Name: Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a extrair proteínas e DNA de biomassa microbiana marinha e preparar peptídeos tripticos para análise por espectrometria de massa em tandem. Este protocolo integra proteômica e metagenômica.

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Os autores gostariam de agradecer a Marcos Di Falco por sua experiência e conselhos com a preparação das amostras para nano-LC MS/MS, bem como ao Dr. Zoran Minic, da Universidade de Regina, pela análise de LC MS/MS. Este trabalho foi apoiado por financiamento NSERC (DG402214-2011) e CRC (950-221184). DC foi apoiado pelo Concordia Institute for Water, Energy e Sustainable Systems e FQRNT.

1. Prepare Reagentes <ol><li> Preparar a solução de extracção SDS-: M de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, glicerol a 5%, EDTA 10 mM e SDS a 1%. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C. </li><li> Prepare os reagentes necessários para o banco de gel de poliacrilamida. <ol><li> Prepare a 1,5 M de Tris-HCl pH 8,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> Prepare 10% SDS. Filtrar esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Prepare soluções necessárias para em gel e extracção de tripsina digerir péptido. <ol><li> Preparação de 100 mM de bicarbonato de amónio. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C. </li><li> Prepare 1 stocks M TDT. Suspenso em 100 mM de bicarbonato de amónio e armazenar a -80 ° C. </li><li> Prepare 550 mM stocks iodoacetamida. Suspenso em100 mM de bicarbonato de amónio e armazenar a -80 ° C. </li><li> Prepare 100 ng / mL de tripsina stocks. Alíquota de 60 mL em 1,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. </li><li> Preparar a solução de extracção: ácido fórmico a 1%, 2% de acetonitrilo. </li><li> Preparar a solução de re-suspensão: 5% de acetonitrilo e ácido fórmico a 0,1%. </li></ol></li></ol> 2. Execute Lise Celular na Unidade de Filtro Cartucho com células preservadas em RNA Solução de Estabilização <ol><li> Expelir a solução de estabilização de ARN a partir da unidade de filtro de cartucho (1,5 ml) e num tubo de microcentrifugação de 2 ml usando uma seringa de 60 ml ligado na extremidade luer-lock do filtro. </li><li> Centrifuga-se o tubo de microcentrifugação de 2 ml durante 10 minutos a 17,000 xg para sedimentar quaisquer restos celulares. Isto é feito de modo a que o filtro no passo 2.3 não entupir. </li><li> Transferir o sobrenadante para uma unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o 10 K para capturar quaisquer proteínas provenientes de células que foram lisadas do congelamento / thaW da amostra. Não jogue fora o sedimento. Será utilizado no passo 2.5. Realizar centrifugação da unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o a 3.270 xg durante 30 minutos ou até que o volume foi reduzido para cerca de 600 ul. </li><li> Derreter a ponta de uma ponta de p10 e bloquear o lado não luer-lock da unidade de filtro de cartucho, com a extremidade aberta da ponta. Isto irá assegurar que nenhum tampão de extracção e biomassa escapa durante os passos de 2,5-2,7. </li><li> Suspende-se o sedimento em 1 ml de solução de extracção SDS e pipeta-la para a unidade de filtro de cartucho original. A maneira mais fácil de pipeta na unidade de filtro de cartucho é empilhar uma dica p200 em uma ponta P1000 e usar essa dupla ponta de pipetagem. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de extracção SDS para a unidade de filtro de cartucho, de modo que o volume total é de cerca de 2 ml e incubar durante 10 min à temperatura ambiente, durante a rotação num forno de hibridação. Coloque toalhetes 3 laboratório amassado na parte inferior de um tubo de 50 ml. Parafilme ambas as extremidades da unidade de filtro de cartuchoe colocar a unidade do filtro cartucho para dentro do tubo de 50 ml. Fechar a tampa e colocar o tubo num forno de hibridação. </li><li> Após 10 min lugar a Sterivex filtrar em um floater espuma e prenda-o no lugar com uma seringa de 5 ml na extremidade luer-lock. Flutuar e incubar em um 95 ° C em banho-maria por 15 min. </li><li> Deixe que a unidade de filtro de cartucho fresco e girar à temperatura ambiente durante 1 hora (tal como no passo 2.6). </li><li> Expelir o lisado solução de extracção / SDS de células fora do filtro com uma seringa de 60 mL para a mesma unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o como anteriormente (passo 2.3). Adicionar 1 ml de solução de extracção SDS fresco para a unidade de filtro de cartucho e mistura-se durante 30 segundos com a mão, em seguida, para expulsar a unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o usando a seringa de 60 ml. Isto é para enxaguar a unidade de filtro de cartucho, para garantir que todas as proteínas foram removidas. </li><li> Realizar centrifugação na unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o durante 45 min a 3270 xg ou até que o volume da unidade de filtro é menor do que 600 ul. </li><li> Rejeitar flow-through eo topo até a unidade de filtro ultra-centrifugaï¿½o com solução de SDS-extração fresco. </li><li> Centrifugar a unidade de filtro para a outra 45 min a 3.270 x g. </li><li> Repita os passos 2.11 e 2.12 duas vezes mais. Assegurar o volume final na unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o é no máximo 600 jil no final da centrifugação final. </li><li> Neste ponto, o concentrado dividido em dois. Uma fracção será usado para a precipitação de ADN e o outro para precipitação da proteína. Nota: A quantidade de fraccionamento depende da quantidade de biomassa que foi filtrado e as utilizações pretendidas dos produtos. No nosso caso, nós dividir o concentrado com 10% em relação a precipitação do DNA e de 90% em relação a precipitação da proteína. </li></ol> 3. Protein Precipitation <ol><li> Adicionar 4 volumes de metanol: acetona (50:50) a um volume de concentrado e de vórtice durante 10 seg. Incubar durante a noite a -20 ° C. </li><li> Girar a 17.000 xg durante 30 min. Decantar o sobrenadantee deixar o sedimento (pode ser invisível) seco num Speedvac durante 1 h (ou até secar). Nota: Não mais de secar o sedimento, pois isso pode tornar difícil para voltar a suspender. </li><li> Suspende-se o sedimento em 25 ml de solução de SDS-extracção. Deixe descansar por uma hora, em seguida ressuspender pipetando cima e para baixo. </li><li> Quantificar proteína usando um kit de ensaio de proteína e as instruções do fabricante. </li></ol> 4. DNA Precipitation <ol><li> Adicionar a solução de SDS-extracção para a fracção de concentrado a ser usado para a precipitação de ADN até a marca de 500 ul. Este passo é simplesmente a aumentar o volume da solução, tornando-o mais fácil de trabalhar. </li><li> Adicionar 0,583 volumes de um reagente de precipitação de proteína (tal como o reagente de precipitação de proteína MPC) e agitar com vortex durante 10 seg. Você deverá ver uma forma precipitado branco. Nota: Temos também utilizado fenol: métodos de extração de DNA de clorofórmio, mas é mais difícil devido aos baixos volumes. Obtivemos melhores rendimentos de ADN usando oMPC Proteína Reagente de precipitação. </li><li> Centrifugar a 17.000 xg e 4 ° C durante 10 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 0,95 volumes de isopropanol. Inverta 30-40 vezes. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 4 ° C, à velocidade máxima. </li><li> Decantar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar duas vezes com 750 ul de etanol a 70%. </li><li> Remover o máximo possível de etanol por pipetagem, em seguida, deixe secar ao ar. Nota: Não secar sobre o DNA, pois isso pode tornar difícil para voltar a suspender. </li><li> Ressuspender em 25 ul de tampão TE baixo, pH 8 (Tris 10 mM-HCl, EDTA 0,1 mM). </li><li> Quantificar o ADN utilizando um kit de ensaio de ADNcd e as instruções do fabricante. Realizar gel de agarose (1%) eletroforese em 3 ul de DNA para verificar a sua qualidade. </li></ol> 5. Gel de SDS-PAGE de proteínas <ol><li> Preparar tampão de amostra (tampão de amostra Laemmli 950 ul e 50 ul β-mercaptoetanol). &lt;/ li&gt; <li> Adicionar o volume correspondente de 15 ug de proteína, ou um máximo de 20 ul de um volume igual de tampão de amostra e ferver durante 4 minutos. As amostras podem agora ser armazenados a -80 ° C até de SDS-PAGE podem ser executadas. </li><li> Preparar 10% de acrilamida com um gel de resolução de gel de acrilamida a 5% de empilhamento. </li><li> Carregar o gel com amostras e 4 ul de uma escada de proteína. Submeter o gel a constante de 120 V até o marcador de 250 kDa escada acaba de atingir o gel de resolução. </li><li> Corar o gel utilizando uma mancha de Coomassie base de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 6. Em gel de Tripsina-Digest e Peptídeo de Extracção Nota: Todos os passos daqui até 6,10 são realizadas em uma cabine de segurança biológica para minimizar a contaminação. <ol><li> Corte o excesso de gel sob a marca de 10 kDa escada para cada pista. Cada uma das pistas serão analisados ​​em MS / MS separadamente. Corte cada pista em 1 mm x 1 mm quadrados para aumentar a área de superfície e coloque tudo squares de pista para um tubo de ligação a partir de micro-centrífuga. Repita esse procedimento para todas as pistas. (Ácido acético a 1% pode ser usado para impedir o gel de secar e tornando-se difícil de cortar). Nota: minimizar a contaminação é crítica nesta fase, de modo que corta gel é efectuada numa câmara de segurança biológica sobre o molde em gel de SDS-PAGE de vidro utilizado para fazer o gel. </li><li> De-mancha <ol><li> Dispensar 50 ul de 100 mM de bicarbonato de amónio em cada tubo de ligação baixa, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Dispensar 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar e descartar 150 ul. </li><li> Repita os passos 6.2.1 e 6.2.2. </li><li> Aspirar e descartar 95 ul. </li></ol></li><li> Desidratação <ol><li> Dispense 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e esperar 5 min. Aspirar e descartar 45 ul e esperar 10 min. </li></ol></li><li> Redução <ol><li> Dispensar 50 ul de DTT (10 mM, diluída em 100 mM de MVAbicarbonato de ónio), perto tampa e esperar 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Alkylation <ol><li> Dispensar 50 uL de iodoacetamida (55 mM, diluída em bicarbonato de amónio 100 mM), tampão de perto e esperar 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Dispensar 100 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar durante 5 min a 37 ° C. Aspirar e descartar 195 ul. </li></ol></li><li> lavagem <ol><li> Dispensar bicarbonato de amónio 50 ul, perto tampa e incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Dispensar 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 5 min. Aspirar e descartar 120 ul. </li></ol></li><li> Desidratação <ol><li> Dispense 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e esperar 5 min. Aspirar e descartar 45 ul. </li><li> Dispense 50 ul de acetonitrilo, aguarde 5 min. </li><li> Aspirar e descartar 75 ul e esperar 5 min. </li></ol></li><li> Digestão <ol><li> Dispensar 25-30 ul de 6 ng / uL de tripsina (uté todos os fragmentos de gel são cobertos). Fechar a tampa e esperar 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Incubar durante a noite (mínimo de 4,5 horas) a 37 ° C. </li><li> Deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min. </li></ol></li><li> Extracção e Péptido Transferência <ol><li> Dispensar 30 ul de solução de extracção e cobrir com tampa durante 30 min em gelo. </li><li> Aspirar 30 ul de volume aspirado e dispensar em um novo tubo de ligação de baixo marcado. </li><li> Dispensar 12 ul de solução de extracção, e 12 ul de acetonitrilo para dentro do tubo original (com gel). Fechar a tampa e incubar durante 30 min em gelo. </li><li> Aspirar 15 ul e depósito para o novo tubo. </li><li> Repita os passos (6.9.3 e 6.9.4). </li></ol></li><li> Coloque novos tubos em um SpeedVac até secar. </li><li> Ressuspender em 50 ul de solução de ressuspensão. Vortex no médio por 10 minutos para voltar a suspender. </li><li> Pipetar para solução de péptido quer nano LC / frascos ou placas de 96 poços adequados para nano / CLTrabalho MS / MS. </li></ol>

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<li>Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li>
<li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Informatics+and+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3(2012).</li>
<li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGAN+analysis+of+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li>
<li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li>
<li>Ea Ottesen,, Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li>
<li>Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Preservação das amostras é essencial para estudos metaproteomic e trabalho anterior demonstrou que uma solução de estabilização de ARN é um tampão de armazenamento útil para armazenar as células antes da extracção da proteína 28. Idealmente, as amostras iria ser preservado in situ para negar mudanças na expressão de proteínas durante o manuseamento 33,34. Na verdade, in situ têm sido desenvolvidas tecnologias de amostragem e de fixação, que permitem a recolha autónoma e preservaçã...

Os microrganismos são onipresentes e desempenham um papel essencial nos ciclos biogeoquímicos da Terra 1. Atualmente, existem inúmeras abordagens moleculares disponíveis para a caracterização de estrutura da comunidade microbiana e função. O mais comum é a análise do gene 16S rRNA sequï¿½cias amplificado por PCR a partir de ADN ambiental 2 - 4. Uma desvantagem da análise do gene 16S rRNA é que ela só fornece informações sobre a identidade filogenética e estrutura da comunidade, com pouca informação sobre a função metabólica. Em contraste, abordagens como Metagenômica, metatranscriptomics e metaproteômica fornecer informações sobre a estrutura da comunidade e do metabolismo. Metagenomics, ou a análise do teor de gene de um conjunto de organismos, fornece informação sobre a estrutura e o potencial funcional da comunidade 5 - 8. Embora poderoso, este potencial funcional pode não corresponder ao metabólicaactividades dos organismos. Genótipo de um organismo é representado por seus genes, cada um dos quais pode ser transcrito em RNA e ainda traduzido para proteína, resultando num fenótipo. Assim, para auxiliar na compreensão da actividade funcional microbiano num ambiente, a análise pós-genómico deve ser executada 9. Metatranscriptomics, ou a análise de transcritos de ARN é útil porque revela que os genes são transcritos em qualquer dado ambiente. No entanto, os níveis de mRNA nem sempre coincidir com os seus níveis de proteína correspondentes devido à regulação de translação, meia-vida de ARN, e o facto de várias cópias de proteínas pode ser gerado para cada ARNm de 10. Por estas razões metaproteômica é agora reconhecida como uma importante ferramenta para microbiologia ambiental. Metaproteomic comum analisa usar uma abordagem proteômica shotgun onde o complemento total perto de proteínas em uma amostra complexa são purificados e analisados ​​simultaneamente, geralmente através de endigestão zymatic em peptídeos e análise em um espectrômetro de massa. Espectrometria de massa tandem subsequente (MS / MS) &quot;impressão digital peptídica&quot; é utilizado para determinar a sequência do péptido e proteína potencial de origem pelo banco de dados de proteínas procura (para uma revisão ver 11). Trabalho Proteômica já percorreu um longo caminho nos últimos 25 anos, graças ao aumento da disponibilidade de dados genômicos e do aumento da sensibilidade e precisão dos espectrômetros de massa permitindo high-throughput identificação e quantificação de proteínas 11,12. Uma vez que as proteínas são o produto final da expressão do gene, dados metaproteomic pode ajudar a determinar quais os organismos são activos em qualquer dado ambiente e proteínas que estão a expressar. Isto é vantajoso quando se tenta determinar como um determinado conjunto de variáveis ​​ambientais afetam o fenótipo de um organismo ou comunidade. Logo no início, metaproteomic estudos baseados em MS MS / no oceano foram utilizados para identificar proteínas específicas em alvolinhagens microbianas, com o primeiro estudo focando a luz conduzida da bomba de protões proteorhodopsin em bactérias marinhas SAR11 13. Mais recentemente, análises comparativas metaproteomic elucidaram padrões de expressão de proteínas diferenciais entre as comunidades complexas. Os exemplos incluem a identificação de mudanças temporais no metabolismo do litoral do Noroeste do Atlântico Oceano 14 ou a Península Antártica 5. Outros estudos descrevem variações nos padrões de expressão de proteínas através de escalas espaciais, por exemplo, ao longo de um transecto geográfica de um giro oceânico baixo em nutrientes para um sistema afloramento costeiro altamente produtiva 15. Para mais comentários de metaproteômica recomendamos Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteómica alvejados também tem sido empregada nos últimos anos para quantificar a expressão de vias metabólicas específicas no ambiente 17,18. There são três fases principais na análise metaproteomic. A primeira fase é a preparação da amostra, a qual inclui a recolha da amostra, a lise celular e a concentração de proteína. A recolha de amostras em microbiologia marinho frequentemente implica a filtração da água do mar através de um pré-filtro para remover as células eucarióticas maiores, partículas e bactérias associado a partículas, seguido de filtração para a captura de células microbianas de vida livre, normalmente com o uso de um cartucho de 0,22? M 19,20 unidade de filtro. Estes filtros são encaixada num cilindro de plástico e uma lise celular e protocolo de extracção de proteína que pode ser realizada dentro da unidade de filtro seria uma ferramenta valiosa. Uma vez que a biomassa é obtido, as células devem ser lisadas para permitir a extracção de proteína. Vários métodos podem ser empregues, incluindo a guanidina-HCl e sulfato de lise 21 de sódio dodecilo (SDS), métodos baseados em lise. Apesar de detergentes como SDS são muito eficientes em interromper as membranas e solubilizar muitos tipos de proteína, concentrations tão baixo quanto 0,1% pode interferir com a digestão de proteínas a jusante e análise MS 22. De grande preocupação é os efeitos negativos de SDS sobre a eficiência da digestão de tripsina, poder de resolução de cromatografia líquida de fase reversa e de supressão de iões ou acumulação no interior da fonte de iões 23. A segunda fase é de fraccionamento e de análise, onde as proteínas são sujeitas a digestão enzimática seguida por análise por LC MS / MS, o que resulta no padrão de fragmentação am / Z que pode ser usada para determinar a sequência de aminoácidos primária do péptido tríptico inicial. Vários métodos de digestão pode ser realizada de acordo com os tipos de detergentes utilizados, bem como o fluxo de trabalho de espectrometria de massa a jusante. No nosso protocolo, electroforese PAGE 1-D seguido pela remoção do SDS a partir do gel é utilizada de modo a remover qualquer contaminação detergente. A análise de proteínas que são difíceis de solubilizar, tais como proteínas de membrana, requer o uso de alta concentrações de SDS ou outros detergentes. Isto leva a problemas de compatibilidade com eletroforese SDS-gel. Se o objectivo de um estudo requer a solubilização destes difícil de solubilizar proteínas, o sistema de tubos-gel pode ser usada 22,24. O método do tubo-gel incorpora as proteínas no interior da matriz de gel, sem a utilização de electroforese. Posteriormente quaisquer detergentes utilizados para a solubilização são removidos antes da digestão de proteínas. A terceira fase é a análise bioinformática. Nesta fase, os dados de péptidos MS / MS são pesquisados ​​contra uma base de dados de sequências de nucleótidos traduzidas para determinar quais os péptidos e as proteínas estão presentes na amostra. A identificação de péptidos está dependente da base de dados é pesquisado contra. Dados metaproteomic marinhos são comumente procurou contra bancos de dados composta de genomas de referência, dados metagenomic tais como o conjunto de dados de amostragem Oceano Global 25, bem como de células amplificado genomas individuais de li incultaneages 26,27. Identificação de proteínas também pode ser aumentada pela inclusão de sequências metagenomic partir da mesma amostra de dados como o metaproteomic foi derivado 5. Aqui nós fornecemos um protocolo para a geração de péptidos adequados para a análise baseada em MS MS / a partir de biomassa microbiana recolhido por filtração e armazenados numa solução de estabilização de ARN. O protocolo aqui descrito permite a ADN e proteína a ser isolada a partir da mesma amostra, de modo que todos os passos que conduzem à proteína e as precipitações de DNA são idênticas. De uma perspectiva prática, a filtração é menos necessária uma vez que apenas um filtro é necessário tanto para a extracção do ADN e proteína. Gostaríamos também de reconhecer que este protocolo foi criado através da combinação, adaptação e alteração de dois protocolos previamente publicados. Os passos de lise celular são adaptadas de Saito et ai. (2011) 28 e a tripsina em gel digerir componente é adaptado de ShevcheNKO et ai. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0,22 &mu; m unidade de filtro</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Amostragem</td></tr><tr><td>RNAlater Solução de Estabilização</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Amostragem</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1 ou TB0196-500G</td><td>Extração de Proteína / SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Extração de Proteína</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>15-21-3</td><td>Extração de Proteína / SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>6381-92-6</td><td>Extração de Proteína</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Extração de Proteína</td></tr><tr><td>Filtro Amicon 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Extração de Proteína</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>Precipitação de Proteína</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>de Precipitação de Proteína MPC</td><td>Epicentro</td><td>mmP03750</td><td>Precipitação de DNA</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>Precipitação de DNA</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Qubit dsDNA BR</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Quantificação de DNA</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>Quantificação de proteína</td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Bio Basic</td><td>57-50-1</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>30% Acrilamida</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>B-mercaptoetanol</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Caleidoscópio Ladder</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>HPLC grau H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Bio Basic</td><td>144-48-9</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>In-gel Tripsina digest</td></tr><tr><td>2 ml frasco ROBO 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>Digestão de tripsina em gel</td></tr><tr><td>Inserção do BM dos PP, nenhuma mola</td><td>Digestão do Em-gel da Tripsina</td> do Ciência <td>4025P-631</td><td>da vida Candian Life</td></tr></tbody></table>

um aquatic microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para tryptic peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Tecnologias metaômicas, como metagenômica, metatranscriptômica e metaproteômica, podem ajudar na compreensão da estrutura e do metabolismo da comunidade microbiana. Embora poderosa, a metagenômica sozinha só pode elucidar o potencial funcional. Por outro lado, a metaproteômica permite a descrição do metabolismo e função in situ expressos de uma comunidade. Aqui descrevemos um protocolo para lise celular, isolamento de proteínas e DNA, bem como digestão e extração de peptídeos de células microbianas marinhas coletadas em uma unidade de filtro de cartucho (como a unidade de filtro Sterivex) e preservadas em uma solução de estabilização de RNA (como RNAlater). Em estudos proteômicos baseados em espectrometria de massa, a identificação de peptídeos e proteínas é realizada comparando espectros de massa em tandem de peptídeos com um banco de dados de sequências de nucleotídeos traduzidas. Incluir o metagenoma de uma amostra no banco de dados de pesquisa aumenta o número de peptídeos e proteínas que podem ser identificados a partir dos espectros de massa. Portanto, neste protocolo, o DNA é isolado do mesmo filtro, que pode ser usado posteriormente para análise metagenômica.

Como demonstração, foi realizado o protocolo em duas amostras de água do mar coletadas da superfície e camada de clorofila máxima do oceano costeiro no Norte do Canadá. Enquanto no mar, 6-7 L de água do mar foi passado através de um 3 um GF / D pré-filtro, em seguida, as células microbianas foram recolhidos para uma unidade de cartucho de filtro de 0,22 um, seguindo o protocolo de Walsh et ai. 20. As células foram imediatamente armazenadas numa solução de estabilização de ARN, até processamento poste...

Este protocolo é para a extração e concentração de proteína e DNA de biomassa microbiana coletada da água do mar, seguida pela geração de peptídeos trípticos adequados para análise proteômica baseada em espectrometria de massa em tandem.

Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

O objetivo deste procedimento é a extração de proteínas e DNA da biomassa microbiana de água do mar, seguida pela geração de peptídeos trípticos para análise proteômica baseada em espectrometria de massas em tandem. Isso é realizado primeiramente lisando células previamente acumuladas em um filtro de cartucho. O segundo passo é concentrar o lisado celular utilizando unidades de filtro ultracentrífugo.Em seguida, o lisado é separado em duas frações, uma para precipitação de proteínas e outra para precipitação de DNA. O passo final consiste em realizar a digestão enzimática com tripsina em gel e extrair os peptídeos adequados para análise por cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem. Por fim, análises bioinformáticas subsequentes podem ser utilizadas para identificar as proteínas expressas na amostra, enquanto o DNA isolado pode ser usado para análise metagenômica e/ou do gene 16 S-R-R-N-A.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que tanto proteína quanto DNA podem ser isolados da mesma amostra simultaneamente. Para começar, expelir a solução de estabilização de RNA da unidade de filtro em uma tubo microcentrífugo de dois mililitros, utilizando uma seringa de 60 mililitros conectada à extremidade com bloqueio tipo luer da centrífuga com filtro, e centrifugar o tubo microcentrífugo de dois mililitros por 10 minutos a 17.000 × g para formar um pellet de quaisquer detritos celulares após a centrifugação. Transferir o sobrenadante para uma unidade de filtro ultracentrífugo de 10 K para capturar quaisquer proteínas provenientes de células que tenham lisado na amostra.Não descarte o pellet. Realize a centrifugação da unidade de filtro ultracentrífugo a 3.270 × g durante 30 minutos ou até que o volume tenha reduzido a aproximadamente 600 microlitros. Enquanto isso, derreta a ponta de uma pipeta P10 e bloqueie o lado da unidade de filtro sem trava de encaixe com a extremidade aberta da ponta.Isso garantirá que nenhum tampão de extração nem biomassa escapem durante os passos subsequentes. Para suspender o precipitado em um mililitro de solução de extração com SDS e pipetar na unidade original do filtro de cartucho. A maneira mais fácil de pipetar na unidade de filtro de cartucho é empilhar uma ponteira P200 sobre uma ponteira P1000 e usar essa ponteira dupla para a pipetagem. Adicione um mililitro adicional de solução de extração com SDS à unidade de filtro de cartucho, de modo que o volume total seja de aproximadamente dois mililitros.Para filmagem. Feche a extremidade com trava do cartucho do filtro e coloque a unidade do filtro cartucho no tubo de 50 mililitros. Em seguida, coloque três lenços de laboratório amassados no fundo de um tubo cônico de 50 mililitros.Feche a tampa e coloque o tubo no forno de hibridização para incubação por 10 minutos à temperatura ambiente com rotação. Após 10 minutos, coloque o filtro sobre um flutuador de espuma e fixe-o no lugar com uma seringa de cinco mililitros na extremidade com trava de engate, carregue e incube em banho-maria a 95 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, deixe a unidade de filtro com cartucho esfriar e gire à temperatura ambiente por uma hora. Quando estiver frio, expulse a solução extratora de SDS (lisado celular) do filtro com uma seringa de 60 mililitros para dentro da mesma unidade de filtro ultracentrífugo.Como antes, adicione um mililitro de solução fresca de extração com SDS à unidade de filtro de cartucho e misture durante 30 segundos manualmente. Em seguida, expulse o conteúdo do filtro para a unidade de filtro ultracentrífuga utilizando a seringa de 60 mililitros para enxaguar e garantir que todas as proteínas tenham sido removidas e coletadas. Realize a centrifugação na unidade de filtro ultracentrífuga por 45 minutos a 3.270 vezes a gravidade, ou até que o volume na unidade de filtro seja inferior a 600 microlitros.Descarte o fluxo e complete o filtro ultracentrífugo com solução fresca de extração de SDS. Centrifugue o filtro por mais 45 minutos a 3.270 ×g antes de repetir este passo mais duas vezes. Certifique-se de que o volume final no filtro ultracentrífugo seja de, no máximo, 600 microlitros ao final da última centrifugação.Neste ponto, meça o volume do concentrado e divida-o em duas partes. Uma fração será usada para precipitação de DNA e a outra para precipitação de proteínas. Para precipitação de proteínas, adicione quatro volumes de metanol e acetona em uma proporção de 50 para 50 a um volume de concentrado e vortex por 10 segundos, seguido de incubação durante a noite a menos 20 graus Celsius.No dia seguinte, centrifugue a mistura a 17.000 × g durante 30 minutos; após a decantação do sobrenadante, deixe o pellet secar em um speed vac por uma hora. Não seque em excesso o pellet, pois isso pode dificultar a sua ressuspensão.Suspenda o pellet em 25 microlitros de solução extratora de SDS. Deixe repousar por uma hora e, em seguida, resuspenda pipetando para cima e para baixo. Realize eletroforese em gel de SDS-PAGE nas proteínas conforme detalhado no protocolo do texto, trabalhando em uma cabine de segurança biológica para minimizar contaminação, e corte a parte excessiva do gel abaixo da marca de 10 kilodaltons na escala de peso molecular para cada poço.Cada faixa será analisada no espectrômetro de massas em tandem. Separadamente, corte cada faixa em quadrados de um milímetro por um milímetro para aumentar a área superficial e coloque todos os quadrados da faixa em um tubo microcentrífugo de baixa ligação. Repetindo para todas as faixas, pode-se usar ácido acético 1% para evitar que o gel seque e torne-se difícil de cortar.Prossiga com a digestão no gel pela tripsina e extração de peptídeos conforme descrito no protocolo textual ou com a precipitação de DNA na solução de extração de SDS até a fração concentrada a ser usada para precipitação de DNA até a marca de 500 microlitros. Esta etapa tem como objetivo simplesmente aumentar o volume da solução, facilitando o manuseio. Em seguida, adicione 0,583 volumes de um reagente de precipitação de proteínas, como o reagente MPC de precipitação de proteínas, e vortexe.Por 10 segundos, uma forma de precipitação branca é centrifugada a 17.000 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para outro tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e adicione 0,95 volumes de isopropanol, invertendo a mistura de 30 a 40 vezes antes de centrifugar por 10 minutos a quatro graus Celsius em velocidade máxima. Decante e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet duas vezes com 750 microlitros de etanol a 70%.Remova o máximo de etanol possível por pipetagem e, em seguida, deixe o pellet secar ao ar. Não seque em excesso o DNA, pois isso pode dificultar a ressuspendência após a secagem. Resuspenda o pellet em 25 microlitros de tampão TE de baixa concentração, pH 8.Quantifique o DNA utilizando um kit de ensaio de DNA de dupla fita e as instruções do fabricante. Realize também eletroforese em gel de agarose com três microlitros do DNA para verificar sua qualidade. Os peptídeos foram submetidos à análise por espectrometria em tandem a partir dos peptídeos. Foram gerados mais de 23.000 espectros por amostra, a partir dos quais peptídeos e proteínas foram identificados.A composição taxonômica e funcional dos meta-proteomas foi analisada usando uma combinação de blast P e o analisador de metagenoma. O pacote de software indicou que as proteínas atribuídas às alfa-proteobactérias foram as mais representadas no conjunto de dados. A grande maioria dessas foi atribuída ao clado SAR R 11.O grupo Roter das Alfa Proteobactérias também foi altamente representado e identificado, ocorrendo mais frequentemente em águas superficiais. As proteínas atribuídas a doenças bacterianas foram distribuídas uniformemente entre a superfície e o máximo de clorofila, mas as proteínas de bactérias flail foram identificadas em maior grau no máximo de clorofila.As proteínas de gammaproteobactérias foram distribuídas uniformemente por toda a coluna d'água, enquanto as proteínas de betaproteobactérias foram encontradas predominantemente na superfície. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, se executada corretamente.

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