNA que codifica o peptídeo de síntese fecal de frango. Esse peptídeo é altamente imunodominante na classe H dois do MHC de camundongos C 57 black six e atua como um elemento rastreável.Para iniciar, plaque 1.000.002 células T 93 em cada poço de uma placa de seis poços com DMEM contendo 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. Em seguida, prepare quantidade suficiente da mistura de transfeção de plasmídeo para 100 microlitros por poço. Combine um micrograma de cada plasmídeo e complete o tubo com meio celular Opti-MEM pré-aquecido até 50 microlitros em outro tubo.Adicione o dobro do volume de lipectomia 2000 correspondente à quantidade total de plasmídeo a ser transfectado e complete o tubo até 50 microlitros com opti MEM antes de adicionar a mistura de transfeção às células. Deixe repousar por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microlitros da mistura de transfeção a cada poço e transfira a placa para uma incubadora por 16 horas.No dia seguinte, troque o meio por DMEM contendo 0,3% de BSA e 1% de penicilina-estreptomicina. Em seguida, transfira as células para 33 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Após cinco horas.Adicione uma camada de um milhão de células permissivas ao vírus da gripe MDCK em DMEM suplementado com tripsina. Mantenha os cultivos em cocultura por dois a três dias em regime de incubação a 33 °C para gerar e amplificar o vírus. Posteriormente, remova os detritos por meio de uma centrifugação de cinco minutos a 260 G. Em seguida, colete os sobrenadantes e inocule ovos embrionados de galinha com nove a dez dias de idade em condições estéreis.Para tanto, faça um orifício no topo da casca do ovo e adicione o vírus em uma diluição de 100 x 10 x ou um x. Cubra a casca do ovo com cera derretida utilizando um cotonete e incube os ovos de galinha inoculados por três dias a 33 graus Celsius. Posteriormente, colete o líquido alantoico dos ovos infectados.Lave as cascas dos ovos com etanol 70%. Abra o ovo com uma leve rachadura na parte superior e remova a membrana de Toic usando pin&ccedil;as est&eacute;reis. Utilize uma pipeta de 10 mililitros para coletar o maior volume poss&iacute;vel de fluido.Normalmente seis a 10 mililitros. Centrifugue o fluido a 260 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius e transfira o fluido clarificado de Alan Toic para novos tubos. Após anestesiar um camundongo doador e acessar cirurgicamente o mediastino, retire os linfonodos usando pinças curvas.Transfira os linfonodos para uma placa de seis poços contendo um mililitro de DMEM. Após remover qualquer tecido conjuntivo ou adiposo ao redor do linfonodo, fixe o linfonodo com uma agulha e abra-o com a outra agulha. Isso deve resultar na liberação de células do interior do linfonodo para o meio, permitindo a coleta das células.Primeiro, passe todo o material tecidual através de um filtro de náilon de 70 mícrons para obter uma suspensão de células pronta para centrifugação. Re-suspenda o pellet celular em dois mililitros de tampão de lise de hemácias. Deixe a reação de lise ocorrer por três minutos à temperatura ambiente e encerre-a com a adição de dois mililitros de PBS gelado; prossiga com a marcação das células de acordo com o protocolo descrito no texto.Certifique-se de usar a técnica de agitação da placa para remover e descartar o sobrenadante antes da incubação com o anticorpo. Rotule as células T doadoras de camundongos transgênicos para o TCR disponíveis comercialmente, incubando 5 milhões de células em um mililitro de PBS com CFSE a cinco micromolares. Deixe a incubação prosseguir por 20 minutos a 37 graus Celsius no escuro.Em seguida, colete as células a 2 milhões por 100 microlitros de PBS e infunda camundongos congenéricos receptores com uma dose de 100 microlitros por injeção no seio retro-orbital. Após três a cinco dias, eutanazie os camundongos, retire os linfonodos mediastinais e prepare uma suspensão simples de células para citometria de fluxo. Como anteriormente.Em seguida, identifique as células doadoras corando as suspensões simples de células em um coquetel de anticorpos. Para a análise, mantenha o canal FL1 do citômetro de fluxo aberto para determinar o perfil de diluição de CFSE.Após remover e higienizar as tíbias e fêmures de um camundongo eutanasiado, colete-os em uma placa com DMEM. Corte as extremidades dos ossos usando tesoura afiada e lave a medula óssea para o DMEM. Agora, utilizando métodos padrão, irradie camundongos fêmeas com seis a oito semanas de idade usando um irradiador com fonte de césio-137. De duas a quatro horas após a irradiação, anestesie os camundongos e transplante neles células da medula óssea doadoras por meio de injeção no seio retro-orbital com 2 milhões de células em 100 microlitros de PBS. Durante as próximas duas semanas, forneça aos camundongos de 2,5 a 5 miligramas de Baal por quilograma em sua água de beber.A partir de dois dias antes da vacinação, administre 50 nanogramas de DT diluídos em 50 microlitros de PBS gota a gota diretamente nas narinas de camundongos anestesiados. Continue este tratamento por três dias após a vacinação. Consulte o protocolo textual para obter detalhes sobre como gerar o modelo final de camundongo.Vacine os camundongos com influenza atenuada recombinante viva por meio de injeção intranasal sob anestesia. Administre 1000 PFU da vacina utilizando uma pipeta de 200 microlitros em 50 microlitros de PBS. A geração de vacinas recombinantes contra influenza atenuadas vivas pode ser obtida por transfeção de plasmídeos que codificam os oito segmentos do vírus da influenza sob o controle de promotores bidirecionais. Uma vacina contra influenza adaptada ao frio geralmente contém seis segmentos de uma cepa adaptada ao frio, bem como as proteínas HA e NA da cepa de influenza de escolha, como H um N um.A adaptação ao frio permite a replicação restrita do vírus a 33 graus Celsius, a temperatura do trato respiratório superior em camundongos e humanos, mas não permite a replicação no trato respiratório inferior, de modo que não pode resultar em pneumonia por fusão. A PCR foi utilizada para substituir uma região conservada no talo da neuraminidase viral por um peptídeo derivado de OVA rastreável. O modelo com peptídeo rastreável foi inoculado em camundongos entre três e seis dias após a vacinação.A proteína rastreável syn fecal foi detectada nos linfonodos drenantes do pulmão. A citometria de fluxo multiparamétrica foi utilizada para quantificar em tempo real a apresentação de antígeno derivado da vacina. Da mesma forma, a infusão de linfócitos T específicos para syn fecal permitiu a quantificação das respostas de linfócitos T CD8 específicas à vacina, a fim de avaliar funções dependentes de genes durante a vacinação.Utilizou-se um modelo murino que combina a tecnologia DTR e competição de quimerismo medular. Assim, a perda da função gênica foi direcionada a compartimentos celulares específicos ao longo das respostas imunológicas à vacinação. Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como analisar as vias moleculares e fisiológicas envolvidas na modulação da imunidade induzida por vacinas no hospedeiro.Além disso, esta técnica fornecerá novas perspectivas na determinação dos alvos celulares da vacina, avançando assim na avaliação de novas plataformas vacinais.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Lenhard, A. et al. Um modelo camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença agravada pela idade. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um modelo de co-infecção em camundongos no qual o vírus da gripe desencadeia a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno. Ele descreve as etapas envolvidas na colonização bacteriana, infecção viral e progressão da doença.

Um modelo de camundongo para estudar a transição patogênica de Streptococcus pneumoniae após coinfecção viral

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Este vídeo demonstra a imunização intranasal com BCG em camundongos, ativando respostas imunes inatas e adaptativas, levando ao desenvolvimento de células T de memória residentes no pulmão e células B efetoras, aumentando assim a proteção contra infecções por Mycobacterium.

Imunização Intranasal com BCG em Modelo de Camundongo

O vídeo mostra um método para criar vírus influenza recombinantes adaptados ao frio. Envolve a transfecção de células humanas com plasmídeos bidirecionais, seguida de incubação em incubação de temperatura mais baixa para produzir vírus adequados para a produção de vacinas, caracterizada por replicação reduzida em condições mais quentes.

Geração de vírus influenza vivos atenuados recombinantes para vacinas

Demonstramos o procedimento para inoculação intratraqueal de Haemophilus influenzae no trato respiratório inferior de camundongos. Esta é uma ferramenta muito útil para estudar as vias de sinalização que regulam a inflamação das vias aéreas em modelos de camundongos.

Administração intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

Este protocolo fornece instruções para administração intranasal de IAV e análise a jusante de danos pulmonares em camundongos e alterações transcricionais associadas aos tipos de células pulmonares.

Modelagem do Reparo Alveolar Pulmonar Displásico e Funcional após Infecção por Influenza

Aprenda a avaliar a imunidade adaptativa vacinal usando vacinas recombinantes de influenza atenuadas em camundongos quiméricos. Este método rastreia migração de células dendríticas e proliferação de linfócitos T CD8+ para compreender respostas imunes.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

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