Name: Disparo Reactive Gliose In Vivo Por um Stab Lesão Encéfalo anterior (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a induzir gliose reativa no cérebro anterior de camundongos adultos por lesão mecânica. Este método simples permite estudar processos celulares e moleculares sem equipamentos adicionais.

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Agradecemos a Katherine Clark pela assistência técnica. A.D.R.G. é financiado em parte por 5K01MH097957-03

Adulto (3-4 meses de idade) ratos machos em um C57BL / 6 fundo misto foram utilizados neste protocolo. Os animais foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz, e permitiu o livre acesso a comida e água. Todos os procedimentos realizados neste protocolo foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão de Drexel University Institutional Animal Care e Use. 1. Preparar Área Cirúrgica <ol><li> Desinfetar mesa cirúrgica com etanol 70%, em seguida, cobrir toda a bancada cirúrgica com absorventes higiênicos e providenciar instrumentos cirúrgicos adjacente ao estereotáxica. </li><li> Configurar equipamento estereotáxico sem braço manipulador. Organizar a almofada de aquecimento na estereotáxico e ajustado para 37 ° C. Evitar o sobreaquecimento do animal, colocando um pequeno pedaço de papel toalha ou almofada cirúrgica entre o animal ea almofada de aquecimento. </li><li> Com uma tesoura autoclavados, cortar pequenos pedaços de gelfoam autoclavado em uma placa de Petri estéril contendo solução salina 0,9% estéril até ready para uso. Nota: Manter ambiente de trabalho estéril, utilizando instrumentos esterilizados e suprimentos cirúrgicos estéreis. Re-esterilizar instrumentos cirúrgicos durante o procedimento ou entre animais por meio de imersão em um esterilizador talão de 10-15 segundos, conforme necessário. Manter luvas limpas durante todo o procedimento, esfregando as mãos com álcool a 70%, conforme necessário, de desinfectar. </li></ol> 2. Prepping mouse para Cirurgia <ol><li> Remover rato de gaiola e pesar (g). </li><li> Colocar o mouse na câmara de indução isoflurano e definir oxigênio a 2 L / min e vaporizador isoflurano a 5 para induzir um plano cirúrgico de anestesia, cerca de 3-5 min. Monitore a respiração desacelerou e imobilização. Verifique se o mouse está totalmente sedado utilizando o reflexo toe pitada. </li><li> Quando o mouse está totalmente sedado, coloque no quadro estereotáxico, prenda o nariz no cone do nariz, que está ligado com a tubulação para o isoflurano. Insira barras de ouvido no canal do ouvido e aperte, garantindo a cabeça é estável. </li><li> Raspar a cabeça de orelha a orelha, e de entre os olhos para atrás das orelhas. </li><li> Esterilizar a pele com toalhetes alternados de álcool isopropílico e uma solução de betadine iodo, 3 vezes cada um. </li><li> Aplicar lágrimas artificiais para ambos os olhos para evitar que sequem durante o procedimento cirúrgico. </li></ol> 3. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Monitore a profundidade da anestesia por beliscar a ponta ou cauda. O rato está localizado no plano cirúrgico apropriado quando não houver nenhuma resposta, e a respiração é lenta e uniforme. </li><li> Faça uma incisão na pele parasagittal de apenas atrás dos olhos para quase entre as orelhas em um único movimento, firme, usando uma lâmina de bisturi n ° 11. Mova pele de lado e clip lado direito com pinça hemostática. </li><li> Limpar crânio de membrana sobreposta usando o lado maçante do No. 11 bisturi e algodão derrubou aplicadores. Opcionalmente, limpe o crânio com algodão aplicador derrubado mergulhados em solução salina a 0,9%. Deixar secar completamente. </li><li> Nósção uma pequena régua, marcar a borda anterior da craniotomia a 1 mm caudal para a sutura coronária, e a borda esquerda da craniotomia em 1 mm lateral à sutura sagital (Figura 1), com um marcador permanente. Em seguida, marque a direita e fronteiras caudal da craniotomia a 4 mm das suturas sagital e coronal, respectivamente (Figura 1). </li><li> Usando uma broca de 0,5 mm, começar a fazer a craniotomia por perfuração lentamente seguindo o contorno marcador permanente. Tenha cuidado para não romper o crânio completamente. Pressione suavemente a parte isolada de osso parietal com No. 5 fórceps, áreas de fraqueza dará lugar à pressão. Quando o osso diluído é suficientemente fraca ao longo do perímetro, a peça óssea está pronta para remoção. NOTA: Se a dificuldade experiências investigador remoção do osso em uma única peça, isso sugere que o osso não estava suficientemente diluído durante a perfuração. Considere a perfuração do crânio ainda mais em animais subsequentes para Facilitate fácil remoção da peça óssea. </li><li> Usando uma seringa de 10 ml, equipado com uma agulha G 23, aplicam-se uma pequena quantidade de 0,9% de solução salina para absorver o osso isolado e área perfurada. </li><li> Prenda o braço manipulador ao equipamento estereotáxico. Anexar uma nova lâmina de bisturi n ° 11 para o titular da sonda com o lado afiado da lâmina virada para rostralmente. Nota: Embora os tecidos rostral e caudal experimentar as arestas vivas e sem corte da lâmina, respectivamente, a danos mecânicos induzida pela lesão penetrante é comparável em toda a extensão da lesão. Observamos há diferenças consideráveis ​​das principais características da gliose reativa incluindo upregulation de expressão ou a proliferação GFAP, entre as seções rostral e caudal. </li><li> Mantendo o braço manipulador fora do caminho, levante cuidadosamente o osso isolado usando 5/45 fórceps anguladas. Insira a ponta da pinça para o lado do osso isolada e elevador, usando alavanca para retirar o pedaço de osso deixado para trás em um full movimento. NOTA: Tenha cuidado para não apunhalar o cérebro ou perturbar a dura por baixo do crânio. </li><li> Pegue um pequeno pedaço da espuma gel absorvível embebida e coloque sobre o cérebro descoberto para evitar que ela seque e absorva todo o sangue que possa estar presente. </li><li> Uma vez que a espuma de gel está no lugar, balançar o braço manipulador no lugar e ajustar lâmina para o centro da craniotomia sobre a espuma gel. Remover a espuma de gel e reduzir a lâmina até que a ponta toca a dura-máter sem a perfuração da dura-máter. Mark dorsal / ventral coordenadas utilizando a escala vernier no braço vertical da estereotáxico. </li><li> Usando o braço manipulador, abaixe lentamente a lâmina precisamente três milímetros no cérebro. Isto é conseguido usando as marcas de escala vernier do braço manipulador. Permitir lâmina para ficar no lugar de 5-10 seg. Mova o braço estereotáxico com acessório lâmina rostral para caudal três vezes, permitindo que a lâmina para alcançar os limites rostral e caudal da craniotomia antes de passar para o opposite fim. NOTA: A dura-máter não é removido antes de inserir a lâmina. Em contraste com a dura-máter de rato, que é ~ 80 um de espessura 7, a dura-máter do rato é consideravelmente mais finas (apenas algumas camadas celulares de espessura) e não produz uma resistência apreciável para a lâmina de bisturi durante a inserção. Usar uma nova lâmina de bisturi para cada rato para assegurar que cada animal recebe uma lesão consistente. </li><li> Lentamente levantar o braço estereotáxico, retirando a lâmina do cérebro. Após a remoção da lâmina, coloque imediatamente um outro pedaço de gelfoam na superfície do cérebro para absorver qualquer excesso de sangue ou fluido. </li><li> Enquanto isso, retirar o braço estereotáxico e dispor da lâmina de bisturi n ° 11. Uma vez que o sangramento parou, remova o gelfoam. </li><li> Fechar a ferida por sutura da pele com sutura não absorvível, tal como ethilon ou prolene. As suturas devem ser removidos 9-10 dias após a cirurgia. </li><li> Devolver o mouse para sua gaiola, e permitir que o mouse para se recuperar lentamente em um heating pad eo monitor para detectar quaisquer sinais de angústia. A recuperação da anestesia induzida por isoflurano tipicamente ocorre dentro de 2-5 minutos após a remoção do isofluorano. Não deixe o animal sem supervisão até que ele recuperou recumbancy esternal. </li><li> Administrar 0,5-1 ml de solução de Ringer lactato subcutaneamente para garantir a hidratação. </li></ol> 4. Cuidados pós-cirúrgica <ol><li> Acompanhar de perto os animais no pós-operatório até a recuperação da anestesia, antes de voltar para a colônia. <ol><li> Para reduzir a dor e desconforto pós-operatório, administrar 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por injecção ip imediatamente após o procedimento. </li><li> Observe os animais por 2-3 dias após a cirurgia para sinais severos de angústia, como movimentos restritos, a falta de preparação, ou perda de peso. Euthanize animais que demonstram algum destes sinais de sofrimento e retire do estudo. </li></ol></li><li> Para examinar histopatológico de tecidos lesados, eutanásia animais por stanperfusão intracardíaca dard. <ol><li> Resumidamente, anestesiar os animais com uma overdose de cetamina / xilazina e, em seguida perfundidos intracardial com 15-20 mL de NaCl a 0,9%, ou até que o fígado é limpa de sangue, seguido por 60 ml de paraformaldeído a 4% no final da experiência. </li></ol></li><li> Dissecar cérebros e pós-correção para 2-4 h em paraformaldeído a 4% antes da transferência para solução de sacarose 30%. Secção cérebros num crióstato a 40-60 uM, e processo por procedimentos histológicos ou imuno-histoquímicos convencionais, ou como descritos em Garcia 8,9. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

É fundamental que o crânio ou dura subjacente não sejam danificados durante a perfuração. Use uma leve pressão durante a perfuração para garantir o crânio não é perfurada. Além disso, deve ser tomado cuidado ao levantar o pedaço do crânio para garantir a dura não é levantado com o osso. A lesão forebrain facada descrito aqui modelos de uma lesão penetrante no SNC. Embora menos clinicamente traduzível do que os modelos de TBI como FPI ou ICC, o modelo de lesão forebrain facada serve como uma ...

Um grande desafio para o desenvolvimento de terapias bem-sucedidas para tratar o SNC lesionado é uma compreensão incompleta dos complexos eventos multicelulares desencadeados pelo trauma. Os astrócitos reativos estão ganhando cada vez mais reconhecimento como um alvo promissor para novas terapias1. Embora historicamente considerados hostis ao reparo neural, os astrócitos reativos são agora reconhecidos como componentes críticos de uma resposta neuroprotetora multicelular complexa que inclui atenuação de processos inflamatórios e limitação de danos secundários e neurodegeneração2-6. Embora as características neuropatológicas da gliose reativa tenham sido bem definidas há muito tempo, os mecanismos celulares e moleculares que regulam a gliose reativa e a diversidade de consequências a jusante permanecem pouco compreendidos. Compreender os mecanismos que impulsionam a gliose reativa, bem como os eventos celulares e moleculares subsequentes, é um passo importante para o desenvolvimento de estratégias destinadas a promover as propriedades neuroprotetoras da gliose reativa, atenuando os efeitos prejudiciais. 
Aqui demonstramos um método para induzir astrogliose reativa grave no prosencéfalo de camundongos adultos usando uma facada. Em contraste com outros modelos de lesão cerebral traumática (TCE), como impacto cortical controlado (CCI) ou lesão por percussão fluida (FPI), que requerem equipamento especializado para produzir uma lesão, a facada do prosencéfalo requer apenas um dispositivo estereotáxico para estabilizar a cabeça e uma lâmina de bisturi nº 11. Assim, o modelo de lesão por facada do prosencéfalo é mais amplamente acessível a uma ampla gama de laboratórios que não têm acesso aos dispositivos especializados necessários para criar uma lesão FPI ou CCI. O método descrito aqui permite que os investigadores desencadeiem de forma confiável e reprodutível uma resposta robusta à gliose para investigar eventos celulares e moleculares subsequentes. Uma vez recuperados da cirurgia, os animais que receberam uma facada no prosencéfalo podem sobreviver por períodos prolongados sem a necessidade de cuidados especializados e podem ser devolvidos à colônia para estudos agudos, intermediários ou crônicos. Embora menos clinicamente traduzível do que os modelos FPI ou CCI de TCE, uma lesão no prosencéfalo produzida por uma lesão por arma branca serve como um modelo experimental simples, mas útil, para investigar os mecanismos biológicos básicos subjacentes à gliose reativa e outros eventos neuropatológicos após trauma no SNC.

<table><tbody><tr><td>Stereotax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726049</td><td></td></tr><tr><td>Micro broca de alta velocidade</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724950</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de bisturi de aço inoxidável, #11</td><td>MedVet</td><td>JOR581S</td><td></td></tr><tr><td>5/45 fórceps angular</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Esponja Gelfoam 12 cm x 7 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9841478</td><td></td></tr><tr><td>Rb anti-GFAP</td><td>DAKO&</td><td>nbsp; Diluição Z033429-2</td><td>- 1:20.000 (campo claro); 1:1.000 (fluorescência)</td></tr> <tr><td>Shp anti-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>Diluição - 1: 20.000 (campo claro); 1:500 (fluorescência)</td></tr> <tr><td>Cabra biotinilada anti-coelho</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&nbsp;</td><td>Diluição - 1:400 (campo claro)</td></tr><tr><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>BA-6000</td><td>Diluição - 1:400 (campo claro)</td></tr><tr><td>Alexafluor 488 anti-coelho de cabra</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>Diluição - 1:400 (campo claro)</td></tr><tr><td>Alexafluor 568 anti-ovelha de burro</td><td>Life Technologies</td><td>A-21099</td><td>Diluição - 1:1.000 (fluorescência)</td></tr><tr><td>DAPI Nucleic Acid Stain</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>Diluição - 1:1.000 (fluorescência)</td></tr><tr><td>Acetato de violeta cresil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td>Diluição - 1% (campo claro)</td></tr></tbody></table>

disparo reactive gliose<em&gt; in vivo</em&gt; por um stab lesão encéfalo anterior

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Após a lesão do SNC, os astrócitos passam por uma ampla gama de alterações bioquímicas, morfológicas e moleculares coletivamente chamadas de astrogliose reativa. Os astrócitos reativos exercem efeitos inflamatórios e protetores que inibem e promovem, respectivamente, o reparo neural. Os mecanismos subjacentes às diversas propriedades funcionais da astrogliose reativa não são bem compreendidos. Alcançar uma maior compreensão desses mecanismos é fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para tratar o SNC lesado. Aqui, demonstramos um método para desencadear astrogliose reativa no prosencéfalo de camundongos adultos usando uma lesão de facada no prosencéfalo. Este modelo de lesão é simples, confiável e requer apenas um dispositivo estereotáxico e uma lâmina de bisturi para produzir a lesão. O uso de lesões por arma branca como modelo de lesão no prosencéfalo está bem estabelecido e passível de estudos que abordem uma ampla gama de resultados neuropatológicos, como degeneração neuronal, neuroinflamação e interrupções na barreira hematoencefálica (BHE). Assim, o modelo de lesão por facada no prosencéfalo serve como uma ferramenta poderosa que pode ser aplicada a uma ampla gama de estudos sobre a resposta do SNC ao trauma.

Porque os animais submetidos a esse procedimento não requerem períodos de sobrevivência especializados cuidados pós-operatórios, curtos ou de tempo de longo prazo são facilmente incorporados no estudo, dependendo da necessidade de investigar patologia aguda ou crônica após a lesão. Principais recursos de gliose reativa, como regulação alta de GFAP e hipertrofia de soma, pode ser observado logo em 2-3 dias após a lesão. A fase de pico da proliferação de astrócitos reativos é durante os dias 3-5 após lesão 10. ...

Este artigo descreve um protocolo detalhado para produzir uma lesão por facada no prosencéfalo em camundongos adultos. A lesão por arma branca induz gliose reativa grave e formação de cicatriz glial que pode ser posteriormente examinada por métodos imuno-histoquímicos padrão.

Disparo Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Por um Stab Lesão Encéfalo anterior

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

O objetivo geral do experimento a seguir é induzir gliose reativa em astrócitos no cérebro anterior de camundongos adultos, criando uma lesão mecânica para investigar os processos celulares e moleculares subjacentes à gliose reativa. Isso é realizado mediante a realização de uma craniotomia e, posteriormente, a inserção de uma lâmina de bisturi estéril, com profundidade e comprimento de três a quatro milímetros, no cérebro anterior para criar a lesão. Os animais podem sobreviver por períodos agudos ou crônicos, e seus tecidos são coletados ao final do experimento.O próximo tecido pode ser processado para ensaios histológicos, bioquímicos ou biológico-moleculares a fim de investigar os processos moleculares e celulares responsáveis pela astrogliose reativa. Os resultados mostram que este procedimento induz uma forte gliose reativa, com base na expressão acentuadamente aumentada de GFAP e na proliferação de astrócitos reativos. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos, como lesão por percussão com fluido ou impacto cortical controlado, é que a gliose reativa pode ser facilmente induzida e estudada sem a necessidade de equipamentos adicionais.Para iniciar este pr

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Medicine

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Este vídeo demonstra o procedimento de lesão por facada cortical em camundongos, envolvendo exposição do crânio e criação de lesões cerebrais. Induz a astrogliose reativa, uma resposta neuroprotetora dos astrócitos, para estudar o trauma, a inflamação e os mecanismos de reparo do SNC.

Gerando uma lesão por facada cortical em um modelo de camundongo para induzir astrogliose reativa

Um paradigma lesão utilizando a Drosophila larval cordão nervoso ventral para investigar a regeneração do sistema nervoso central e de reparação é descrito. Stabbing seguido por varredura a laser microscopia confocal em amostras de lapso de tempo e fixa, combinada com a análise quantitativa, com software desenvolvido propositadamente e genética, são utilizados para investigar os mecanismos moleculares do CNS regeneração e reparo.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

A imagem intravital de dois fótons pode ser usada para investigar interações entre diferentes tipos de células na medula espinhal em seu ambiente de tecido nativo em um animal quimérico da medula óssea com uma lesão traumática por esmagamento da medula espinhal da coluna dorsal.

Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento

Este protocolo sistemático descreve um novo modelo animal de epilepsia pós-traumática após lesão cerebral traumática repetitiva. A primeira parte detalha etapas para indução traumática de lesão cerebral usando um modelo modificado de queda de peso. A segunda parte fornece instruções sobre a abordagem cirúrgica para sistemas de aquisição de dados eletroencefalográficos de um único e multicanal.

Induzir epilepsia pós-traumática em um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática difusa repetitiva

Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

O protocolo descreve traumatismo cranioencefálico leve em modelo de camundongo. Em particular, um protocolo passo-a-passo para induzir um traumatismo cranioencefálico fechado na linha média leve e a caracterização do modelo animal são totalmente explicados.

Modelo de Lesão Cerebral Traumática Leve em Camundongos com Controle Eletromagnético

Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.

Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons

Modelos simplificados de traumatismo cranioencefálico (TCE) facilitaram o desenvolvimento de abordagens terapêuticas. Este protocolo descreve a criação de um córtex de camundongo ferido por facada usando agulhas, permitindo a análise de hemorragia e inflamação. O modelo de camundongo TBI com ferida por faca oferece a vantagem de ser realizado sem a necessidade de equipamento especializado.

Modelo de camundongo com ferida por faca para estudar hemorragia e inflamação em lesão cerebral traumática

Aqui, fornecemos uma metodologia detalhada para isolar a retina do olho do camundongo para experimentação ex vivo estendida. Este protocolo enfatiza tornar essa abordagem tecnicamente exigente acessível para pesquisadores que gostariam de aproveitar os caminhos de pesquisa oferecidos pela manutenção da glia retiniana in situ em tecido vivo.

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

Aprenda a induzir gliose reativa no cérebro anterior de camundongos adultos por lesão mecânica. Este método simples permite estudar processos celulares e moleculares sem equipamentos adicionais.

Disparo Reactive Gliose

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