Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada
14 de maio de 2015
Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.
O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo para uma linhagem neural em um cultivo celular monocamada livre de soro. Isso é realizado primeiramente revestindo o recipiente de cultivo com gelatina. Na segunda etapa, as células-tronco embrionárias são dissociadas em uma suspensão de células únicas em meio de diferenciação e diluídas até as densidades de semeadura apropriadas.
No passo final, as células são semeadas na placa revestida com gel ENC. Por fim, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para confirmar o sucesso da diferenciação mediante a visualização dos marcadores neurais de interesse. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois o plaqueamento na densidade apropriada é essencial para obter uma boa diferenciação.
E existem vários fatores que afetam a densidade de semeadura direta e indiretamente. Antes de semear as células, aqueça uma alíquota de gelatina a 1% em banho-maria a 37 graus Celsius até dissolver. Em seguida, misture a gelatina com 500 mililitros de PBS morno e cubra o fundo do recipiente de cultura celular com quantidade suficiente da solução para revestir a superfície enquanto a gelatina estiver revestindo.
Lave duas vezes a cultura subconfluente de células-tronco embrionárias de camundongo com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de reagente de dissociação à cultura. Após dois a cinco minutos, bata levemente no recipiente para desprender a monocamada, formando uma suspensão de células isoladas, e colete a cultura em um volume total de 10 mililitros de meio contendo o reagente de dissociação celular.
Transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue-as. Após a aspiração cuidadosa do sobrenadante, re-suspenda o pellet em 10 mililitros de N2B27 pré-aquecido, pipetando contra a parede do tubo. Para evitar a formação de bolhas, conte as células, registre a concentração e re-suspenda-as no número apropriado de células por unidade de volume por poço em N2B27 pré-aquecido, conforme a tabela.
Em seguida, aspire a gelatina do recipiente de cultura e plaque as células sem agitar o recipiente. Coloque as culturas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Substitua o meio a cada um a dois dias.
Com N fresco dois B 27, as células começarão a se diferenciar e a expressar socks, uma expressão dentro de quatro a seis dias para coloração das células para imagem de imunofluorescência. Remova o meio de diferenciação dos cultivos e fixe as células em 500 microlitros de paraformaldeído 4%. Após 15 minutos, lave e permeabilize as células duas vezes com dois mililitros de PBS com tween. Em seguida, bloqueie qualquer ligação não específica com uma incubação de uma hora das células.
Em um mililitro de PBS tween suplementado com soro em um agitador para placas após a lavagem das células conforme demonstrado anteriormente. Adicione 500 microlitros de IgG de camundongo contra tubulina beta três às culturas para uma incubação noturna no agitador para placas a quatro graus Celsius. No dia seguinte.
Após lavar as células, incubar as amostras no anticorpo secundário anti-IgG de US conjugado com fluoróforo, em temperatura ambiente e protegidas da luz, com agitação, após uma hora. Enxaguar as células novamente e corar com 500 microlitros de DPI por cinco minutos. Finalmente, após uma última lavagem das células, armazená-las em PBS tween por até duas semanas a quatro graus Celsius.
Até o momento da aquisição de imagens. Neste experimento, células-tronco embrionárias de camundongo com um repórter endógeno SOX1 GFP foram utilizadas para acompanhar a diferenciação neural. No sexto dia, as células foram fixadas e coradas para o marcador neuronal beta 3 tubulina.
Na densidade ideal, as células se diferenciaram em progenitores neurais e neurônios, enquanto a semeadura em densidade mais alta resultou em uma diminuição do número de células positivas para SOX1 GFP e beta três tubulina. O volume do recipiente de cultura celular também afeta a densidade de semeadura ideal. Por exemplo, células cultivadas em uma placa de 96 poços exigem uma densidade celular cerca de 10 vezes maior do que essa.
As células foram semeadas em uma placa de cultura de seis poços para atingir as densidades celulares ótimas e duas densidades de confluência. Durante a diferenciação, as células-tronco embrionárias mudam gradualmente sua morfologia. Por exemplo, nestas imagens, pode-se observar a morfologia das células e das colônias dos dias um a seis após o início da diferenciação na densidade celular ótima.
No quarto dia, as células começam a se tornar progenitores neurais, evidenciado pelo aparecimento do sinal fluorescente verde do repórter SOX1 GFP. E no sexto dia, a maioria das células é positiva para SOX1. Embora a presença de algumas células não neurais seja esperada, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como iniciar a diferenciação neural de células-tronco embrionárias de camundongo em cultura celular em monocamada.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em progenitores neurais utilizando um método de monocamada livre de soro. Esta abordagem permite a geração de tipos celulares neurais maduros e é adequada para escalonamento em formato de placas multipoços para triagem de compostos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa com Células-Tronco
Antecedentes
- As células-tronco embrionárias podem diferenciar-se em vários tipos celulares.
- Os progenitores neurais são essenciais para o estudo do desenvolvimento neural.
- Os métodos de cultivo livres de soro podem aumentar a reprodutibilidade.
- A densidade adequada de plaqueamento é fundamental para uma diferenciação bem-sucedida.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para gerar progenitores neurais.
- Facilitar o estudo dos processos de especificação neural.
- Permitir triagem em alta produtividade de compostos que afetam a diferenciação neural.
Métodos Utilizados
- Revestir recipientes de cultura com gelatina.
- Preparar uma suspensão de células individuais de células-tronco embrionárias.
- Plaquear as células em placas revestidas com gelatina.
- Utilizar microscopia de imunofluorescência para confirmar o sucesso da diferenciação.
Resultados Principais
- Diferenciação bem-sucedida de células-tronco embrionárias em progenitores neurais.
- A visualização de marcadores neurais confirma a diferenciação.
- Estabelecimento de densidades ideais de semeadura para diferenciação eficaz.
- O método é escalável para aplicações de triagem de compostos.
Conclusões
- O método de monocamada sem soro é eficaz para a geração de progenitores neurais.
- A imunofluorescência é uma técnica confiável para avaliar a diferenciação.
- Este protocolo pode ser adaptado para diversas aplicações de pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a geração escalonável de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongo em um sistema monocamada definido e livre de soro, apoiando a validação inicial de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta de fármacos em neurociência. O método fornece uma plataforma reprodutível e quantitativa para avaliar os efeitos de compostos na diferenciação neural, facilitando a identificação de compostos líderes e maior confiabilidade preditiva em etapas pré-clínicas. Sua compatibilidade com linhagens repórter e formatos de cultivo em alta densidade permite a integração em fluxos de triagem para estudos de modulação de vias e engajamento de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos de especificação neural e a validação funcional de alvos do neurodesenvolvimento por meio da diferenciação direcionada.
- Valor Operacional: Oferece um sistema definido e livre de soro que reduz a variabilidade e melhora a reprodutibilidade entre experimentos e linhagens celulares.
- Valor Preditivo: Permite a avaliação de alterações induzidas por compostos no rendimento de progenitores neurais e na expressão de marcadores, fornecendo informações sobre o engajamento de alvos e a modulação de vias.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera uma população homogênea de progenitores neurais adequada para triagem de compostos e avaliação fenotípica da diferenciação neural.
- Valor Operacional: Adaptável a formatos multipoços (por exemplo, 96 poços) com otimização escalonável da densidade de semeadura, permitindo aplicações de média a alta produtividade.
- Prontidão para Ensaios: Compatível com imunofluorescência, citometria de fluxo e leituras moleculares para análise multiparamétrica da eficiência de diferenciação e expressão de marcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a progressão da geração de progenitores neurais até a maturação funcional de neurônios e gliócitos, apoiando a modelagem relevante para doenças.
- Redução Mecanística de Riscos: Facilita o estudo do comprometimento da linhagem e da dinâmica da diferenciação utilizando linhagens repórter (por exemplo, SOX1-GFP) para monitorar a especificação neural em tempo real.
- Utilidade Pré-clínica: Permite a avaliação dos efeitos de compostos sobre a maturação neural e a diferenciação gliocítica, apoiando estudos de farmacologia de segurança e de mecanismo de ação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos por meio da investigação mecanicista da diferenciação neural e permitindo o desenvolvimento de ensaios para triagem de compostos em portfólios de neurociência.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias neurodesenvolvimentais e a validação de alvos por meio de diferenciação direcionada e leituras baseadas em marcadores.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios em cultivo em monocamada, sendo a densidade de semeadura um parâmetro crítico para a geração consistente de progenitores neurais.
- Análises: Fornece resultados quantitativos por meio de imunofluorescência (por exemplo, SOX1-GFP, βIII-tubulina) e citometria de fluxo para medir a eficiência de diferenciação e a resposta a compostos.
- Pesquisa Translacional: Conecta a geração precoce de progenitores neurais com a maturação subsequente em neurônios e gliócitos funcionais, apoiando a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Um protocolo definido e escalonável favorece a reutilização em múltiplas linhagens de células-tronco embrionárias, recipientes de cultivo e campanhas de triagem, reduzindo esforços de readequação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de diferenciação neural.
- Valor Operacional: Condições padronizadas e livres de soro melhoram a reprodutibilidade e escalabilidade entre laboratórios e linhagens celulares.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao permitir a avaliação precoce dos efeitos de compostos na determinação da linhagem neural e na eficiência de diferenciação.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos em neurociência por meio da redução de riscos mecanicistas e da validação de vias.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco, técnicas de diferenciação e microscopia de imunofluorescência.
- Depende do acesso a incubadoras de CO2, centrífugas, microscópios e reagentes como gelatina, N2B27, reagentes de dissociação e anticorpos.
- Necessita padronização da densidade de plaqueamento e dos procedimentos de revestimento com gelatina entre diferentes usuários e locais para garantir reprodutibilidade.
- A adaptação a diferentes linhagens de ESC ou construtos com marcadores pode exigir otimização da densidade de semeadura e do tempo de diferenciação.
- Limitações práticas incluem sensibilidade à densidade de plaqueamento e a necessidade de dissociação cuidadosa do monocamada para evitar agregação ou suspensão incompleta de células isoladas.
