Name: Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a diferenciação neural de células-tronco embrionárias de camundongo em cultura monocamada sem soro. Este método permite gerar progenitores neurais para estudos de desenvolvimento cerebral e triagem de compostos.

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Work foi financiado por uma bolsa de estudos de Desenvolvimento e Promoção da Ciência e Tecnologia do Ministério da Educação da Tailândia para W.W. e doações da Tenovus e do Anonymous Trust para M.P.S.

1. Preparação de mídia NOTA: O protocolo baseia-se na utilização de uma mistura de dois meios separados: DMEM / F12 suplementado com suplemento N2 modificado e Neurobasal suplementado com suplemento B27, tipicamente numa proporção de 1: 1. <ol><li> Prepara-se o suplemento N2 modificado por mistura dos componentes num tubo de 15 ml. Não vórtice ou filtrar este; misturar por inversão do tubo até a solução ficar clara. <ol><li> Iniciar pipetando 7,2 ml de DMEM / F12, em seguida adicionar 1 ml de 25 mg / ml de insulina (fez-se em 0,01 M de HCl) e misturar bem por inversão do tubo. É preciso um par de minutos até que a solução é clara. </li><li> Adicionar 1 ml de 100 mg / ml de apo-transferrina (preparados em água), 33 ul de 0,6 mg / ml progesternone (confeccionados a partir de etanol), 100 uL de 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparados em água ), 10 ul de 3 mM de selenito de sódio (preparados em água) e 666 ul de 7,5% de albumina de soro bovino e misturar bem o tubo. Alíquota em 2,5 ml e armazenar a -20 °C por até 2 meses. </li></ol></li><li> Prepare a mídia. <ol><li> Para 250 ml de meio DMEM / F12 adicionar 2,5 ml de N2. Misture bem, mas não agite ou filtro. </li><li> Para 250 ml de Neurobasal meios adicionar 5 ml de suplemento de B27. Misture bem, mas não agite ou filtro. </li><li> Misture a mídia da passos 1.2.1 e 1.2.2 em uma proporção de 1: 1. Em alguns casos, uma mistura 1: mistura 3 pode ser necessárias (suplementado como o 1: 1 mistura no passo 1.2.4). </li><li> Para a mistura de adicionar 0,5 mL de L-glutamina (concentração final 0,2 mM) e 3,5 ul de 2-mercaptoetanol (concentração final 0,1 mM) e misturar bem, sem agitação. Armazene a mídia a 4 ° C por até 3 semanas e evitar a exposição à luz. Esta mistura final é chamada N2B27. </li></ol></li><li> Preparar a solução de gelatina. <ol><li> Prepara-se uma solução de gelatina a 1% em água ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. É importante que o frasco utilizado para este está completamente limpa de detergentes ou os desinfectantes, então recomenda-se que uma nova garrafa éutilizado para isso e é sempre apenas lavado em água ultrapura entre utilizações. Alíquota da solução a 1% em 50 ml de partes alíquotas e manter a 4 ° C, durante meses. </li><li> Aquece-se uma alíquota de 1% de gelatina em um banho de água a 37 C ° até se dissolver e adicionar a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato quente (PBS). Misturar bem e pipetar suficiente para cobrir o fundo de cada poço ou placa. Permitir que a gelatina para revestir a superfície durante pelo menos 30 min. </li></ol></li></ol> 2. plaqueamento das células NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC rato cultivadas em 10% de soro com fator inibidor de leucemia (LIF), a substituição de soro com LIF ou meios livres de soro com proteína LIF e morfogenética óssea 4 (BMP4) ou inibidores de MEK e GSK3 (media 2i) com ou sem LIF. No entanto, o momento ea eficiência da diferenciação pode variar dependendo da mídia e células (ver discussão). Para os experimentos mostrados aqui usamos a linha 46C rato ESC (que tem um repórter EGFP batido om dos alelos Sox1 endógenos), cultivadas em GMEM com 10% de soro e LIF. Para melhores resultados, é importante que as células são dissociadas e replated na mídia N2B27; simplesmente mudando de mídia a partir de GMEM / soro / LIF para N2B27 sempre resulta em uma redução da eficiência de diferenciação em relação ao repique das células. <ol><li> Cresça as células em GMEM com 10% de soro, 1 mM de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais 1x, 0,1 M de 2-mercaptoetanol, e 100 unidades / ml de LIF 13. Para obter uma cultura subconfluentes de rato ESC, placa 1 x 10 6 células em uma cultura frasco T25, que terá 2-3 dias. </li><li> Observar células sob microscópio de campo brilhante. Quando as células são subconfluentes e pronto para passagem, lave-os duas vezes em PBS. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células e retornar para o incubador durante 2-5 min. Embora tripsina e outras enzimas podem também ser usados ​​para dissociação de células, podem ter um impacto negativo sobre a ligação de células de modo que as densidades de plaqueamento terá de ser ajustÃsted. </li><li> Uma vez que as células começam a levantar a partir da placa, toque no vaso para desalojar-los em uma suspensão de células individuais. Recolher as células para um total de 10 ml de meio de dissociação de células e reagente e pipeta para um tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Rodar as células a 300 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de N2B27 pré-aquecido por pipetagem para cima e para baixo 3-5 vezes. Quando pipetando a suspensão para baixo, da pipeta contra o lado do tubo para evitar a criação de bolhas. Contar as células com um contador de células automatizado ou um hemocitómetro e registar a concentração. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células contendo o número desejado de células por unidade de volume a ser plaqueadas por cavidade em N2B27 pré-aquecido. Uma densidade de 10.500 células por cm 2 de um prato de 6 poços (isto é, 1 x 10 5 células por poço de um prato de 6 poços) é o ideal. Ver Tabela 1 para o número de células sugerido por cm 2 e PLAting volumes de suporte para uma variedade de recipientes de cultura de célula. </li><li> Aspirar a gelatina a partir do vaso de cultura e placa a suspensão de células de acordo com a densidade e volume de sugerido na Tabela 1. Não rodar as placas de que este vai concentrar-se as células para o centro. Coloque as culturas numa incubadora húmida a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Mudança de mídia a cada 1-2 dias, a substituição de todos os meios de comunicação com N2B27 fresco. Pipeta suavemente como a lavagem das células pode afetar a densidade e diminuir a eficiência de diferenciação nos dias seguintes. Onde viabilidade inicial após o plaqueamento é pobre, placa as células em uma 1: 3 mistura dos meios de comunicação N2 e B27-suplementados e mudar isso para N2B27 após os dois primeiros dias. As células começam a diferenciar e deve mostrar expressão Sox1 (visível por fluorescência verde do repórter na linha celular utilizada aqui 46C) dentro de 4-6 dias. </li></ol> 3. Immunofluorescent Coloração NÃOTE: O protocolo pode ser aplicado a qualquer tipo de navio. O volume de cada reagente é descrito por poço da placa de 6 poços e pode ser dimensionada para qualquer área de superfície. Repique não é recomendada devido à viabilidade baixa depois. <ol><li> Remover meio de diferenciação e fixar as células por adição de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldeído, deixar durante 15 min. </li><li> Lavar e permeabilizar as células com 2 ml de PBS-T (solução salina tamponada com fosfato com 0,5% (v / v) de Tween-20) por duas vezes. As células podem ser mantidas em PBS-T, durante até 2 meses a 4 ° C. </li><li> Substituir PBS-T com 1 ml de PBS-T com 10% (v / v) de soro (a partir da mesma espécie que o anticorpo secundário). Incubar 1 hora sobre o roqueiro placa à temperatura ambiente para bloquear qualquer ligação não específica. </li><li> Após 1 h, lavar as células duas vezes com 2 ml de PBS-T, e incuba-se 500 ul de IgG de ratinho contra βIII-tubulina (diluída 1: 1000 em PBS-T, com 10% de soro). Colocar no prato oscilante, e deixar O / N a 4 ° C. </li><li> A partir deste passo, sempre proteger o vasoda luz. Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 ul de anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com fluorescência (diluída a 2 ug / ml em PBS-T, com 10% de soro). Colocá-lo sobre a placa oscilante durante 1 h à TA. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS-T, em seguida, adicionar 500 mL de DAPI (diluído para 0,5 ug / ml em PBS-T) e deixar durante 5 min. </li><li> Lavam-se as células novamente e mantê-las em PBS-T. As células estão prontas para ser fotografado e pode ser mantido por até 2 semanas a 4 ° C. Note que o sinal GFP desaparece ao longo do tempo, por isso é inadequado para comparar a intensidade GFP de células fixas e ao vivo ou de células fixadas em momentos diferentes. </li></ol>

<ol><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li>
<li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li>
<li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li>
<li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells%3A+a+new+ES+cell+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li>
<li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li>
<li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo de diferenciação neural monocamada tem sido usado por mais de uma década 6. O protocolo é altamente eficiente, composto de meio definido, e feito de um sistema de monocamada que torna o sistema mais aplicável para pré-clínica (por exemplo, o rastreio de fármacos) usa. No entanto, existem alguns factores críticos que determinam a eficiência de diferenciação. Este artigo aponta esses fatores ea solução para cada obstáculo. Densidade das células após o plaqueamen...

As células estaminais embrionárias são células pluripotentes derivadas do embrião com a capacidade de proliferar indefinidamente in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células dos adultos após reintrodução num embrião fase adequada (através da formação de uma quimera), injecção em hospedeiros singénicos ou imunocomprometidos (através da formação de um teratoma) ou in vitro sujeitos a estímulos apropriados 1. A diferenciação in vitro de células estaminais embrionárias de ratinho em linhagens neurais foi descrita pela primeira vez em 1995 e envolveu a formação de agregados multicelulares suspensão (corpos embrióides, EBS) em meio contendo soro suplementado com o ácido retinóico morfogénio 2-4. Uma vez que, em seguida, uma variedade de protocolos têm sido desenvolvidos para permitir a diferenciação neuronal 5. Muitos ainda utilizar agregação, os outros co-cultura com indução de tipos de células e vários envolvem a utilização de meios isentos de soro. Todos os protocolos tem vantagens umand desvantagens e a natureza precisa da neural ou células neuronais produzida também varia de acordo com o protocolo utilizado. O protocolo ideal seria robusta, escalável e fazer uso de meios totalmente definidos e substratos, ser passíveis de monitorização não invasiva do processo de diferenciação e resultar na geração de populações puras de células progenitoras neurais capazes de ser modelado por sinais externos e para diferenciar em todos os subtipos neuronais e gliais com elevada eficiência e rendimento em relativamente pouco tempo. Nos últimos doze anos, temos vindo a utilizar um método para gerar progenitores neurais e neurônios de rato ESC em uma baixa densidade, cultura monocamada aderente sem soro 6-10. Este protocolo cumpre muitos dos critérios enunciados anteriormente: em nossas mãos a eficiência de diferenciação tem sido bastante consistente ao longo de muitos anos e uma variedade de linhas de células, ele pode ser escalado para cima ou para baixo (que usamos com sucesso navios de placas de 96 poços para 15 cm de diâmetro diela é) e os meios usados ​​são bem definidos. O processo é passível de microscopia Timelapse para o controlo da diferenciação e uma variedade de padrões de sinais pode ser adicionado para induzir a geração de tipos distintos de subtipos neuronais (por exemplo, a Shh e Fgf8 para neurónios dopaminérgicos 6). No entanto, existem alguns desafios para o sucesso da aplicação deste protocolo. Um dos aspectos fundamentais é uma preparação cuidadosa da mídia. Nós sempre preparar a mídia in-house, apesar da disponibilidade de alternativas comerciais. Um dos suplementos usados ​​(N2; ver Protocol) tem modificações sobre o padrão versões disponíveis no mercado. Finalmente, uma das etapas mais importantes para a aplicação bem sucedida deste método é a densidade celular óptima para o chapeamento. Isto é principalmente devido ao passo que a natureza autócrina de um dos sinais indutores (FGF4 11) requer que as células estão presentes suficientes para permitir viabil óptimadade e diferenciação, em muito altas densidades diferenciação é prejudicada (possivelmente em parte devido à produção autócrina de LIF 12). Portanto, é importante que a preparação ambos os meios e revestimento celular são realizadas com cuidado e de forma consistente para assegurar os melhores resultados.

<table><tbody><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação celular StemPro Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento, sem soro</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstituir com HCl estéril 0,01 M</td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstituir com água estéril</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstituir com etanol</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstituir com água estéril</td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstituir com água estéril</td></tr><tr><td>Fração de albumina bovina V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Certifique-se de que está completamente dissolvido antes de usar, pois a glutamina é geralmente sedimentada</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Thermo Prato</td> de cultura de tecidos de 96 poços <td>da Scientific 142475</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de aminoácidos não essenciais</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Fator inibidor da leucemia</td><td>preparado internamente como em Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Proteger da luz</td></tr><tr><td>Mouse anti &beta; Anticorpo IgG de tubulina III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-rato marcado com fluorescência</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Proteger da luz</td></tr><tr><td>25 cm2 frasco de cultura de tecidos</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação neural of mouse células-tronco embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

A capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho (ESC) para progenitores neurais permite o estudo dos mecanismos que controlam especificação neural, bem como a geração de tipos de células neuronais maduros para estudo posterior. Neste protocolo, descrevem um método para a diferenciação de ESC para progenitores neurais utilizando, cultura em monocamada sem soro. O método é escalável, eficiente e resulta num rendimento de ~ 70% de células progenitoras neurais dentro de 4-6 dias. Ele pode ser aplicado a partir de várias estirpes CES cultivadas sob uma variedade de condições. Progenitores neurais podem ser autorizados a diferenciar ainda mais em neurônios funcionais e glia ou analisados ​​por microscopia, técnicas de citometria de fluxo ou moleculares. O processo de diferenciação é passível de microscopia de lapso de tempo e pode ser combinada com o uso de linhas de repórter para monitorizar o processo de especificação neural. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre a preparação de meios e optimização densidade celular para permitir que o processo abe aplicado a maioria das linhas de ESC e uma variedade de recipientes de cultura de célula.

Nesta experiência, utilizou-se a linha de células de 14 46C, células estaminais embrionárias de ratinho com um endógeno Sox1-repórter GFP, para controlar a diferenciação neuronal. Utilizando esta linha celular, expressão de Sox1, um marcador para células progenitoras neurais, pode ser detectado por fluorescência verde. Chapeamento de densidade é um fator crítico para alcançar a diferenciação neuronal. Células estaminais embrionárias de ratinho foram plaqueadas em placas de 6 poços em diferentes densidades var...

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo para uma linhagem neural em um cultivo celular monocamada livre de soro. Isso é realizado primeiramente revestindo o recipiente de cultivo com gelatina. Na segunda etapa, as células-tronco embrionárias são dissociadas em uma suspensão de células únicas em meio de diferenciação e diluídas até as densidades de semeadura apropriadas.No passo final, as células são semeadas na placa revestida com gel ENC. Por fim, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para confirmar o sucesso da diferenciação mediante a visualização dos marcadores neurais de interesse. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois o plaqueamento na densidade apropriada é essencial para obter uma boa diferenciação.E existem vários fatores que afetam a densidade de semeadura direta e indiretamente. Antes de semear as células, aqueça uma alíquota de gelatina a 1% em banho-maria a 37 graus Celsius até dissolver. Em seguida, misture a gelatina com 500 mililitros de PBS morno e cubra o fundo do recipiente de cultura celular com quantidade suficiente da solução para revestir a superfície enquanto a gelatin

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Desenvolvemos um novo protocolo para melhorar a eficiência de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em neurônios motores. As células-tronco diferenciadas adquirido neurônios motores apresenta como evidenciado pela expressão de marcadores neuronais e neurônio motor utilizando técnicas de imuno-histoquímica.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

O vídeo demonstra um protocolo que usa mídia sem soro para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. A concentração desejada de células-tronco embrionárias, suspensas em meio sem soro, é revestida em lamínulas revestidas de gelatina. Em uma densidade celular ideal, as células produzem fatores de sinalização autócrinos, que, juntamente com os fatores indutores de diferenciação neural no meio livre de soro, desencadeiam a diferenciação de células-tronco...

Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias em culturas monocamada sem soro

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

O vídeo mostrou um método de cultura de células para diferenciar células progenitoras neurais em neurônios. Ao incubar células em um meio rico em nutrientes suplementado com fatores de crescimento, as células progenitoras amadureceram em neurônios com axônios e dendritos desenvolvidos. Um agente estabilizador garantiu a viabilidade celular e protegeu contra danos oxidativos durante todo o processo de diferenciação.

Diferenciação de células progenitoras neurais em neurônios

Este vídeo demonstra uma técnica para diferenciação de células-tronco embrionárias em uma população em rede de neurônios com sinapses funcionais. Ele descreve as etapas envolvidas na diferenciação de células-tronco embrionárias em neurônios, indução da formação de redes neuronais e enriquecimento da cultura com neurônios em rede.

Diferenciando células-tronco embrionárias de camundongos em uma população de neurônios em rede

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Aprenda a diferenciação neural de células-tronco embrionárias de camundongo em cultura monocamada sem soro. Este método permite gerar progenitores neurais para estudos de desenvolvimento cerebral e triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

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