Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

O objetivo geral deste procedimento é encurtar a abordagem clássica do Yamanaka IPS, gerando diretamente células progenitoras neurais induzidas a partir da biópsia de pele de um paciente para aplicações terapêuticas. Isso é feito realizando primeiro uma biópsia por punção do paciente para derivar células primárias de fibroblastos que podem ser cultivadas in vitro. O segundo passo é expandir e subsequentemente infectar fibroblastos cultivados com vírus que codificam fatores de reprogramação para induzir a diferenciação trans.

Em seguida, a suposta célula progenitora neural induzida convertida ou colônias INPC devem ser cuidadosamente selecionadas por validação visual e posteriormente isoladas por coleta manual aproximadamente 20 dias após a infecção. A etapa final é monoclonal, expandir os IPCs em meio de neuroindução, em última análise, direcionar a diferenciação in vitro, bem como a microscopia de imunofluorescência é usada para mostrar que os pacientes possuem IPCs convertidos diretamente são capazes de se diferenciar em células neuronais e gliais, tornando-os uma fonte virtualmente ilimitada para aplicações biomédicas. A vantagem dessa técnica de conversão direta sobre os métodos existentes, como a derivação do tipo Yamanaka de células-tronco potentes azuis induzidas e sua subsequente diferenciação, é dupla.

A conversão de DI em células-tronco neuro induzidas multipotentes, que chamamos de células INS, não é apenas consideravelmente mais rápida, mas também mais segura. Assim, o procedimento de transdiferenciação tornará muito mais viável produzir células específicas do paciente para aplicações terapêuticas e colher um risco dramaticamente menor de formação de tumor em comparação com as células IPS. Com isso, agora somos capazes de desmantelar dois grandes obstáculos da taxa regional de medicina hoje em dia.

Isso é segurança e eficiência clínica. Para iniciar a biópsia por punção, desinfete a pele do paciente, anestesiar a pele onde será feita a biópsia com 0,5 a um mililitro de cloridrato de mepivacaína intracutânea. Faça a biópsia de pele usando um punção de biópsia estéril de três milímetros.

Enxágue a biópsia com solução salina tamponada com fosfato dobe echo ou DPBS mais um microlitro por mililitro de gentamicina. Remova a gordura da biópsia usando bisturi e fórceps. Em seguida, enxágue a biópsia mais duas vezes com o tampão antes de aspirá-la completamente.

Cubra a biópsia com descole dois e incube por 16 a 18 horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, aspire completamente a pasta dys antes de lavar a biópsia duas vezes com DPBS. Remova a epiderme com uma pinça e, em seguida, lave a biópsia mais duas vezes com DPBS.

Em seguida, adicione dois mililitros de colagenase tipo dois e transfira para um tubo de 15 mililitros no tubo. Adicione colagenase até cinco mililitros. Incubar o volume total por 45 minutos a 37 graus Celsius.

Centrifugar a amostra durante cinco minutos a 180 vezes G e rejeitar o snat em seguida. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de gentamicina sérica fetal de bezerro DMEM antes de centrifugar novamente por cinco minutos a 180 vezes G. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros do mesmo meio. Em seguida, transfira a amostra para um frasco de cultura de tecidos aderente T 25 e incube a 37 graus Celsius 5%CO2, trocando o meio a cada três dias após aproximadamente duas semanas.

Uma vez que as células estejam confluentes ao redor das partes da pele, divida as células usando tripsina EDTA conforme descrito no protocolo de texto. Expanda ainda mais as células mudando o meio a cada três dias e dividindo quando as células são confluentes. Depois de excluir a contaminação por micoplasma por ensaios padrão, prepare as células para o experimento de conversão direta lavando as células uma vez com DPPS, aspire o DPBS e adicione 2,5 mililitros de tripsina EDTA Depois de incubar as células por cinco minutos a 37 graus Celsius, 5% de CO2, bata suavemente no frasco para separar as células.

Ressuspenda as células em 2,5 mililitros de meio fibroblasto e transfira para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 180 vezes G durante cinco minutos e aspirar o snat. Ressuspenda as células em um mililitro de meio fibroblasto e pipete para cima e para baixo para gerar uma única suspensão celular.

Conte o número de células usando uma câmara de contagem de células antes do revestimento. 30.000 células por poço. Em uma placa de 24 poços, incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius, as etapas de manuseio do vírus a 5% de CO2 devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica com equipamento de segurança pessoal adequado, incluindo uma máscara cirúrgica para evitar a exposição da mucosa.

Para realizar a infecção primeiro, substitua o meio celular existente por 100 microlitros de meio fibroblasto. Em seguida, ressuspenda novamente as alíquotas descongeladas de T quatro, KLF quatro, SOX dois e cmix sendi virus em um mililitro de meio de fibroblasto. Adicione cada vírus em um MOI de três às células e misture suavemente incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de CO2 após 24 horas, aspirar o meio e adicionar 500 microlitros de cultura de meio de neuroindução, as células a 39 graus Celsius, 5% de CO2 a partir de agora, trocando o meio a cada dois dias no sexto dia após a infecção, Prepare placas de seis poços revestidas com laminina.

Adicione um mililitro de um micrograma por mililitro de laminina em DPBS em seis placas de poços e mantenha as placas a quatro graus Celsius por 24 horas no sétimo dia após a infecção, divida as células usando D-P-B-S-E-D-T-A conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 500 microlitros de D-M-E-M-F 12 e transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugue a amostra a 180 vezes G durante cinco minutos.

Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de placa média de neuroindução as células em placas de seis poços revestidas com laminado e adicione o inibidor de RO quinase a uma concentração final de 10 micromolares de cultura. As células a 39 graus Celsius, 5% de CO2, mudando o meio a cada dois dias a partir do dia 14. Após a cultura da infecção, as células a 37 graus Celsius 5% CO2 neuroepiteliais tornam-se aparentes por volta do dia 17 após a infecção, conforme visualizado por microscopia de contraste de fase.

Eles devem ser grandes o suficiente para serem colhidos por volta do dia 20 após a infecção, um dia antes de colher a pelagem 1 48. Placa de poço com laminina conforme descrito no protocolo de texto um dia depois, aspirar laminado das placas e adicionar 200 microlitros de meio de neuroindução aos poços. Lave as seis placas de poço contendo as colônias a serem colhidas uma vez com DPBS antes de adicionar dois mililitros de neuroindução.

Meio por poço de uma placa de seis poços coleta mecanicamente as células raspando as colônias usando uma agulha fina para se livrar das células circundantes e colhendo as colônias usando pontas de pipeta. Montado em uma pipeta de 200 microlitros, o homem ajustou em 50 microlitros. Transfira cada colônia para um poço de uma placa de 48 poços revestida com laminado e gere uma suspensão de célula única mecanicamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes.

Adicionar inibidor de R quinase numa concentração final de 10 micromolares às células. Cultive as células na placa de 48 poços a 37 graus Celsius, 5%CO2 por dois dias. Troque o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80 a 90% de fluência.

Veja o protocolo de texto para expansão e criopreservação dos IPCs para diferenciação de IPCs em direção a uma cultura de linhagem neuronal. As células em placas revestidas com laminado. Como antes, mude o meio para o meio neuro diff quando as células estiverem aproximadamente 70% confluentes e continue a mudar o meio em dias alternados por três semanas.

Não divida as células durante a diferenciação após três semanas, as células devem expressar o marcador neuronal TUJ um para ganhar neurônios mais maduros e subtipos neuronais. Continuar a diferenciação por até três meses para diferenciação de IPCs, especificamente para uma linhagem glial. Mude o meio para meio de indução glial, incluindo 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico para induzir a diferenciação em células precursoras gliais.

Remova metade do meio e substitua por meio novo a cada dois dias por cerca de duas semanas. Durante este período, as células devem ser divididas de um a três na presença de inibidor de quinase R 10 micromolares quando a fluência de 100% de CO for atingida após duas semanas. Diferencie ainda mais as células em astrócitos, mudando o meio para o meio de astrócitos disponível comercialmente quando as células estiverem quase confluentes e, continuando a mudar o meio a cada dois dias, aproximadamente sete dias depois, as células começam a expressar marcadores de astrócitos.

Se as células ficarem 100% confluentes durante o protocolo de diferenciação, divida-as em uma proporção de um para dois. Na presença de 10 micromolares RO quinase, a infecção inibidora dos fibroblastos com os vírus T 4K LF quatro, SOX dois e cmix sendi e cultura em meio neuroindutivo resultou em uma mudança na morfologia dos fibroblastos e subsequente emergência de colônias. 17 dias após a infecção gerada, as linhagens celulares monoclonais podem ser expandidas e coradas positivas para marcadores de células-tronco neurais, como SOX dois, SOX um neston e PAC seis, bem como para o marcador de proliferação KI 67, enquanto não expressam o marcador associado à pluripotência T quatro.

Além disso, pela adição de fatores de crescimento neuronal ao meio de cultura de células, as células progenitoras neurais podem ser diferenciadas em neurônios aplicando uma diferenciação de astrócitos. As linhagens celulares progenitoras neurais induzidas pelo protocolo também podem ser diferenciadas em linhagens gliais, conforme julgado pela análise de alterações morfológicas típicas e coloração contra GFAP. Por essa conversão direta, geramos células neuroprogenitoras induzidas multipotentes a partir de fibroblastos de pacientes dentro de três a quatro semanas.

Essas células podem ser usadas para inúmeras aplicações biomédicas. As implicações dessa técnica se estendem à terapia, diagnóstico e modelagem de distúrbios neurodegenerativos como Alzheimer e Parkinson, bem como outras condições neurológicas.