Name: Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Aprenda a converter fibroblastos humanos diretamente em células progenitoras neurais induzidas usando fatores de reprogramação viral. Este método acelera a geração de células neurais para aplicações terapêuticas personalizadas.

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Gostaríamos de agradecer a todos os membros da célula-tronco e medicina regenerativa Grupo da Universidade de Würzburg para sugestões úteis e Martina Gebhardt, bem como Heike Arthen para excelente suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), o Ministério da Educação e Investigação alemão BMBF (01 GN 0813), os bávaros pesquisa Rede pluripotentes induzidas Stem Cells &quot;forIPS&quot; eo &quot;Stiftung Sibylle Assmus &quot;. A Figura 1 foi produzido usando Servier arte médica, disponível a partir de www.servier.com.

Os fibroblastos humanos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de uma biópsia da pele após a obtenção do consentimento informado ea depuração ética pelo comitê de ética da Universidade de Würzburg, Alemanha (relatório ético não: 96/11 datada de 10.06.2011). 1. punção para biópsia <ol><li> Desinfectar a pele do paciente. Anestesiar parte pele dos quais biópsia será feita a partir de (preferencialmente uma área menos exposta ao sol) com 0,5 a 1 ml de cloridrato de mepivacaína intracutaneamente e preparar biópsia da pele utilizando um punção biópsia 3 milímetros estéril, lavar biópsia com DPBS + 1 ml / 1 ml de gentamicina e remova gorda. Lavar biópsia duas vezes com DPBS + gentamicina, aspirado completamente DPBS e tampa biópsia com Dispase II (2,4 U / ml) e incuba-se 16 - 18 h a 4 ° C. </li><li> Aspirar Dispase completamente, lave duas vezes com DPBS e remover epiderme com uma pinça. Lave duas vezes com DPBS biópsia, adicionar 2 ml de colagenase tipo 2 (500 U / ml CDU), a transferência em 15 ml de tubo e adicionar Collagenase até 5 ml de volume total. Incubar durante 45 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Centrifugar 5 min a 180 xg e descartar o sobrenadante depois. Ressuspender o sedimento em 10 ml de DMEM-FCS-Gentamicina-meios (10% de FCS, 1 ul / ml de gentamicina) e centrifuga-se novamente durante 5 min a 180 x g. Elimine o sobrenadante e ressuspender sedimento em 1,5 ml DMEM-FCS-gentamicina-media. Transferir para frascos de cultura T25 tecido aderente e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Mudança de mídia a cada 3 dias. </li><li> Após aproximadamente 2 semanas, quando as células são confluentes em torno de partes da pele, células divididas utilizando tripsina / EDTA (0,05%): células de lavagem uma vez com DPBS, incube 5 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2, após a adição de 2 ml de tripsina / EDTA (0,05%), adicionar 2 ml de DMEM-FCS-Gentamicina-media, transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 180 xg durante 5 min; descartar pellet sobrenadante e ressuspender em quantidade adequada de DMEM-FCS-gentamicina-media. </li><li> Além disso expandir as células, alterando a forma cada 3Rd dia e divisão, tal como descrito acima, quando as células estão confluentes; adição de gentamicina pode ser interrompido após a passagem 2. </li><li> Antes de usar as células para experiências de conversão direta, certifique-se de excluir a contaminação por micoplasma por ensaios padrão. </li><li> Quando as células foram expandidas, você pode começar directamente a conversão ou congelar células para baixo usando 10% de DMSO e 90% FCS. As células devem ser armazenados em -80 ° C durante 2 dias e, em seguida, transferida para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li><li> Para a preparação de conversão, lave as células uma vez com DPBS, aspirado de DPBS e adicionar 2,5 ml de tripsina / EDTA (0,05%). Manter durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Toque balão suavemente para separar células, ressuspender em 2,5 mL de meio de fibroblastos (DMEM incl. L-Glu + FCS a 10% + NEAA a 1% + 1% de piruvato de sódio) e transferir para tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Ressuspender as células em 1 ml de mídia de fibroblastos e pipeta cima e para baixo para gerar suspensão de células individuais. &lt;/ Li&gt; <li> Contar o número de células utilizando uma câmara de contagem Fuchs-Rosenthal- ou Neubauer-célula e a placa 3 x 10 4 culas por po de uma placa de 24 poços,. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. Infecção de fibroblastos humanos com Sendai vírus e Transdiferenciação NOTA: Para garantir a segurança, as seguintes etapas de manuseamento dos vírus tem que ser realizado numa câmara de segurança biológica e uma câmara de fluxo laminar, e com equipamento apropriado pessoal de segurança, especialmente uma máscara cirúrgica, para evitar a exposição da mucosa. <ol><li> Mudar as células a 100 ul de meios de fibroblastos (Passo 1.9). Descongele alíquotas de Oct4-, Klf4-, Sox2- e vírus c-myc-Sendai e ressuspender cada vírus em 1 ml de mídia de fibroblastos. Adicionar cada vírus com uma MOI de 3 para as células (título do vírus varia de lote para lote, mas uma parte alíquota de cada um dos vírus pode ser geralmente utilizado para a infecção de 10 cavidades de uma placa de 24 poços-) e misturar suavemente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 </sub&gt;. </li><li> Após 24 h o meio aspirado e adicionar 500 ul de meios neuroinduction (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) e cultura a 39 ° C, 5% de CO 2 a partir de agora. Troque a mídia todos os dias. </li><li> No dia 6 após a infecção preparar 6-Bem placas revestidas com laminina: diluir a laminina de 1 ug / ml em DPBS, adicionar 1 ml de solução em 6 bem-placas e manter a 4 ° C durante 24 h. </li><li> No dia 7, após a infecção dividir as células utilizando DPBS / EDTA: aspiram os meios de comunicação e lave as células uma vez com DPBS, em seguida, adicionar 500 mL de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 500 ul de DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml e centrifugar a 180 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1,5 ml de meio neuroinduction, placa de 6 poços em placas revestidas com laminina e adicionar ROCHA inibidor Y27632 no final de um concentration de 10 pM para as células, a cultura a 39 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Troque a mídia todos os dias. </li><li> A partir do dia 14 após a infecção, as células de cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Colónias Neuroepiteliais se tornar aparente por volta do dia 17 após a infecção por microscopia de contraste de fase. Eles devem ser grandes o suficiente para ser escolhido por volta do dia 20 após a infecção. </li></ol> 3. isolamento de colónias putativas INPC <ol><li> Um dia antes da colheita, um revestimento 48 bem-placa com laminina: diluir a laminina de 1 ug / ml em DPBS, adicionar 300 ul de solução em placas e manter a 4 ° C durante 24 h. Um dia mais tarde laminina aspirado das placas e adicionar 200 uL de meio aos poços neuroinduction. </li><li> Lave os 6 bem-placas contendo as colônias para ser retirado uma vez com DPBS e adicionar DPBS 2 ml por poço de 6 bem-placa. Escolha as colônias mecanicamente: raspar em torno de colônias usando uma agulha fina para se livrar das células circundante; definir o 2001; l Pipetman em 50 ul e escolher as colônias utilizando as respectivas pontas de pipeta. </li><li> Transferir uma colônia cada um em um poço de um 48 bem-placa revestida com laminina e gerar uma suspensão única célula mecanicamente por pipetagem cima e para baixo 10 vezes. Adicionar inibidor ROCHA Y27632 numa concentração final de 10 uM para as células. </li><li> Crescer as células na placa de 48 poços-a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 dias. Troque a mídia a cada segundo dia até que as células chegar a 80-90% de confluência (aproximadamente 3 - 4 dias.). </li></ol> 4. Expansão e Cryo-preservação do iNPCs <ol><li> Passaging e Expansão da iNPCs <ol><li> Aspirar o meio e lava-se as células com DPBS. Aspirar o DPBS e adicionar 200 ul de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, adicionar 200 uL de meio DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 minutos . </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de Neuroimeios nduction (Passo 2.2), placa em placas de 12 poços revestidas com laminina e adicionar inibidor ROCHA Y27632 numa concentração final de 10 uM para as células, a cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Após as células atingem 80-90% de confluência elas podem ser quer expandido ou congelado para baixo como se segue. </li></ol></li><li> Congelamento de iNPCs <ol><li> Aspirar o meio e lava-se as células com DPBS. Aspirar o DPBS e adicionar 300 ul de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, adicionar 300 uL de meio DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de meio de congelação comercial NSC. Suspensão transferência para frascos de congelamento e colocar no recipiente de congelamento celular. Armazenar a -80 ° C durante 2 dias, em seguida, transferir para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol></li></ol> 5. Diferenciação de iNPCs <ol><li> Diferenciação em direção neurônioal linhagem <ol><li> Células de cultura em placas revestidas com laminina, conforme descrito acima. Meios de comunicação para Alterar neuro-diff-meios (DMEM / F-12, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 300 ng / ml de cAMP, 200 uM de vitamina C, 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF) quando as células são cerca de 70% confluente. Mudança de mídia todos os dias durante três semanas. Fazer células não divididas durante a diferenciação. </li><li> Depois de três semanas as células devem expressar o marcador neuronal TUJ1. Para ganhar mais neurônios maduros e subtipos neuronais continuar diferenciação até 3 meses. </li></ol></li><li> Diferenciação em direção linhagem glial <ol><li> Mudar meios para meios de indução da glia (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 10 uM β-mercaptoetanol, 100 uM aminoácidos não essenciais 1,5 mM, L-glutamina, insulina 5 ug / ml, 40 ng / ml de T3) incluindo 20 ng / mL de EGF para induzir a diferenciação em células progenitoras gliais. Retire metade dos meios de comunicação e substituir por meios frescos todos os dias durante cerca de 2 semanas. Durante este período, as células devem ser dividida1: 3 na presença de 10 uM de inibidor ROCHA Y27632 100% de confluência quando for atingido. </li><li> Após 2 semanas diferenciar células ainda em astrócitos: quando as células são mídias de mudança quase confluentes a mídia astrocyte comercial disponível, alteração de mídia a cada segundo dia. Após cerca de 7 dias as células começam a expressar marcadores de astrócitos (por exemplo, GFAP). Se as células obter 100% confluentes durante o protocolo de diferenciação, dividi-los em uma proporção de 1: 2 na presença de 10 uM de inibidor ROCHA Y27632. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós mostramos o isolamento e conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais livre de transgenes expansíveis e sua progênie diferenciada como base putativo para a terapia de substituição de células ou aplicação em análises de despistagem de drogas. Conversão directa linhagem de células somáticas em NPCs foi conseguido através da expressão forçada de transcrição específicos de linhagem factores 26,33,34. No entanto, em muitos casos, fibroblastos fetais foram usadas para experiênc...

Em 2006 Yamanaka e colegas pode mostrar pela primeira vez, a possibilidade de reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente 1. Este desdiferenciação foi conseguida por sobre-expressão de quatro factores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc em fibroblastos de murino. Os chamados células estaminais pluripotentes induzidas gerados (IPSCs) mostram a equivalência funcional para células estaminais embrionárias (CES) e pode, assim, ser diferenciadas em todos os tipos de células do organismo adulto. Um ano mais tarde, a reprogramação iPSCs também poderia ser conseguido, por fibroblastos humanos 2. Experiências em modelos animais demonstraram que as células iPSC derivados podem em geral ser utilizadas para a terapia de substituição de células, por exemplo, na doença de Parkinson (DP) de 3-5. No entanto, várias limitações associadas com o uso de iPSCs representam obstáculos para a plena realização de seu potencial terapêutico. Em primeiro lugar, a reprogramação das células para um estado pluripotente e subsequentecontrolo de qualidade é geralmente um processo demorado e ineficiente, produzindo, em procedimentos de cultura de células extensos e, portanto, dispendiosas. Em segundo lugar, iPSCs precisa de voltar a ser diferenciadas em células do tipo desejado de interesse antes da aplicação biomédica e a probabilidade de células pluripotentes residuais na população diferenciada abriga um potencial tumorigénico significativa e, assim, exibe um risco elevado após o transplante de células 6. Em terceiro lugar, o processo de reprogramação é normalmente conseguida através da indução de factores de reprogramação por infecção lenti- ou retroviral. A integração destes vírus no genoma do hospedeiro pode levar a mutagénese por inserção e / ou reactivação descontrolada dos transgenes 7,8. Sistemas não-integrativos foram desenvolvidos para entregar os fatores de reprogramação para células alvo, o que minimiza o risco de mutagénese de inserção do transgene e reactivação. Exemplos para essas abordagens livre de transgenes são a reprogramação de células usando não-integraçãoAdeno ou vírus Sendai 9,10, vectores baseados em DNA ou 11 a aplicação de métodos de DNA-free, como a transfecção de ARNm sintético 12 ou transdução de proteínas recombinantes 13,14. Outro método promissor para a derivação de livre-iPSC transgene é a utilização de construções de reprogramação de lentivírus modificadas-loxP e eliminação subsequente de transgenes que utilizam o sistema de recombinação Cre-loxP DNA 15,16. Uma abordagem mais simples para gerar células neurais para a terapia de substituição de células representa conversão directa de fibroblastos em neurônios pós-mitóticas 17-20. Vierbuchen et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores de transcrição Ascl1, Brn2 Myt1l e resulta na geração de 20% de neurónios de fibroblastos de murino 17. Em 2011 ele foi mostrado para que os mesmos três fatores de transcrição em combinação com superexpressão de NeuroD1 permitir transdiferenciação dos fibroblastos humanos em neurons 19. Neurônios humanos induzida também pode ser gerada por superexpressão de Ascl1 e NGN2 sob dupla SMAD- e GSK3β- inibição 20. Notavelmente, a conversão directa de fibroblastos em neurónios gera, uma população de células pós-mitóticas não proliferativa que não permite uma maior expansão e biobanking. Recentemente, a conversão directa de fibroblastos para uma população de células neurais tronco / progenitoras proliferam foi relatado 21-26. Por razões de clareza, todos estes tipos de células serão nomeados como células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) neste relatório. Han et al. Overexpressed Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 para gerar iNPCs. Tal como os seus homólogos de células-tronco neurais derivadas de células ou de tecidos primária ou pluripotentes estes iNPCs são tripotential e poderia ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos 21. Nosso grupo relatou um protocolo de conversão ligeiramente diferente envolvendo superexpressão de Sox2, Klf4, E c-Myc e induzida por expressão para Oct4 apenas 5 dias. Com esta abordagem que poderia gerar de forma estável proliferação de iNPCs embrionárias e adultas fibroblastos de murino que exibem silencioso completo da reprogramação fatores 22. Em contraste com iPSCs, iNPCs não apresentam um potencial tumorigénico 27 após o transplante. Utilizamos com sucesso células convertido em um modelo animal de desmielinização, ratos deficientes em mielina, demonstrando que são clinicamente úteis iNPCs 22. Até então, NPCs só poderia ser gerada a partir de células-tronco pluripotentes ou tecido neural primário 28-32. iNPCs são estavelmente células expansíveis que podem ser criopreservadas e são capazes de se diferenciar em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Muito esforço tem sido feito para adaptar o protocolo conversão direta de mouse para células humanas 23,26,33,34. Em 2012, foi publicado que a superexpressão do único fator Sox2 em fibroblastos é suficiente para gerar murino e humanos iNPCs <sup&gt; 33. Os autores relataram geração de iNPCs humanos a partir de fibroblastos de prepúcio fetais e caracterizada pela coloração-los contra Sox2 e Nestin. No entanto, as células alvo utilizadas para reprogramação representam um tipo muito particular de células que não estará disponível na prática clínica e não havia nenhuma caracterização funcional de células convertidos por transplante num modelo animal realizada. Uma publicação mais recente descreve a geração de células progenitoras neuronais restritas de fibroblastos fetais humanos por sobre-expressão de Sox2, c-Myc e um ou outro ou Brn2 Brn4 34. As linhas de células geradas mostrou capacidade de auto-renovação e pode ser diferenciadas em vários tipos de neurónios terminais. No entanto, a utilização de fibroblastos fetais é desfavorável, uma vez que estas células são de origem heterogénea e não se pode excluir a presença de, por exemplo residual, as células estaminais da crista neural nas preparações. Em 2014, Zhu et al. Relataram a conversão direta de humano adulto e neofibroblastos natais em células progenitoras neurais tripotential por sobre-expressão de Sox2 juntamente com Oct4 ou Oct4 sozinho e adição de moléculas pequenas para o meio de cultura celular. Nomeadamente, com base na sua estudos Sox2 sozinhos foi insuficiente para induzir a conversão directa 26. Mais recentemente, Lu et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores Oct4- o Yamanaka, Sox2-, Klf4-, c-Myc pelo vírus Sendai, durante 24 horas e subsequente inactivação do vírus por um aumento da temperatura resulta na geração de neural tripotential expansível 23 células precursoras. Em conclusão, apesar de os protocolos publicados para a conversão de células humanas até agora têm em comum a sobre-expressão de pelo menos um ou mais dos factores de Yamanaka, muitas vezes, de uma forma atempada restrito, não há nenhuma indicação clara dos factores moleculares mínimos necessários para dirigir directa conversão em iNPCs. A sobre-expressão atempada restrito de Oct4, quer por meios genéticos, transfecção com ARNm sintético, ou cproteína ell-permeante em conjunto com a expressão constitutiva de Sox2, Klf-4, c-Myc e não resultou em linhas estáveis ​​INPC humanos ainda. Assim, a aplicação do vírus Sendai para sobre-expressar todos os factores Yamanaka e oportuno limitar a sua actividade de inactivação por calor do vírus 23 em conjunto com as condições optimizadas dos meios de indução neural 22,31 representa a estratégia preferida até agora. Vários estudos demonstram a funcionalidade celular de NSCs ou os seus homólogos diferenciadas em diferentes modelos de doença animal. Progenitores neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas foram transplantadas em modelos do rato da doença neuroinflamatória esclerose múltipla 35,36. A aplicabilidade de células progenitoras neurais derivadas de células estaminais embrionárias humanas, em EAE (encefalomielite auto-imune experimental) -mice foi mostrado pela primeira vez em 2008 35. As células precursoras neurais multipotentes foram injetadas nos ventrículos do cérebro do rato, e o resultado do transplanteed na redução dos sinais clínicos da EAE. Kim et al., Gerado a partir de precursores oligodendrogliais hESCs e aqueles transplantado por via intracerebroventricular em ratinhos EAE. Embora transplantes não sobreviveram por mais de 10 dias, os ratos apresentaram melhora significativa da função neurológica e redução de células imunes pró-inflamatórios na substância branca 36. Terapia com células-tronco também tem sido aplicada para pré-clínicos segmentação da doença de Parkinson como NPCs poderia ser empregada com sucesso em seus respectivos modelos animais. Para isso, as células progenitoras ou foram derivados a partir de tecido de cérebro fetal 37 diferenciadas a partir de células estaminais pluripotentes 38-40 ou células estaminais mesenquimais foram 41 utilizados. Em 2012, mostrou que iNPCs rato são capazes de produzir a proteína proteolipídica, a principal componente de proteína de mielina, após a transplantação para o cérebro de ratos (MD) deficiente em mielina 22. Por esse experimento prova de princípio a applicabil terapêuticodade de iNPCs foi primeiramente provado e logo confirmada por outro estudo 32. No entanto, o potencial de utilização terapêutica de humanos iNPCs continua a ser explorado. Aqui mostramos um processo robusto e integrado de (i) a derivação de células primárias humanas a partir de doentes adultos por biópsia da pele, (ii) a conversão directa de fibroblastos humanos em um estado progenitora neuronal e (iii) a capacidade de iNPCs ser diferenciadas em neuronal e linhagens gliais. O uso deste protocolo vai ajudar a acelerar a geração de células humanas autólogas para aplicações terapêuticas.

<table><tbody><tr><td>Meio de astrócitos</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia</td><td>pfm médico</td><td>48301</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axônio medchem</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Type2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>PAN&nbsp;</td><td>P10-032100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>LifeTechnologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>GFAP-anticorpo</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>hLIF</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Seralab</td><td>GEM-700-112-P</td><td></td></tr><tr><td>Ki67-anticorpo</td><td>NeoMarkers</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>LifeTechnologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>LifeTechnologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin-anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>LifeTechnologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>NSC meio de congelamento</td><td>Sigma</td><td>C6295</td><td></td></tr><tr><td>Oct4-anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc9081</td><td></td></tr><tr><td>Pax6-anticorpo</td><td>Covance</td><td>PRB-278P</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Invivogen</td><td>inh-sb43</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus: Kit de Reprogramação CytoTune Sendai</td><td>&nbsp; LifeTechnologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Sódiopiruvato</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sox1-anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF3369</td><td></td></tr><tr><td>Sox2-anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td></td><td>T3 Santa Cruz</td><td>sc-205725</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1-anticorpo</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-250</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina C</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em expansível neural células progenitoras

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos da pele de adultos e subsequente diferenciação em células somáticas oferece perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos que contornar as barreiras de histocompatibilidade. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e subsequente diferenciação completa em linhagens desejadas continua a ser um obstáculo para a tradução clínica da tecnologia iPSC por causa do potencial instabilidade genômica e neoplásico associado. Recentemente, nós e os outros mostraram que as células somáticas não só pode ser convertido em iPSCs mas também em diferentes tipos de células-tronco somáticas multipotentes usando fatores definidos, evitando assim a progressão através do estado pluripotente. Em particular, a conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) anuncia a possibilidade de uma fonte de células autólogas novo para várias aplicações tais como a substituição de células, modelagem doençae o rastreio de drogas. Aqui, descrevemos o isolamento de fibroblastos primários humanos adultos por biópsia da pele e sua eficiente conversão direta em iNPCs por expressão oportuna restrito de Oct4, Sox2, Klf4, bem como c-Myc. Colónias neuroepiteliais Sox2-positivos aparecem após 17 dias de indução e linhas INPC pode ser estabelecida de forma eficiente pelo isolamento monoclonal e expansão. Ajuste preciso da multiplicidade de infecção viral e suplementação do fator inibidor de leucemia durante a fase de indução representam fatores críticos para alcançar a eficiência de conversão de até 0,2%. Até agora, as linhas INPC específicos do paciente poderia ser expandida para mais do que 12 passagens e uniformemente exibir características morfológicas e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais, tais como a expressão de nestina e Sox2. As linhas INPC podem ser diferenciados em neurônios e astrócitos como avaliado por coloração contra TUJ1 e GFAP, respectivamente. Em conclusão, nós relatamos um protocolo robusto para a derivação e direct conversão de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais de forma estável expansíveis que podem fornecer uma fonte celular para aplicações biomédicas, tais como a substituição da célula neural autólogo e modelagem de doença.

Aqui apresenta-se descrição de um processo integrado que permite a geração de células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) a partir de fibroblastos humanos que tenham sido obtidos por uma biópsia por punção da pele em menos de 8 semanas (Figura 1). INPCs paciente-specifc pode ser ainda mais diferenciado em linhagens neuronais e gliais e abrigar um enorme potencial para a terapia de substituição de células e modelagem doença. Infecção dos fibroblastos com Oct4-, Klf4-, So...

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

O objetivo geral deste procedimento é encurtar a abordagem clássica de Yamanaka para células IPS, gerando diretamente células progenitoras neurais a partir de uma biópsia de pele do paciente para aplicações terapêuticas. Isso é realizado primeiramente realizando uma biópsia por punção no paciente para obter células fibroblásticas primárias que podem ser cultivadas in vitro. O segundo passo é expandir e posteriormente infectar os fibroblastos cultivados com vírus que codificam fatores de reprogramação para induzir a transdiferenciação.Em seguida, as colônias de células progenitoras neurais induzidas (ou INPC) putativamente convertidas devem ser cuidadosamente selecionadas por meio de validação visual e posteriormente isoladas por picking manual aproximadamente 20 dias após a infecção. O passo final consiste em clonar monoclonalmente e expandir as CIPs em meio de indução neural, com diferenciação in vitro direcionada, sendo a microscopia de imunofluorescência utilizada para demonstrar que as CIPs convertidas diretamente a partir de células do paciente são capazes de se diferenciar em células neuronais e também em células gliais, tornando-as uma fonte praticamente ilimitada para aplicações biomédicas. A vantagem dessa técnica de conversão direta em comparação com métodos existentes, como a obtenção de células-tronco pluripotentes induzidas ao estilo Yamanaka e sua subsequente diferenciação, é dupla.A conversão de DI em células-tronco neurais induzidas multpotentes, que chamamos de células INS, é não apenas consideravelmente mais rápida, mas também mais segura. Assim, o procedimento de transdiferenciação tornará muito mais viável produzir células específicas do paciente para aplicações terapêuticas e apresentará um risco drasticamente menor de formação de tumores em comparação com as células IPS. Com isso, agora somos capazes de superar dois grandes obstáculos da taxa de avanço da medicina atual.Essa é a segurança e eficácia clínicas. Para iniciar a biópsia por punção, desinfete a pele do paciente e anestesie a região onde será realizada a biópsia com 0,5 a um mililitro de mepivacaína hidrocloreto por via intradérmica. Realize a biópsia de pele utilizando uma punção estéril de três milímetros.Lave a biópsia com solução salina tamponada com fosfato tipo dobe echo ou DPBS acrescida de um microlitro por mililitro de gentamicina. Remova a gordura da biópsia utilizando um bisturi e pinça. Em seguida, lave a biópsia mais duas vezes com o tampão antes de aspirar completamente.Cubra a biópsia com a pasta dis dois e incube por 16 a 18 horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, aspire completamente a pasta dis antes de lavar a biópsia duas vezes com DPBS. Remova a epiderme com pinça e, em seguida, lave a biópsia mais duas vezes com DPBS.Em seguida, adicione dois mililitros de colagenase tipo dois e transfira para um tubo de 15 mililitros. Adicione colagenase até cinco mililitros. Incube o volume total por 45 minutos a 37 graus Celsius.Centrifugue a amostra por cinco minutos a 180 ×g e descarte o sobrenadante em seguida. Re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio DMEM contendo soro fetal bovino e gentamicina antes de centrifugar novamente por cinco minutos a 180 ×g. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 1,5 mililitro do mesmo meio. Em seguida, transfira a amostra para um frasco de cultura de tecidos aderente T25 e incube a 37 °C em atmosfera com 5% CO₂, trocando o meio a cada três dias após aproximadamente duas semanas.Uma vez que as células estejam confluentes ao redor das partes da pele, divida as células usando tripsina EDTA conforme descrito no protocolo textual. Amplie ainda mais as células trocando o meio a cada terceiro dia e dividindo quando as células estiverem confluentes. Após excluir contaminação por micoplasma por meio de ensaios padrão, prepare as células para o experimento de conversão direta lavando-as uma vez com DPBS, em seguida aspire o DPBS e adicione 2,5 mililitros de tripsina EDTA. Após incubação das células por cinco minutos a 37 graus Celsius, 5%CO2, bata suavemente no frasco para destacar as células.Resuspenda as células em 2,5 mililitros de meio para fibroblastos e transfira para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue o tubo a 180 ×g por cinco minutos e aspire o sobrenadante. Resuspenda as células em um mililitro de meio para fibroblastos e pipete para cima e para baixo para obter uma suspensão de células simples.Conte o número de células utilizando uma câmara de contagem celular antes do plaqueamento. 30.000 células por poço. Em uma placa de 24 poços, incube as células durante a noite a 37 graus Celsius, 5% CO₂. Os passos que envolvem o manuseio do vírus devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica com equipamentos de proteção individual apropriados, incluindo máscara cirúrgica para prevenir exposição mucosa.Para realizar a infecção, primeiro substitua o meio celular existente por 100 microlitros de meio para fibroblastos. Em seguida, reconstitua os alíquotas descongelados dos vírus T four, KLF four, SOX two e cmix sendi em um mililitro de meio para fibroblastos. Adicione cada vírus com uma MOI de três às células e misture suavemente. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius, 5%CO2. Após 24 horas, aspire o meio e adicione 500 microlitros de meio de indução neural. Cultive as células a 39 graus Celsius, 5%CO2 a partir de agora, trocando o meio a cada dois dias. No sexto dia após a infecção, prepare placas de seis poços revestidas com laminina.Adicione um mililitro de laminina a um micrograma por mililitro em DPBS em placas de seis poços e mantenha as placas a quatro graus Celsius por 24 horas no sétimo dia após a infecção. Divida as células usando D-P-B-S-E-D-T-A conforme descrito no protocolo textual. Adicione 500 microlitros de D-M-E-M-F 12 e transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue a amostra a 180 vezes G durante cinco minutos.Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de meio de indução neural. Plaque as células em placas de seis poços revestidas com laminina e adicione inibidor de cinase RO até uma concentração final de 10 micromolar. Incube as células a 39 graus Celsius, 5%CO2, trocando o meio a cada dois dias a partir do dia 14. Após a infecção, cultive as células a 37 graus Celsius, 5%CO2; colônias de epitélio neural tornam-se aparentes por volta do dia 17 após a infecção, conforme visualizado por microscopia de contraste de fase.Eles devem ser grandes o suficiente para serem selecionados por volta do dia 20 após a infecção, um dia antes da seleção. Placa de 48 poços com laminina conforme descrito no protocolo do texto. Um dia depois, aspire o laminina das placas e adicione 200 microlitros de meio de indução neural aos poços. Lave as placas de seis poços contendo as colônias a serem selecionadas uma vez com DPBS antes de adicionar dois mililitros de meio de indução neural.Por poço de uma placa de seis poços, colete as células mecanicamente raspando ao redor das colônias com uma agulha fina para remover as células vizinhas e, em seguida, retire as colônias utilizando ponteiras de pipeta. Use uma pipeta de 200 microlitros ajustada para 50 microlitros. Transfira cada colônia para um poço de uma placa de 48 poços revestida com lâmina e prepare uma suspensão de célula única mecanicamente, pipetando para cima e para baixo 10 vezes.Adicione o inibidor de quinase R em uma concentração final de 10 micromolar às células. Incube as células na placa de 48 poços a 37 graus Celsius, 5%CO2 por dois dias. Troque o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80 a 90% de confluência.Consulte o protocolo textual para expansão e criopreservação das CIPs para diferenciação das CIPs em uma cultura de linhagem neuronal. As células em placas revestidas com laminina. Como antes, troque o meio para o meio de diferenciação neuronal quando as células estiverem com aproximadamente 70% de confluência e continue trocando o meio a cada dois dias durante três semanas.Não divida as células durante a diferenciação após três semanas; as células devem expressar o marcador neuronal TUJ1 para obter neurônios mais maduros e subtipos neuronais. Continue a diferenciação por até três meses para a diferenciação de CIPs, especificamente em direção a uma linhagem glial. Troque o meio para meio de indução glial, contendo 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico para induzir a diferenciação em células precursoras gliais.Remova metade do meio e substitua por meio fresco a cada dois dias durante cerca de duas semanas. Durante este período, as células devem ser repicadas na proporção de um para três na presença de inibidor de R quinase 10 micromolar quando atingirem 100% de confluência após duas semanas. Diferencie as células ainda mais em astrócitos trocando o meio por meio para astrócitos disponível comercialmente quando as células estiverem quase confluentes e continuando a trocar o meio a cada dois dias; aproximadamente sete dias depois, as células começam a expressar marcadores de astrócitos.Se as células atingirem confluência de 100% durante o protocolo de diferenciação, divida-as numa proporção de um para dois. Na presença de inibidor de cinase RO a 10 micromolar, a infecção dos fibroblastos com os vírus T4KLF4, SOX2 e cMyc Senda resultou em alteração da morfologia dos fibroblastos e subsequente surgimento de colônias. Dezessete dias após a infecção, linhagens celulares monoclonais podem ser expandidas e apresentam coloração positiva para marcadores de células-tronco neurais, como SOX2, SOX1, nestina e PAX6, bem como para o marcador de proliferação Ki-67, enquanto não expressam o marcador associado à pluripotência T4.Além disso, pela adição de fatores de crescimento neurais ao meio de cultura celular, as células progenitoras neurais podem ser diferenciadas em neurônios mediante a aplicação de uma diferenciação em astrócitos. Linhagens celulares de progenitores neurais induzidas também podem ser diferenciadas em linhagens gliais, conforme avaliado pela análise de mudanças morfológicas típicas e coloração contra GFAP. Por meio dessa conversão direta, geramos células progenitoras neurais induzidas multipotentes a partir de fibroblastos de pacientes em três a quatro semanas.Essas células podem ser usadas para inúmeras aplicações biomédicas. As implicações dessa técnica estendem-se à terapia, diagnóstico e modelagem de doenças neurodegenerativas como Alzheimer e doença de Parkinson, bem como outras condições neurológicas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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