Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

O objetivo deste procedimento é a extração de proteínas e DNA da biomassa microbiana de água do mar, seguida pela geração de peptídeos trípticos para análise proteômica baseada em espectrometria de massas em tandem. Isso é realizado primeiramente lisando células previamente acumuladas em um filtro de cartucho. O segundo passo é concentrar o lisado celular utilizando unidades de filtro ultracentrífugo.

Em seguida, o lisado é separado em duas frações, uma para precipitação de proteínas e outra para precipitação de DNA. O passo final consiste em realizar a digestão enzimática com tripsina em gel e extrair os peptídeos adequados para análise por cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem. Por fim, análises bioinformáticas subsequentes podem ser utilizadas para identificar as proteínas expressas na amostra, enquanto o DNA isolado pode ser usado para análise metagenômica e/ou do gene 16 S-R-R-N-A.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que tanto proteína quanto DNA podem ser isolados da mesma amostra simultaneamente. Para começar, expelir a solução de estabilização de RNA da unidade de filtro em uma tubo microcentrífugo de dois mililitros, utilizando uma seringa de 60 mililitros conectada à extremidade com bloqueio tipo luer da centrífuga com filtro, e centrifugar o tubo microcentrífugo de dois mililitros por 10 minutos a 17.000 × g para formar um pellet de quaisquer detritos celulares após a centrifugação. Transferir o sobrenadante para uma unidade de filtro ultracentrífugo de 10 K para capturar quaisquer proteínas provenientes de células que tenham lisado na amostra.

Não descarte o pellet. Realize a centrifugação da unidade de filtro ultracentrífugo a 3.270 × g durante 30 minutos ou até que o volume tenha reduzido a aproximadamente 600 microlitros. Enquanto isso, derreta a ponta de uma pipeta P10 e bloqueie o lado da unidade de filtro sem trava de encaixe com a extremidade aberta da ponta.

Isso garantirá que nenhum tampão de extração nem biomassa escapem durante os passos subsequentes. Para suspender o precipitado em um mililitro de solução de extração com SDS e pipetar na unidade original do filtro de cartucho. A maneira mais fácil de pipetar na unidade de filtro de cartucho é empilhar uma ponteira P200 sobre uma ponteira P1000 e usar essa ponteira dupla para a pipetagem. Adicione um mililitro adicional de solução de extração com SDS à unidade de filtro de cartucho, de modo que o volume total seja de aproximadamente dois mililitros.

Para filmagem. Feche a extremidade com trava do cartucho do filtro e coloque a unidade do filtro cartucho no tubo de 50 mililitros. Em seguida, coloque três lenços de laboratório amassados no fundo de um tubo cônico de 50 mililitros.

Feche a tampa e coloque o tubo no forno de hibridização para incubação por 10 minutos à temperatura ambiente com rotação. Após 10 minutos, coloque o filtro sobre um flutuador de espuma e fixe-o no lugar com uma seringa de cinco mililitros na extremidade com trava de engate, carregue e incube em banho-maria a 95 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, deixe a unidade de filtro com cartucho esfriar e gire à temperatura ambiente por uma hora. Quando estiver frio, expulse a solução extratora de SDS (lisado celular) do filtro com uma seringa de 60 mililitros para dentro da mesma unidade de filtro ultracentrífugo.

Como antes, adicione um mililitro de solução fresca de extração com SDS à unidade de filtro de cartucho e misture durante 30 segundos manualmente. Em seguida, expulse o conteúdo do filtro para a unidade de filtro ultracentrífuga utilizando a seringa de 60 mililitros para enxaguar e garantir que todas as proteínas tenham sido removidas e coletadas. Realize a centrifugação na unidade de filtro ultracentrífuga por 45 minutos a 3.270 vezes a gravidade, ou até que o volume na unidade de filtro seja inferior a 600 microlitros.

Descarte o fluxo e complete o filtro ultracentrífugo com solução fresca de extração de SDS. Centrifugue o filtro por mais 45 minutos a 3.270 ×g antes de repetir este passo mais duas vezes. Certifique-se de que o volume final no filtro ultracentrífugo seja de, no máximo, 600 microlitros ao final da última centrifugação.

Neste ponto, meça o volume do concentrado e divida-o em duas partes. Uma fração será usada para precipitação de DNA e a outra para precipitação de proteínas. Para precipitação de proteínas, adicione quatro volumes de metanol e acetona em uma proporção de 50 para 50 a um volume de concentrado e vortex por 10 segundos, seguido de incubação durante a noite a menos 20 graus Celsius.

No dia seguinte, centrifugue a mistura a 17.000 × g durante 30 minutos; após a decantação do sobrenadante, deixe o pellet secar em um speed vac por uma hora. Não seque em excesso o pellet, pois isso pode dificultar a sua ressuspensão.

Suspenda o pellet em 25 microlitros de solução extratora de SDS. Deixe repousar por uma hora e, em seguida, resuspenda pipetando para cima e para baixo. Realize eletroforese em gel de SDS-PAGE nas proteínas conforme detalhado no protocolo do texto, trabalhando em uma cabine de segurança biológica para minimizar contaminação, e corte a parte excessiva do gel abaixo da marca de 10 kilodaltons na escala de peso molecular para cada poço.

Cada faixa será analisada no espectrômetro de massas em tandem. Separadamente, corte cada faixa em quadrados de um milímetro por um milímetro para aumentar a área superficial e coloque todos os quadrados da faixa em um tubo microcentrífugo de baixa ligação. Repetindo para todas as faixas, pode-se usar ácido acético 1% para evitar que o gel seque e torne-se difícil de cortar.

Prossiga com a digestão no gel pela tripsina e extração de peptídeos conforme descrito no protocolo textual ou com a precipitação de DNA na solução de extração de SDS até a fração concentrada a ser usada para precipitação de DNA até a marca de 500 microlitros. Esta etapa tem como objetivo simplesmente aumentar o volume da solução, facilitando o manuseio. Em seguida, adicione 0,583 volumes de um reagente de precipitação de proteínas, como o reagente MPC de precipitação de proteínas, e vortexe.

Por 10 segundos, uma forma de precipitação branca é centrifugada a 17.000 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para outro tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e adicione 0,95 volumes de isopropanol, invertendo a mistura de 30 a 40 vezes antes de centrifugar por 10 minutos a quatro graus Celsius em velocidade máxima. Decante e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet duas vezes com 750 microlitros de etanol a 70%.

Remova o máximo de etanol possível por pipetagem e, em seguida, deixe o pellet secar ao ar. Não seque em excesso o DNA, pois isso pode dificultar a ressuspendência após a secagem. Resuspenda o pellet em 25 microlitros de tampão TE de baixa concentração, pH 8.

Quantifique o DNA utilizando um kit de ensaio de DNA de dupla fita e as instruções do fabricante. Realize também eletroforese em gel de agarose com três microlitros do DNA para verificar sua qualidade. Os peptídeos foram submetidos à análise por espectrometria em tandem a partir dos peptídeos. Foram gerados mais de 23.000 espectros por amostra, a partir dos quais peptídeos e proteínas foram identificados.

A composição taxonômica e funcional dos meta-proteomas foi analisada usando uma combinação de blast P e o analisador de metagenoma. O pacote de software indicou que as proteínas atribuídas às alfa-proteobactérias foram as mais representadas no conjunto de dados. A grande maioria dessas foi atribuída ao clado SAR R 11.

O grupo Roter das Alfa Proteobactérias também foi altamente representado e identificado, ocorrendo mais frequentemente em águas superficiais. As proteínas atribuídas a doenças bacterianas foram distribuídas uniformemente entre a superfície e o máximo de clorofila, mas as proteínas de bactérias flail foram identificadas em maior grau no máximo de clorofila.

As proteínas de gammaproteobactérias foram distribuídas uniformemente por toda a coluna d'água, enquanto as proteínas de betaproteobactérias foram encontradas predominantemente na superfície. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, se executada corretamente.