Name: Tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz UV: Eficácia Contra alta Titer contaminação bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a reduzir contaminação bacteriana em produtos plaquetários usando riboflavina e luz UV. Este método inativa patógenos enquanto preserva a qualidade dos componentes sanguíneos para transfusões mais seguras.

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Os autores não têm agradecimentos.

1. Preparação: suspensão de bactérias <ol><li> A partir de uma placa de cultura de estrias, inocular assepticamente uma única colónia em um frasco de 250 ml esterilizado, contendo 100 ml do meio de crescimento apropriado (Tabela 1) por meio de ansa de inoculação estéril. </li><li> Colocar o frasco dentro de um incubador com agitação orbital a as condições adequadas (Tabela 1) durante 1-2 dias, verificando-se o crescimento periodicamente. Defina a velocidade do agitador a 140 RPM. </li><li> Transferir assepticamente a suspensão bacteriana em dois tubos de 50 ml estéreis cónicos e os tubos de centrífuga a 3000 xg durante 20 min a 23 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender cada pellet bacteriano com 15 ml de água de peptona estéril. Vortex conforme necessário. Combine a cultura de bactérias suspensas em um tubo / container. </li><li> Titule a cultura de reserva em triplicado por seção 4 para determinar o título cultura estoque. </li><li> Leve à geladeira por até 2 semanas a 477; 2 ° C até ser necessário. Re-título na cultura no momento da utilização, ver passo 4.8. </li></ol> 2. Preparação de plaquetas produto: <ol><li> Recolha um produto de plaquetas humano aférese padrão em um banco de sangue credenciada. O produto de plaquetas deve atender às seguintes especificações de coleta: 90-360 ml de volume e 0,8 -3,8 x 10 6 plaquetas / ul concentração. <ol><li> Certifique-se de que o produto de plaquetas tem descansado para um mínimo de 2 horas antes do processamento para redução de patógenos. Armazenamento dos produtos a 22 ± 2 ° C num incubador de plaquetas sem agitação durante estes 2 h. Depois de duas horas de garantir que o produto de plaquetas é agitada a 22 ± 2 ° C num incubador de plaquetas. Use o produto por até 22 horas após coleta. </li></ol></li><li> Utilizando uma seringa de 3 ml de remover uma amostra de 2 mL para medir a 22C do produto em plaquetas de pH. Use um analisador de gases de sangue para garantir que o produto tem um pH&gt; 6.6. Utilizar a mesma amostra para medir a concentração de plaquetas de o produto de plaquetas usando um analisador hematológico. Verifique se o produto atende a 0.80-3.8 x 10 6 plaquetas / ul exigência concentração coleção. </li><li> Visualmente avaliar o redemoinho do produto plaquetas. Se o produto tem um &quot;0&quot; homogeneizar o produto vai ser descartado. </li><li> Mantenha o saco de plaquetas-se sob uma fonte de luz branca direta e aperte o saco de plaquetas brevemente. Visualmente observar o padrão de roda da amostra de plaquetas. Pontuação do produto utilizando a seguinte escala. NOTA: 2 - redemoinho Positivo: roda inhomogeneity visível ao longo de todo o saco com forte contraste. 1 - Intermediate Swirl: Alguns inhomogeneity visível, mas apenas em alguns lugares e com pouco contraste. 0 - redemoinho negativo: homogeneidade Turbid restante antes e depois apertar o saco de plaquetas </li></ol> Processo 3. A riboflavina e UV Light: <ol><li> TranSfer o produto de plaquetas para um riboflavina e UV iluminação de luz e saco de armazenamento utilizando um dispositivo de tubo de encaixe estéril. Após a transferência remover o saco de recolha de unidade de plaquetas vazio usando um aferidor de tubulação e descartar o saco vazio como resíduo bioinfectante. </li><li> Remover uma bolsa de 35 ml de 500 mM riboflavina solução estoque de sua luz invólucro exterior de protecção. Doca estéril o kit de riboflavina para a linha de entrada do tratamento e armazenamento de saco. Deixar o conteúdo para drenar para dentro da unidade de plaquetas. </li><li> Pendure a bolsa / tratamento e armazenagem saco riboflavina definido a partir da bolsa riboflavina e expressar suavemente ar residual para fora do tratamento e armazenamento de saco e para o saco de riboflavina. Assegurar uma pequena quantidade de produto de plaquetas também é expresso na bolsa de riboflavina para enxaguar qualquer riboflavina residual no produto de plaquetas. Permitir que a solução riboflavina e plaquetas drenar de volta para o tratamento e armazenamento de saco e, em seguida, apertar a linha de entrada. Retire o saco vazio nos riboflavinaing um aferidor de tubulação e descartar o saco vazio como resíduo bioinfectante. </li><li> Doca estéril uma &quot;linha 6 tubos com conector de seringa fêmea para a linha de entrada da iluminação e saco de armazenamento. Anexar uma seringa de 10 ml (remover o êmbolo) na conexão seringa feminino. </li><li> Adicionar assepticamente 5 ml de bactérias de ações para o corpo da seringa através de uma pipeta. Abrir o grampo na linha de entrada e permitir que a bactéria seja drenado para o produto de plaquetas. Lavar o corpo da seringa, permitindo que algum produto de plaquetas a fluir de volta para o corpo da seringa de 10 ml. Remover o tambor da seringa de 10 ml. </li><li> Assepticamente anexar uma seringa de 30 mL e lavar a porta de entrada de um mínimo de duas vezes para assegurar que as bactérias banco é misturado no produto de plaquetas. Depois que o produto é bem misturado, utilizar uma seringa limpa 5-10 ml e remover uma amostra de 2 ml pré-tratamento. Utilizando uma nova seringa assegurar que o ar introduzido a partir do passo a inoculação ou amostragem passo é removido. <ol><li> Titular a amostra pré-tratamento por seção 4. </li></ol></li><li> Remova a linha de entrada do tratamento e armazenamento de saco e pesar o produto. </li><li> Colocar o produto para o iluminador e seguir os comandos de ecrã para começar um tratamento de plaquetas padrão. <ol><li> Digite na Operator ID. </li><li> Seguros e montar o saco para a placa iluminador. </li><li> Digite o ID da amostra para o Iluminador usando o leitor de código de barras ou o teclado de entrada manual. </li><li> Tipo de produto Scan. </li><li> Fechar o grampo de quartzo. </li><li> O dispositivo de iluminação irá entregar automaticamente 6,24 J / ml de energia. O tempo de tratamento típico demora 5-10 min. </li></ol></li><li> Após o tratamento doca estéril uma &quot;linha 6 tubos com conector de seringa fêmea para a linha ampola da amostra de tratamento e saco de armazenamento. Verifique se o produto é bem misturado e em seguida, anexar uma seringa de 5 ml e remover um 2 ml da amostra de pós-tratamento. <ol><li> Titule a pós-tratamento samsoas por seção 4. </li></ol></li></ol> 4. bacteriana Titer <ol><li> Estimar o título das amostras de pré-tratamento e pós-tratamento e preparar o número apropriado de tubos de 5 ml de diluição necessário para efectuar uma diluição em série ponto final de cada amostra. Assepticamente encher os tubos necessários com 1,8 ml de água peptonada. </li><li> Titer cada amostra utilizando um regime de diluição em série de 10 vezes. Transferir assepticamente 0,2 ml da amostra não diluída para o primeiro tubo de diluição (10 -1). Vortex este tubo de diluição e de transferência de 0,2 ml para o próximo tubo de diluição. Continuar a diluição em série através do número necessário de diluições. <ol><li> Transferência assepticamente 100 ul de cada diluição a ser revestida a uma placa de agar apropriado (Tabela 1). </li></ol></li><li> Usando um espalhador de células estéril, distribuir uniformemente a amostra em cada placa de ágar. </li><li> Inverter e incubar as placas nas condições apropriadas ( <strong&gt; Tabela 1) por 1-2 dias de testes para o crescimento periodicamente. </li><li> Contagem de placas com 30-300 colônias. As placas contendo mais de 300 colônias são considerados demasiado numerosos para contar (TnTc). As placas que continham menos de 30 colónias são considerados abaixo do limite de quantificação (LOQ). </li><li> Calcula-se a título de cada amostra de teste e gravar os resultados como CFU / ml. <ol><li> Utilize a seguinte equação para calcular CFU / ml: <img alt="Equação 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Se não houver colônias na placa de diluição menor, use a seguinte equação para calcular o limite de detecção (LOD): <img alt="Equação 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> e <img alt="Equação 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Onde: N = número de partículas menor (CFU) em produto que pode ser detectado com segurança. P = probabilidade de que um microorganismo será não detectado; para 95% de confiança de detecção de um microrganismo, P = 0,05. V = volume total do produto em ml v = volume banhado (ml) x nível de diluição de placa </li></ol></li><li> Para controlo negativo, placa 0,5 ml de peptona a água que é utilizado para as diluições em série em cada uma das duas placas de agar. Utilizar o mesmo tipo de placa como as amostras a serem testadas. Inverter e incubar a placa em condições adequadas por 1-2 dias a verificação de crescimento periodicamente. <ol><li> Se o crescimento é observado em qualquer placa de ágar, a garrafa de água peptonada usado deve ser eliminado; os resultados do estudo também são invalidados. </li></ol></li><li> Para Controlo Positivo, re-titulação da cultura de reserva de bactéria que foi usado. Inverter e incubar as placas com as condições adequadas para 1-2 dias para verificar o crescimento periodicamente. O título deve ser de ± 1,0 log ufc / ml do registroed título de estoque (ver secção 1.5) para o estudo seja considerado válido. </li></ol>

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</ol>

Todos os autores deste trabalho está empregado atualmente pela Terumo BCT, desenvolvedora e fabricante do sistema Mirasol PRT. Taxas de publicação do video-artigo foram pagos pela Terumo BCT.

Triagem bacteriana tornou-se prática comum nas instituições bancárias de sangue e para muitos locais que serve como o principal método para evitar a transfusão de plaquetas contaminadas com bactérias. Embora o rastreio bacteriana normalmente interdita a maioria de rápido crescimento de bactérias Gram negativas, como S. marcescens, E. coli e E. cloacae, ele se esforça para detectar crescimento lento bactérias Gram positivas como S. aureus, Streptococcus spp., e S. epidermidis 8. Infelizmente, estes três bactérias Gram-positivas estão implicados em para cima de 50% de todas as unidades de plaquetas contaminadas e transfusão de plaquetas dos produtos contendo estes três organismos tem conduzir a mortalidade dos pacientes 1. Rastreio bacteriano baseia-se na titulação bacteriana num produto de plaquetas de ser suficientemente elevada de modo a que pelo menos um organismo está contido dentro do típico 4-8 ml da amostra de rastreio. Se o título bacteriana não é suficientemente elevado para uma bactéria para ser capturado no volume de amostra 4-8 ml, a unidade está incorretamente sinalizado como negativa e ele é liberado para transfusão. Uma abordagem alternativa ao rastreio bacteriana pode ser empregar um processo de pró-activo que pode ser realizada em todas as unidades de plaquetas e que pode tornar os organismos contaminantes como não funcional. Neste estudo, os títulos elevados de bactérias foram propositadamente adicionadas às unidades de plaquetas para testar a capacidade de redução total do processo de redução de luz patógeno riboflavina e UV. Embora as cargas bacterianas testadas neste estudo ultrapassam de longe os normalmente encontrados em produtos de sangue, no momento da doação, este estudo ajuda a demonstrar que o processo de riboflavina e luz UV é capaz de reduzir significativamente a título de bactérias viáveis ​​numa unidade de plaquetas contaminado por 2,6 a 5,4 log (% de redução 99,7-99,9996 bactérias contaminantes) (Figura 2). Para obter uma accuravalor da redução log te, é fundamental que o operador tem boa técnica asséptica, juntamente com habilidades de pipetagem precisos ao realizar as etapas de titulação bacterianas. Pipetagem imprecisa ao realizar diluições em série podem conduzir a uma acumulação de erros, assim, uma medição título impreciso. Os dados coletados neste estudo apoia o trabalho anterior com riboflavina e luz ultravioleta, que desafiou o sistema contra baixo nível, bacteremia clinicamente relevantes (&lt;20 UFC / unidade). O estudo anterior foi concebido para mimetizar um evento contaminação clínica real e os resultados mostraram riboflavina e luz UV foi eficaz na prevenção do crescimento de bactérias ao longo do período de armazenagem de plaquetas de 7 dias. Modelando com base nos dados do estudo anterior sugere que as estimativas de risco de contaminação bacteriana de corrente de produtos de plaquetas pode ser reduzida em tanto quanto 98% em relação aos níveis de corrente 8. O processo de riboflavina e luz UV compara favoravelmente com tela bacterianaing, que só demonstrou uma eficácia de 66% para detectar contaminantes bacterianos em unidades de plaquetas quando desafiado com uma carga bacteriana clinicamente relevantes 8. Tal como acontece com todas as tecnologias, o tratamento PRT de produtos de plaquetas para evitar complicações associadas com unidades de plaquetas contaminadas com bactérias tem as suas limitações. PRT sistemas não são eficazes contra os esporos bacterianos e não inactivar endotoxinas, mesmo se, assim, um sistema PRT pode inactivar títulos elevados de bactérias Gram-negativas da endotoxina restante ainda pode causar choque séptico no receptor. PRT é melhor realizada precocemente durante o armazenamento antes que as bactérias podem se propagar para altos títulos. Em conclusão, conforme demonstrado pela combinação destes dois estudos, o processo de riboflavina e luz UV é eficaz em reduzir as cargas bacterianas de ambas as bactérias gram negativas e gram positivos e podem oferecer uma alternativa viável para a triagem bacteriana. Rotineiramente treatinprodutos g de plaquetas com riboflavina e luz UV também tem o benefício adicional de reduzir o potencial de transmissão de outros agentes transmitidos pelo sangue, como vírus e parasitas.

A transfusão de plaquetas, plasma, glóbulos vermelhos embalados e produtos de sangue total desempenhar um papel importante na medicina moderna e pode ser utilizada para tratar várias condições médicas, substituir fluidos vitais e, finalmente, salvar vidas. As plaquetas são um produto celular que, ou são isoladas a partir de sangue total, e reunido em uma dose ou transfusable são recolhidos através do processo de aférese plaquetária. O principal papel de plaquetas no corpo é para parar o sangramento em locais de feridas e para ajudar a manter a hemostasia. Pacientes que sofrem de uma contagem de células de plaquetas baixa (trombocitopenia) são suscetíveis a eventos hemorrágicos espontâneos e são transfundidos com plaquetas de trazer sua contagem de células de plaquetas para trás em um intervalo normal. Plaquetas recolhidos são armazenados durante um período máximo de 5-7 dias e são armazenadas a 22 ± 2 ° C enquanto sob agitação constante. Apesar de as propriedades de transfusões de plaquetas salvar a vida continua a haver um pequeno risco para receptores de transfusão devido a contamination desses produtos por parasitas, bactérias e vírus 11. A implementação de teste de ácido nucleico virai (NAT) diminuiu de forma significativa o risco de transmissão viral de sangue suportados agentes principais, tais como o vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite B (HBV) e o vírus da imuno-deficiência humana (HIV) 5. Uma publicação recente do Canadian Blood Services estima o risco residual para esses agentes a ser de 1 por 8.000.000 doações para HIV, 1 por 6,7 milhões de doações para HCV e 1 por 1.700.000 doações para HBV 15. Embora as bactérias normalmente angariar menos atenção do público em geral, a frequência de contaminação bacteriana em produtos de plaquetas foi estimado para ser tão alta quanto 1: 1000 7 e porque milhões de produtos de plaquetas são transfundidos cada ano muitos destinatários estão expostos a potenciais complicações fatais como sepse 6. A investigação sugere que a carga bacteriana no momentode contaminação é baixo, &lt;100 unidades formadoras de colónias (UFC) / produto 2,16, no entanto, o ambiente rico em nutrientes e temperatura ambiente de armazenamento permite que bactérias contaminem a proliferar a perigosamente altos títulos antes da transfusão. Atualmente, os métodos só aprovados disponíveis para evitar que os produtos contaminados por bactérias de chegar a um destinatário de plaquetas é através do uso de sistemas de cultura de base e ponto rápido dos testes de cuidado. Resumidamente, para os sistemas de cultura de produtos à base de plaquetas são armazenadas em um agitador a 22 ° C durante 12-24 h, para permitir a proliferação de bactérias no produto, no qual uma amostra de 4-8 mL é retirada a partir do produto de plaquetas e inoculados num frasco contendo meio nutriente. O frasco é colocado num instrumento que monitora o frasco para o crescimento bacteriano. Se o instrumento detecta o crescimento bacteriano dentro da garrafa que é apanhado e a unidade de plaquetas correspondente é descartado. Enquanto este processo é razoavelmente bem sucedida na detecção de gro rápidoasa organismos, muitas das espécies de crescimento lento não crescem a um título suficientemente elevado para ser detectado, criando, assim, o potencial para as unidades de falsos negativos para ser lançado para a transfusão 7,12,14,16,22. Ao contrário dos sistemas de detecção de cultura com base, ponto de teste rápido cuidados é tipicamente realizada no final do período de armazenagem de plaquetas quando a carga bacteriana tem aumentado significativamente. Os títulos mais elevados são necessários dado que o ponto de cuidados testes são menos sensíveis do que os sistemas de cultura de base, e apenas detectar com fiabilidade, uma vez que as bactérias atingir um título ≥1 x 10 3 CFU / ml 17. No entanto, tais testes podem fornecer resultados dentro de 1 hora da amostragem. A variabilidade no desempenho destes ensaios levaram ao lançamento de um produto falso negativo, causando uma reacção séptico fatal no recipiente 9. Uma forma alternativa para combater o problema da contaminação bacteriana de produtos de plaquetas é através do uso de rotina de um agente patogénico Proc reduçãoess que podem inactivar bactérias contaminantes em vez de tentar detectá-los. Usando riboflavina como um fotossensibilizador, em combinação com luz UV, tem demonstrado reduzir a infecciosidade de uma vasta gama de contaminantes transmitidas pelo sangue patogénicos, incluindo bactérias 3,4,8,10,19-21 .A utilização de riboflavina e UV luz para a redução dos organismos patogénicos é não-tóxico e não-mutagênico, e componentes tratados com luz UV e riboflavina foram mostrados para ser seguro para receptores de transfusão, bem como para aqueles que manipulam produtos derivados de sangue 18. Resumidamente, as moléculas de riboflavina pode associar com os ácidos nucleicos (ADN e ARN) de bactérias, parasitas, vírus e qualquer célula nucleada (por exemplo, células brancas do sangue). A exposição à luz UV ativa riboflavina, causando uma alteração química de grupos funcionais dos ácidos nucleicos (principalmente bases de guanina), impedindo assim a replicação e / ou a transcrição dos ácidos nucleicos e deixando o organismo inactivado 13. Anucleadas como placae permite que as células vermelhas do sangue não são afectados pela química de riboflavina, devido à falta de ácido nucleico. Trabalhos anteriores com a tecnologia riboflavina e luz UV avaliaram um grupo seleto de bactérias usando um desenho experimental destina-se a imitar um produto de plaquetas contaminadas com uma carga bacteriana clinicamente relevante (&lt;20 UFC / produto) 8. O objetivo deste estudo foi avaliar o processo de riboflavina e luz UV contra a contaminação bacteriana título elevado (&gt; 1,0 x 10 5 UFC / ml) em produtos de plaquetas tratadas no plasma, a fim medir a capacidade de redução bacteriana total do sistema. Com base em dados recolhidos a partir de estudos de hemovigilância 1, um painel de comumente ocorrem organismos gram positivas negativas e gram foi selecionado para avaliação neste estudo e incluiu as seguintes espécies: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Neotomae Brucella, Bacillus cereus (forma vegetativa), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Todos os organismos, exceto B. cereus, foram obtidas da ATCC e foi colocada uma prioridade na obtenção de estirpes bacterianas que foram identificados como sendo isolado a partir de componentes do sangue. O B. cereus testados neste estudo é uma estirpe clínica isolada internamente a partir de um produto de plaquetas contaminado.

<table><tbody><tr><td>Iluminador Mirasol</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de Tratamento/Armazenamento Mirasol</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de Hematologia</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&bull; T diff&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de Gases Sanguíneos</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de ancoragem estéril</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de plaquetas</td><td>Helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora orbital</td><td>Shaker Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora seca</td><td>Fisher</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>Classe II A/B3 Gabinete de biossegurança</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Selador de tubos</td><td>Sebra</td><td>Centrífuga de mesa Smart Sealer II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 30 ml</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diluição de 5 ml</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>Repeat Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &micro; l Ponta de Filtro</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipeta Serrológica Descartável</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta Serrológica Descartável</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &micro; M Riboflavina</td><td>Terumo BCT</td><td>35 mL 500 &micro; M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Brucella com 5% de Sangue de Cavalo</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>Infusão de Cérebro e Coração</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>Água Peptonada</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de Soja Tripticase</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Tripticase Soja</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cavalo Inativado por Calor</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz uv: eficácia contra alta titer contaminação bacteriana

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Contaminação de unidades de plaquetas por bactérias tem sido reconhecida como um risco significativo de transfusão, devido às suas condições de armazenamento pós-doação. Os produtos são rotineiramente armazenadas a 22 ° C num agitador de agitação, uma condição que pode promover o crescimento bacteriano. Embora o número total de bactérias que se acredita ser introduzida num produto de plaquetas é extremamente baixa, estas bactérias podem multiplicar-se a um título muito elevado antes da transfusão, potencialmente resultando em efeitos adversos graves. O objectivo deste estudo foi o de avaliar um processo de redução de agentes patogénicos riboflavina base contra um painel de bactérias que foram identificadas como contaminantes comuns de produtos de plaquetas. Este painel incluiu os seguintes organismos: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Cada unidade de plaquetas foi inoculado com uma alta carga bacteriana e as amostras foram removidas bOTH antes e após o tratamento. Um ensaio de formação de colónias, usando um esquema de diluição ponto final, foi usado para determinar os pré-tratamento e pós-tratamento títulos bacterianos. Redução log foi calculada subtraindo-se o título pós-tratamento do título de pré-tratamento. Foram observadas as seguintes reduções de log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) e K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Os resultados deste estudo sugerem que o processo pode ajudar a diminuir o risco de eventos adversos graves transfusão associados à contaminação bacteriana.

A redução de onze diferentes espécies bacterianas foi avaliada utilizando o processo PRT baseado riboflavina e luz UV. Estes agentes representam alguns dos contaminantes mais comuns de produtos de plaquetas e incluem bactérias Gram-positivas e cinco seis organismos gram negativos. Pelo menos seis produtos de plaquetas foram avaliados por organismo e cada produto foi inoculado com bactérias suficiente para se obter&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml de bactérias título final no produto de plaquetas. Antes do tratamento, foi removida uma amostra para determinar o título de pré-tratamento, após o que o produto foi prontamente plaquetas tratadas com o processo de riboflavina e UV. Após o tratamento dos produtos de plaquetas foram observadas as seguintes reduções de log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), aeruginosa 4,7 log P. (99,998%) e K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (Figura 2). Todas as unidades satisfeitas as especificações do sistema conforme indicado anteriormente para o processo de riboflavina e UV. Testes de redução adicional foi realizada com S. pyogenes usando creme leucocitário plaquetas derivadas. Não foi observada diferença significativa na redução de S. pyogenes em creme leucocitário plaquetas derivadas de plaquetas por aférese contra (dados não mostrados). <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabela 1: As condições de crescimento para as espécies bacterianas avaliadas usando riboflavina e luz UV. Um painel de ambas as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que foram mostrados para contaminar os produtos de plaquetas foram seleccionados para este estudo. As condições de crescimento (temperatura e tipo de mídia) utilizados para propagar e titer os organismos são mostrados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figura 1: processo de redução de luz patógeno riboflavina e UV. Riboflavina foi dissolvido em 0,9% de solução salina a uma concentração nominal de 500 um. A solução foi esterilizada e ligado drenada para cada produto de plaquetas. As bactérias foram adicionados assepticamente para cada unidade de plaquetas e, em seguida, tratada com 6,2 J / ml de energia UV (aproximadamente 6-10 minutos). Neste estudo in vitro a unidade de plaquetas pós-tratamento foram amostrados para determinar o título bacteriano final. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figura 2: Redução de diferentes espécies bacterianas, quando tratados com riboflavina e luz UV riboflavina e luz UV foi usada para reduzir as cargas bacterianas de contaminantes bacterianos comuns de produtos de plaquetas.. A redução log 10 é a diferençaentre a média título de pré-tratamento e da média título pós-tratamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

As condições de armazenamento dos produtos plaquetários criam um ambiente ideal para que os contaminantes bacterianos se multipliquem a níveis perigosos. O objetivo deste estudo foi usar um ensaio de formação de colônias para avaliar um processo de redução de patógenos à base de riboflavina contra contaminação bacteriana de alto título em produtos plaquetários humanos.

Tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz UV: Eficácia Contra alta Titer contaminação bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a redução de contaminantes bacterianos comuns em produtos plaquetários utilizando um processo de redução de patógenos baseado em riboflavina e luz ultravioleta. Isso é realizado primeiramente preparando um estoque de bactérias com alto título. O segundo passo é obter um produto plaquetário humano e avaliar a qualidade celular da unidade.Em seguida, a unidade de plaquetas é dosada com riboflavina e inoculada com uma concentração conhecida de bactérias. O passo final consiste em tratar a unidade com luz ultravioleta. Por fim, a redução bacteriana é medida comparando-se amostras antes e após o tratamento quanto à presença de bactérias viáveis, determinada por meio de um ensaio de plaqueamento por diluição até o ponto final.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o rastreamento bacteriano, é que a riboflavina e a luz ultravioleta podem inativar outros patógenos, como HIV, HCV, malária e Babesia. As implicações dessa tecnologia vão além dos patógenos transmitidos pelo sangue, pois a tecnologia também é capaz de inativar glóbulos brancos e produtos sanguíneos doados, os quais estão associados a eventos adversos de transfusão, como a doença do enxerto contra o hospedeiro associada à transfusão.Eu inicialmente tive a ideia de usar este método para inativar patógenos no sangue por meio de estudos que realizava sobre a interação de compostos, especificamente compostos fotocinéticos, com ácidos nucleicos. A técnica utiliza o fato de que patógenos, ao contrário de hemácias, plaquetas e proteínas plasmáticas, contêm ácidos nucleicos genômicos essenciais para a replicação e para a transmissão da doença. Assim, ao direcionar a química dos ácidos nucleicos no ambiente dos produtos sanguíneos presentes, podemos inativar os patógenos de forma mais seletiva, preservando ao mesmo tempo a qualidade dos componentes de hemácias, plaquetas e proteínas plasmáticas. Demonstração do procedimento.Hoje estarão Nick HOA, cientista do laboratório, e Denise Gilmore, técnica de laboratório. Primeiro, prepare um frasco estéril de 250 mililitros contendo 100 mililitros de meio de crescimento específico para a bactéria de interesse. Usando um alça de inoculação estéril, inocular uma única colônia bacteriana de uma placa de cultura por esgotamento no meio.Em seguida, coloque o frasco em um incubador com agitação orbital. Ajuste a velocidade do agitador para 140 RPM e incube a cultura por um a dois dias. Verifique periodicamente a cultura quanto ao crescimento bacteriano.Após a incubação, transfira a suspensão bacteriana para dois tubos cónicos estéreis de 15 mililitros. Centrifugue os tubos a 3000 ×g durante 20 minutos a 23 °C. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet bacteriano com 15 mililitros de água estéril para peptídeos.Vortex as tubos para auxiliar na suspensão e, em seguida, reúna as culturas bacterianas ressuspensas para concentrar a cultura estoque. Encha tubos de diluição de cinco mililitros cada um com 1,8 mililitro de água com peptídeo. Transfira 200 microlitros da amostra não diluída para o primeiro tubo, vortex o tubo e, em seguida, transfira 200 microlitros para o próximo tubo.Repita até que a diluição apropriada seja alcançada. Transfira 100 microlitros de cada diluição para uma placa de ágar apropriada. Usando um espalhador celular estéril, espalhe uniformemente. Distribua a amostra pela placa de ágar para uma placa controle negativo.500 microlitros da água com peptídeo em duas placas de ágar. Usando um espalhador celular estéril, distribua uniformemente a amostra sobre a superfície do ágar, inverta todas as placas e incube-as na temperatura apropriada por um a dois dias após a incubação. Se for observado crescimento em qualquer uma das placas controle negativo, a água com peptídeo está contaminada e o título é inválido.Se as placas do controle negativo forem negativas, conte as colônias em todas as placas com 30 a 300 colônias. Em seguida, calcule o título de cada amostra em teste e registre os resultados em poucas unidades por mililitro. Refrigerar os cultivos bacterianos por até duas semanas a quatro graus Celsius.Para garantir a precisão, realize novamente a titulação da cultura antes do uso. Obtenha um produto padrão de plaquetas humanas por aférese de 90 a 360 mililitros, com uma concentração de 0,80 a 3,8 milhões de plaquetas por microlitro. Deixe o saco em repouso por pelo menos duas horas em um incubador de plaquetas a 22 graus Celsius e, em seguida, agite suavemente a 60 RPM até o uso.Retire uma amostra de dois mililitros do produto plaquetário e utilize um analisador de gases sanguíneos a 22 graus Celsius para garantir que o pH esteja acima de 6,6. Usando a mesma amostra, meça a concentração de plaquetas com um analisador hematológico para assegurar que esteja dentro da faixa desejada. Em seguida, inspecione visualmente o saco de plaquetas segurando-o sob uma fonte de luz branca direta.Aperte brevemente o saco e observe o padrão de redemoinho da amostra. Se uma homogeneidade turva permanecer antes e depois de apertar o saco, não utilize as plaquetas com um dispositivo de acoplamento de tubo. Transfira as plaquetas para um saco de armazenamento com iluminação de riboflavina e luz ultravioleta.Remova o saco de plaquetas vazio utilizando um selador de tubos e descarte-o como resíduo biologicamente perigoso. Em seguida, remova a embalagem protetora contra a luz da solução estoque estéril de riboflavina a 500 micromolar. Acople o envelope de riboflavina à linha de entrada do saco de tratamento e armazenamento e drene o conteúdo para dentro da unidade de plaquetas.Em seguida, pendure o bolsão e o conjunto da bolsa de tratamento a partir do bolsão de riboflavina. Pressione suavemente o ar residual para fora da bolsa de tratamento e para dentro da bolsa de riboflavina. Enxágue qualquer riboflavina residual para dentro do bolsão de plaquetas com uma pequena quantidade do produto plaquetário.Deixe a solução de riboflavina e plaquetas drenar de volta para a bolsa de tratamento. Em seguida, feche a linha de entrada com um grampeador. Remova a bolsa vazia de riboflavina usando o selador de tubos e descarte a bolsa vazia adequadamente. Esterilidade.Conecte uma linha de tubo de seis polegadas com conector de seringa fêmea à linha de entrada da bolsa de iluminação e armazenamento. Acople o corpo de uma seringa de 10 mililitros à linha de tubo. Em seguida, adicione cinco mililitros da suspensão bacteriana de estolões ao corpo da seringa.Em seguida, abra o clipe da linha de entrada e permita que as bactérias drenem para o produto de plaquetas. Enxágue o corpo da seringa permitindo que parte do produto de plaquetas reflua. Após a lavagem, remova o corpo da seringa.Acople uma seringa de 30 mililitros e enxágue a porta de entrada pelo menos duas vezes após a mistura completa do produto. Utilize uma seringa limpa de cinco mililitros e colete uma amostra de pré-tratamento de dois mililitros. Use uma seringa nova para remover qualquer ar introduzido no saco.Em seguida, remova a linha de entrada do saco de tratamento e pese a solução de plaquetas. Inicie o tratamento das plaquetas inserindo primeiro o ID do operador e depois fixe o saco no iluminador pla. A seguir, insira o ID da amostra utilizando um leitor de código de barras.Insira o tipo de produto e seu peso no software. Em seguida, feche o grampo de quartzo para entregar automaticamente 6,24 joules por mililitro de energia ultravioleta. O tratamento típico dura de cinco a dez minutos.Enquanto isso, realize a titulação da amostra pré-tratamento após o tratamento com UV, titule uma amostra pós-tratamento para avaliar a sobrevivência bacteriana e, em seguida, titule a cultura bacteriana estoque como controle positivo. A titulação da cultura estoque deve estar dentro de uma unidade logarítmica de UFC por mililitro em relação à sua titulação registrada. A redução de 11 espécies bacterianas diferentes foi avaliada utilizando riboflavina e um processo de tecnologia de redução de patógenos baseado em luz UV.Pelo menos seis produtos de plaquetas foram avaliados por organismo e cada um foi inoculado. Com quantidade suficiente de bactérias, um título final maior que 10.000 UFC por mililitro foi obtido; amostras foram coletadas antes do tratamento, bem como imediatamente após o tratamento com riboflavina e UV, quando comparadas às soluções pré-tratamento. Todas as cargas bacterianas foram reduzidas em pelo menos 2,6 unidades logarítmicas, aproximadamente 400 vezes, pelo tratamento com riboflavina e luz UV.Após esses estudos com bactérias de título elevado, podem ser realizados estudos adicionais utilizando títulos de contaminação mais clinicamente relevantes. Esses realmente representam os níveis de bactérias que poderiam estar presentes nos produtos no momento da doação. O objetivo desses estudos com contaminação de título baixo é avaliar a capacidade do método de impedir o crescimento bacteriano e de mantê-las negativas em culturas durante o período de armazenamento, incluindo períodos prolongados de armazenamento à temperatura ambiente.Após a introdução dessa tecnologia, pesquisadores e profissionais médicos puderam avaliar a capacidade de inativar um amplo espectro de patógenos e utilizar essa tecnologia para prevenir a disseminação de doenças transmitidas por transfusão. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a redução logarítmica de bactérias em um produto plaquetário altamente contaminado tratado com riboflavina e luz ultravioleta.

treatment-platelet-products-with-riboflavin-uv-light-effectiveness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve o processo utilizado por Örebro University Hospital para produzir dose dupla de plaquetas buffy coat concentra preparados a partir de doações de sangue total e tratados com o Sistema de Sangue INTERCEPT para inativação de patógenos.

Preparação e inativação de patógenos de dose dupla de Buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o Sistema de Sangue INTERCEPT

Fonte: Cheng, C., et al. Inativação de patógenos via fotólise de luz visível de riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um método para avaliar os efeitos fototóxicos do mononucleotídeo de flavina (FMN) em bactérias patogênicas. As culturas bacterianas são expostas a concentrações crescentes de FMN e iluminadas com luz visível para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) que danificam os componentes celulares. As bactérias sobreviventes são então quantificadas para...

Inativação de bactérias usando mononucleotídeo de flavina ativado por luz

Fonte: Cheng, C., et al. Inativação de patógenos via fotólise de luz visível de riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).Neste vídeo, uma mistura de reação tamponada contendo L-metionina, nitro azul de tetrazólio (NBT) e mononucleotídeo de flavina (FMN) é irradiada com luz violeta para induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Isso leva à inativação bacteriana e à formação de formazan detectável espectrometricamente.

Quantificação da inativação bacteriana induzida por luz através da geração de espécies reativas de oxigênio

Fonte: Zhao, K., et al. Um modelo In Vitro para Estudar o Efeito da Terapia Fotodinâmica Mediada por Ácido 5-Aminolevulínico no Biofilme de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)O vídeo demonstra um protocolo de terapia fotodinâmica para avaliar os efeitos antibacterianos em biofilmes bacterianos Gram-positivos. Os biofilmes são divididos em quatro grupos: dois recebem um precursor fotosensimizador e dois recebem um tampão. Todos são incubados no escuro, seguidos por exposição à luz...

Tratamento ativado pela luz de biofilmes bacterianos usando um precursor fotosensimizador

Este vídeo demonstra o processo de redução de patógenos à base de riboflavina e luz UV contra a contaminação bacteriana de alto título em produtos plaquetários humanos. Esse processo pode ajudar a diminuir o risco de eventos adversos graves de transfusão associados à contaminação bacteriana.

Um tratamento com riboflavina e luz ultravioleta de produtos plaquetários para eliminar bactérias

Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Este estudo descreve uma abordagem utilizando plasma rico em plaquetas (PRP) para evitar as infecções associadas implante, apresenta o protocolo para a preparação de PRP com a concentração de plaquetas constante, e relata as propriedades antimicrobianas recentemente identificados de PRP e protocolos relacionados para examinar tais propriedades...

PRP como uma nova abordagem para prevenir a infecção: Preparação e<em&gt; In vitro</em&gt; Propriedades antimicrobianas do PRP

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o resultado da aplicação de luz vermelha sobre o crescimento de biofilmes de Candida albicans . Um dispositivo não-coerente de luz vermelha com comprimento de onda de 635 nm e densidade de energia de 87,6 J·cm-2 foi aplicado durante todo o crescimento de biofilmes de Candida albicans por 48 h.

Diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de Candida albicans

Aqui, apresentamos um protocolo para inativar bactérias patogênicas com espécies reativas de oxigênio produzidas durante a fotólise do mononucleotídeo de flavina (FMN) sob irradiação de luz azul e violeta de baixa intensidade. A fotólise FMN demonstra ser um método simples e seguro para processos sanitários.

Inativação de Patógenos via Fotólise de Luz Visível de Riboflavina-5′-Fosfato

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

Este protocolo descreve um método simples e econômico para avaliar a eficácia de potenciais fotossensibilizadores na inativação fotodinâmica antibacteriana (aPDI), usando um formato de placa de 96 poços combinado com uma fonte de luz de painel de LED. Essa abordagem permite o teste simultâneo de várias condições experimentais, incluindo diferentes concentrações, compostos e cepas bacterianas.

Triagem in vitro baseada em LED para avaliação de moléculas fotoativáveis na inativação fotodinâmica bacteriana

Aprenda a reduzir contaminação bacteriana em produtos plaquetários usando riboflavina e luz UV. Este método inativa patógenos enquanto preserva a qualidade dos componentes sanguíneos para transfusões mais seguras.

Tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz UV: Eficácia Contra alta Titer contaminação bacteriana

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