Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

O objetivo geral deste procedimento é projetar construções tubulares para regeneração do tecido vascular. Isso é feito combinando primeiro colágeno tipo um e células musculares lisas em geometria cilíndrica com o uso de uma técnica de moldagem. O segundo passo é amadurecer a construção em um biorreator estático projetado especificamente.

Em seguida, as construções maduras são cuidadosamente colhidas e as células endoteliais são assentadas no lúmen da construção usando um ator de biorreator de parede rotativa. Por fim, histologia, ensaios metabólicos e testes mecânicos são realizados para avaliar as propriedades dessas construções tubulares. A originalidade dessa técnica é que ela usa apenas uma etapa para combinar células e colágeno para produzir uma construção de engenharia de tecidos com propriedades mecânicas direcionadas sem qualquer tratamento físico ou químico adicional.

Além disso, a construção pode ser facilmente manipulada graças a garras de design específico, que permitem sua manipulação e elos finais. Este método pode fornecer uma visão da interação entre as células e a matriz extracelular durante o crescimento e a remodelação para a regeneração do tecido vascular. Além disso, pode ser aplicado em vários tecidos-alvo, como tendões, enxertos de pele, adesivo cardíaco e sistema nervoso.

Para começar, fabricar e montar o biorreator estático conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, estão incluídos detalhes sobre o reservatório e a gaze, a fabricação da empunhadura, a tampa do mandril e as técnicas de montagem e esterilização do molde da carcaça. Em seguida, expanda as células do músculo liso aórtico suíno em um frasco de cultura de tecidos de 175 centímetros quadrados até que estejam 90% confluentes. Usando técnicas de cultura padrão, colha as células e ressuspenda-as a 4 milhões de células por mililitro em meio de cultura completo.

Em seguida, combine uma parte de solução tampão, duas partes de solução de colágeno estéril a quatro gramas por litro e uma parte de suspensão celular. Nesta ordem, meça o pH da mistura e certifique-se de que esteja entre pH 7,0 e 7,4. Em seguida, despeje suavemente a mistura de colágeno celular no complexo de moldes da caixa montada.

Certifique-se de que não haja bolhas de ar na mistura. Deixe o gel de colágeno descansar em temperatura ambiente por uma hora em um ambiente estéril. Após uma hora, remova o tubo da caixa e transfira cuidadosamente a construção para o reservatório contendo 35 mililitros de meio de cultura pré-aquecido.

Incubar a construção em posição vertical por uma ou duas semanas de maturação estática. Mudar o meio de cultura de dois em dois dias, aspirando o meio antigo da porta do septo inferior e reabastecendo o reservatório com uma quantidade equivalente de cultura fresca. Média. Se desejar, colete um mililitro do meio de cultura antigo e fresco em cada troca de meio para análise bioquímica a cada hora durante as primeiras 12 horas e a cada 24 horas a partir de então.

Remova a construção do meio de cultura em condições estéreis e coloque-a ortogonalmente no caminho de um interferômetro a laser de varredura para medir a espessura da construção após uma a duas semanas de maturação estática. Transfira o biorreator para uma capa de cultura de células e remova suavemente a construção de seu mandril. Depois de livre, coloque-o em uma placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro contendo 40 mililitros de meio de cultura fresco.

Em seguida, configure um testador micromecânico equipado com uma célula de carga de cinco a 10 Newton e garras que se estendem até um banho de PBS mantido a 37 graus Celsius. Remova a construção de sua placa de Petri e conecte-a a dispositivos de preensão especializados para testes longitudinais e projetados para conectar à parte de gaze da construção sem esmagar o gel. Use fita de Teflon para evitar qualquer deslizamento dos dispositivos de preensão durante o teste.

Em seguida, monte a construção no testador micromecânico. Em seguida, execute um teste de fadiga na direção longitudinal, primeiro esticando a construção até seu comprimento de bitola inicial e segurando-a por 10 minutos. Em seguida, aplique 30 ciclos de uma tensão cíclica de 10% a uma taxa de 5% por segundo.

Aumente a deformação em etapas incrementais de deformação cíclica de 10% até que a amostra não realize testes na direção circunferencial. Primeira seção do espécime em construções de anel de 10 milímetros de comprimento. Em seguida, monte os anéis nas barras de aço inoxidável usadas no lugar das alças.

Tal como acontece com os testes de direção longitudinal, primeiro, estique a construção até seu comprimento de bitola inicial e segure-a por 10 minutos. Em seguida, aplique 30 ciclos de uma tensão cíclica de 10% a uma taxa de 5% por segundo. Uma vez que a construção tenha amadurecido e tenha sido removida de seu mandril, fixe a construção que ambas as extremidades do reservatório e coloque-a no conjunto do reservatório.

Como mostrado aqui. Encha o exterior do reservatório com 30 mililitros de cultura. Média. Em seguida, preencha 75% do volume luminal da construção com uma mistura de proteínas e, em seguida, feche as duas extremidades da construção.

Para evitar qualquer vazamento da solução proteica, coloque o biorreator dentro de uma incubadora e gire o biorreator em 4,02 vezes 10 elevado a cinco GForce negativos por uma hora para revestir a superfície luminal com proteínas enquanto o lumin está sendo revestido. Colha células da veia umbilical humana e células ciais cultivadas com técnicas padrão quando estiverem 90% confluentes Resus suspende as células e suplementou o meio de cultura M1 99. Em seguida, veja a veia umbilical humana e as células uroteliais no lúmen da construção.

Com a densidade de 1000 células por centímetro quadrado, feche as extremidades superiores da construção para evitar qualquer vazamento da solução celular. Incube as construções hospedadas na cultura do biorreator de parede rotativa por dois dias a uma rotação constante de 4,02 vezes 10 elevado à força 5G negativa. Durante a maturação estática das construções do vaso, o diâmetro externo das estruturas de elevação celular diminuiu rapidamente.

Como mostrado aqui, o diâmetro dos construtos reduziu em 60% de seu valor inicial no primeiro dia de cultura estática. No sétimo dia, os construtos reduziram quase 85% Os ciclos de deformação longitudinal e circunferencial dos construtos seguiram as propriedades viscoelásticas típicas dos construtos baseados em colágeno. No geral, as construções foram mais fortes na direção longitudinal em comparação com a direção circunferencial na mesma faixa de deformação, a coloração tricônica de Massen realizada nas construções endoteliais mostrou um endotélio altamente homogêneo.

As células musculares lisas exibiram morfologia fusiforme e apareceram homogeneamente dispersas através da parede, enquanto as células endoteliais apareceram bem espalhadas no lado luminal. Após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em biomecânica e medicina regenerativa explorarem o comportamento mecânico de tecidos modificados e nativos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter agora uma boa compreensão de como as construções vasculares podem ser rapidamente projetadas ma e, finalmente, tornar-se fortes o suficiente para serem manuseadas e usadas para condicionamento mecânico em um ator dinâmico. Esperamos que nossos esforços e resultados tenham convencido você sobre o alto potencial das células no modelo de matriz extracelular para o desenvolvimento de tecidos funcionais biológicos.