Name: A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda a detectar bactérias in situ em tecidos de parafina usando sondas de DNA marcadas com digoxigenina direcionadas ao 16S rRNA. Este método de hibridização in situ permite visualizar a localização bacteriana em contextos histológicos preservados.

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Este estudo foi apoiado por uma bolsa (2013R1A1A3005669) da Fundação Nacional da Coreia Investigação e uma subvenção (HI13C0016) do coreano Saúde Tecnologia R &amp; D Projeto, Ministério da Saúde e Bem-Estar.

1. Preparação Probe <ol><li> A amplificação por PCR da sonda <ol><li> Para o P. sonda gingivalis -específica, amplificar um fragmento de DNA 343-bp do P. gingivalis 16S rRNA por PCR utilizando o DNA genómico de P. gingivalis e os seguintes iniciadores: 5&#39;TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 &#39;e 5&#39; AGIR CGT ATC CGT TAT GCC TC-3 &#39;10. Realizar amplificações com as seguintes condições de ciclos: 35 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 1 min 20 seg seguido de uma extensão de 5 min a 72 ° C 10,11. </li><li> Amplificar a sonda eubacterial usando um 70-bp fragmento de DNA (5&#39;-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 &#39;) sintetizado como um oligonucleótido e os seguintes iniciadores: 5&#39;-CTG CAG GTR GGY CMT-3&#39; e 5&#39;-AGG TTG GCG CTC TTG-3 &#39;11. Realizar amplificações com as seguintes condições de ciclos: 40 ciclosa 9 4 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min 20 s, seguido de uma extensão de 5 min a 72 ° C 11,12. </li><li> Precipitar os produtos de PCR (≥500 ul) pela adição de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e etanol a 100% (a uma 10: 1: 2 ratio) e incubação a -20 ° C durante 2 horas. </li><li> Centrífuga-se a mistura a 14000 xg durante 15 min, ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão TE, e medir a concentração de DNA por densidade óptica a 260 nm. </li></ol></li><li> DIG-rotulagem utilizando rotulagem e detecção de DNA kit DIG <ol><li> Misturar 3 ug da sonda com água para um volume final de 15 ul. </li><li> Desnaturar o ADN, a 95 ° C durante 10 min e relaxar rapidamente em gelo. </li><li> Adicionar 2 mL de 10x mistura hexanucleotide, 2 ul de mistura de dNTP a rotulagem, e 1 ul da enzima Klenow para 15 ul do ADN desnaturado. </li><li> Misturar e incubar a 37 ° C durante 24 h a 48 h e parar de reacção por aquecimento a 65 ° C. </li></ol></li><li> Verifique a sensibilidade da sonda marcada com DIG usando um kit de marcação e detecção de ADN DIG <ol><li> Carregar manualmente 1 ml de diluições em série da sonda de controlo positivo fornecido com o kit e 1 ng de sonda marcada com DIG na membrana de nylon e seco durante 5 min à TA. </li><li> Resumidamente mergulhar a membrana no tampão 2 x SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sódio 30 mM, pH 7,0) e incuba-se a membrana a 80 ° C durante 1 h para imobilizar o ADN. </li><li> Resumidamente mergulhar a membrana no tampão de ácido maleico (MAB, 0,1 M de ácido maleico, 0,15 M de NaCl, pH 7,5) e incuba-se com fosfatase alcalina anti-DIG (AP) anticorpo conjugado a diluída (1: 5000) em 6 ml de solução de bloqueio, previsto no kit à TA durante 30 min. </li><li> Lava-se a membrana com MABT (MAB contendo 1% de Tween 20) e aplicam-se 40 ul da solução de NBT / BCIP misturado com tampão de detecção de 2 ml (0,1 M de Tris-HCl, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, pH 9,5) para o membrana durante 1 min. Se a sensibilidade da sonda marcada énão satisfatória, repita os passos a partir de 1.1.3 para 1.3.4. </li><li> Medir a concentração de DNA da sonda marcada (DO260) e ajustar a concentração de 100 ng mL -1. </li></ol></li><li> Verifique a especificidade da sonda marcada com DIG <ol><li> Desnaturar amostras de ADN genómico (25 ng de 3 ul -1 por cada amostra) a partir de várias espécies bacterianas, incluindo a bactéria alvo da sonda específica, a 95 ° C durante 10 min e relaxar rapidamente em gelo. </li><li> Carregar manualmente o ADN desnaturado na membrana de nylon e seco durante 20 min à TA. </li><li> Resumidamente mergulhar a membrana no tampão 2 x SSC e incubar a membrana a 80 ° C durante 2 horas para imobilizar o ADN. </li><li> Bloquear a membrana com uma solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Dilui-se a sonda a 1 ng mL -1 em tampão de hibridação, desnaturar as sondas diluído, e aplicam-se sobre a membrana. </li><li> Incubar a membrana a 45 ° C durante 1 h. </li><li> Lava-se a membrana trêsvezes com tampão 2 x SSC. </li><li> Resumidamente mergulhar a membrana no MAB. </li><li> Incubar com anticorpo anti-DIG-AP conjugado diluído (1: 2000) em 6 ml de solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lava-se a membrana com MABT e aplicar 40 ul da solução de NBT / BCIP misturado com tampão de detecção de 2 ml. </li><li> Quando a sonda não conseguir a especificidade esperada, aumentar a temperatura até que a especificidade de hibridação é observado. </li></ol></li></ol> 2. Hibridação In Situ Nota: Para evitar a secagem das amostras e reagentes, execute todas as incubações em câmara úmida forrada com papel-toalha molhada. <ol><li> De-parafinização e re-hidratação de secções de tecido <ol><li> Prepare a 4 mm de espessura secções de tecido a partir de blocos embebidos em parafina. Formalina, paraformaldeído, e fixador à base de zinco são compatíveis com este protocolo. </li><li> Prepare todos os reagentes que utilizam água tratada com DEPC. </li><li> Lâminas de calor num forno seco a 60 ° C durante 30 min e incubar à TA durante 30 min. </li><li> Imergir as lâminas em 100% de xileno durante 5 minutos três vezes; use xileno fresco cada vez. Nota: Faça isto procedimento de depilação de em um exaustor química. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min, duas vezes, com etanol fresco de cada vez, e re-hidratar as amostras em série de 90%, 80% e soluções de etanol a 70% durante 5 min cada. </li><li> Imergir as lâminas em água tratada com DEPC para 1 min e lavagem das lâminas em PBS tratado com DEPC (pH 7,4) durante 6 min. </li></ol></li><li> Os pré-tratamentos de cortes de tecido <ol><li> Imergir as lâminas em ácido clorídrico 0,1 N durante 20 minutos e lavagem das lâminas em água tratada com DEPC para 30 seg. </li><li> Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor espécimes usando uma caneta cera. Nota: O tamanho da barreira hidrofóbica depende do tamanho das amostras. Por conseguinte, os volumes de reagentes utilizados nos passos seguintes variam dependendo do tamanho das amostras, mas tem que preencher o HYdrophobic barreira (50 ul para pequenas amostras e 400 ul para grandes amostras). </li><li> Tratar as amostras com 50 a 400 ul de proteinase K (1 a 10 ug ml -1 em PBS tratado com DEPC) num forno seco a 37 ° C durante 30 minutos e lavagem das lâminas em tratada com DEPC 1x PBS durante 1 min. </li><li> Soak lâminas em paraformaldeído a 4% em PBS tratado com DEPC durante 10 min, em seguida, lavagem das lâminas em PBS tratado com DEPC a 1 min. </li><li> Soak lâminas em trietanolamina 0,1 M-HCl (pH 8,0) contendo 0,5% de anidrido acético durante 20 minutos e lavagem das lâminas em água tratada com DEPC para 30 seg. </li></ol></li><li> A hibridação com sonda e lavagem <ol><li> Imergir as lâminas em tampão SSC 2x para 20 min. </li><li> Dilui-se a sonda a 1 ng mL -1 em tampão de hibridação (SSC 4x, 50% [vol / vol] formamida, solução de Denhardt 1x, 10% [peso / vol] de sulfato de dextrano, 0,1% [peso / vol] de sulfato de dodecilo de sódio, 0,4 mg ml -1 de DNA de esperma de salmão). Para controlos negativos, misturar com a sonda marcadauma quantidade em excesso de 10 vezes de sonda não marcada. </li><li> Desnaturar as sondas diluído e aplicam 50 a 400 ul para as secções de tecido. Coloque uma lamela sobre a lâmina e selar com unha polonês. </li><li> Lâminas de calor na máquina de PCR a 90 ° C durante 10 min e incubar em uma câmara humidificada O / N a 45 ° C ou à temperatura óptima determinada no passo 1.4.11. </li><li> Arrefecer as lâminas a 4 ° C durante 30 min, remover lamelas, e mergulhar as lâminas num tampão SSC série como seguintes: 4x SSC durante 10 min, pré-aquecido (45 ° C) 2x SSC durante 20 min, 2 x SSC durante 10 min, e 0,2x SSC durante 10 min. </li></ol></li><li> A detecção com anticorpo anti-DIG-AP conjugado <ol><li> Lavar as lâminas em MABT por 5 min. </li><li> Bloco com 50 a 400 uL de solução com 1% de Tween 20 de bloqueio durante 20 minutos. </li><li> Adicionar 50 a 400 ul de anticorpo anti-DIG-AP diluídos em solução (1: 1000) de bloqueio anld incubar a 37 ° C durante 90 min. </li><li> Lavar as lâminas em MABT para 10 min. </li> &lt;li&gt; Imergir as lâminas em tampão de detecção contendo 1% de Tween 20 durante 5 min. </li><li> Trata-se com 50 a 400 μ de levamisol 1 mM (em tampão de detecção contendo 1% de Tween 20) durante 5 min, para inactivar a fosfatase alcalina endógena. </li><li> Distribuir 50 a 400 ul da solução pré-misturada de NBT / BCIP (diluída em tampão de detecção a 1: 100) para cada amostra e incubar numa câmara humidificada à temperatura ambiente durante 2 a 3 horas até que o sinal desenvolvido é satisfatória. </li><li> Lavar as lâminas com água desionizada para parar a visualização e aplicam 50 a 400 pi de 0,05% [peso / vol] verde de metilo como um contador de manchas a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Lavar as lâminas com água desionizada, desidratar em 100% de etanol, e mergulhar em xileno. </li><li> Aplicar 80 ml de solução de montagem em cada slide e cobrir com lamelas. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+human+gingiva.+II.+The+lower+part+of+the+pocket+epithelium+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis.</a> J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).</li>
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<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis.+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
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<li>Abrams, K., Caton, J., Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+comparisons+of+interproximal+gingival+tissues+related+to+the+presence+or+absence+of+bleeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding.</a> J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Porphyromonas+gingivalis.+and+plasma+cell+dominance+in+gingival+tissues+with+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis.</a> Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis.+and+dextran+sodium+sulfate+induce+periodontitis+through+the+disruption+of+physical+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers.</a> Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bacterial+invasion+and+differential+expression+of+tight+junction+proteins%2C+growth+factors%2C+and+growth+factor+receptors+in+periodontal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions.</a> J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).</li>
<li>Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).</li>
<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui um protocolo para localizar bactérias dentro dos tecidos embebidos em parafina, utilizando uma sonda de DNA marcada com DIG tem sido descrita. A sonda tem como alvo as moléculas de ADN ou ARN do gene 16S do rRNA bacteriano, e as sondas de rRNA 16S-alvo pode ser concebido como uma ou outra espécie específica, ou universal. A hibridação específica da P. gingivalis especï¿½ico sonda para P. gingivalis, mas não a outras bactérias orais tem sido mostrado previamente 10. Em contraste, a sonda...

As bactérias desempenham um papel na etiologia de diversas doenças orais, tais como periodontite, pulpite, pericoronite, celulite, osteomielite e. A fim de compreender o papel das bactérias na patogénese da doença e para monitorizar o efeito de tratamentos, localização de bactérias dentro do tecido é importante. A presença de bactérias no interior do tecido gengival a partir de pacientes com periodontite foi demonstrado usando vários métodos, incluindo microscopia electrónica de 1,2, imuno-histoquímica e imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para cada bactéria 3-7, e hibridação in situ fluorescente (FISH) 8 utilizando um fluorescence- sonda oligonucleotídica marcada segmentação 16S rRNA. No entanto, estes métodos não são amplamente utilizados devido a limitações técnicas ou dificuldades. Comparado com os anticorpos, as sondas alvo rRNA 16S são fáceis de produzir e alcançar espécie-especificidade. FISH tem provado ser uma excelente ferramenta para a visualização de bactériaeria em seus ambientes naturais, como biofilme placa. No entanto, a aplicação de FISH para amostras de tecidos é limitado devido a autofluorescência de vários componentes do tecido. Por exemplo, o forte autofluorescência das células vermelhas do sangue, muitas vezes dificulta a aplicação da tecnologia de fluorescência para tecidos inflamados quando elas envolvem sangramento 9. De forma a localizar as bactérias dentro dos tecidos gengivais inflamadas, por conseguinte, um método de hibridação in situ, utilizando uma digoxigenina (DIG) sonda de DNA marcado com foi desenvolvido e aplicado com sucesso 10,11. Aqui, um protocolo detalhado para a localização de bactérias no interior de tecidos embebidos em parafina, utilizando P. gingivalis sondas eubacterianas especï¿½icos e universais tem sido descrita. É particularmente focado na padronização do método de modo que resultados semelhantes podem ser reproduzidos em outros laboratórios. Este protocolo permite a localização de bactérias dentro de seu contexto histológica e do results são altamente reprodutível. O protocolo descrito pode ser utilizado para localizar bactérias ou de uma forma específica para a espécie ou universal em diversos tecidos. A sonda universal é especialmente útil para detectar bactérias em doenças polimicrobianas e para estudar o potencial papel da bactéria, em doenças em que o papel de bactérias específicas que não é conhecido.

<table><tbody><tr><td>Anidrido acético</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50% solução de sulfato de dextrano</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt ' s solução</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG kit de marcação e detecção de DNA</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&trade; Caneta</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Vector</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Metil verde</td><td>Sigma</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Solução de DNA de esperma de salmão</td><td>Invitrogen</td> <td># 15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Duksan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina-HCl</td><td>Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Orgânicos de pesquisa</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

a detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados usando um marcado com digoxina dna probe segmentação 16s rrna

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

A presença de bactérias no epitélio da bolsa e no tecido conjuntivo subjacente em biópsias gengivais de pacientes com periodontite foi relatada usando vários métodos, incluindo microscopia eletrônica, imuno-histoquímica ou imunofluorescência usando anticorpos específicos para bactérias e hibridização in situ fluorescente (FISH) usando uma sonda de oligonucleotídeo marcada com fluorescência. No entanto, esses métodos não são amplamente utilizados devido a limitações ou dificuldades técnicas. Aqui, foi introduzido um método para localizar bactérias em tecidos embebidos em parafina usando sondas de DNA marcadas com DIG. Os tecidos embebidos em parafina são a forma mais comum de tecidos de biópsia disponíveis nos bancos de patologia. As bactérias podem ser detectadas de maneira específica ou universal da espécie. Os sinais bacterianos são detectados como formas discretas (coco, bastonete, fusiforme e forma pilosa) de bactérias ou formas dispersas. A técnica permite obter outras informações histológicas: o epitélio, o tecido conjuntivo, os infiltrados inflamatórios e os vasos sanguíneos são bem distinguidos. Este método pode ser usado para estudar o papel das bactérias em várias doenças, como periodontite, câncer e doenças imunológicas inflamatórias.

A Figura 1 mostra dot blot de sondas marcada com DIG em comparação com a sonda de controlo positivo fornecido com o kit para determinar a sua sensibilidade. A 343 pb P. sonda especï¿½ico gingivalis é de 25 vezes mais sensível do que a sonda eubacteriana 70 pb. A Figura 2 mostra a hibridização in situ de tecidos gengivais obtidos a partir de pacientes com periodontite crónica para a detecção de P. gingivalis e eubactérias. Os sinais bacterianos, mostra...

Aqui, foi descrito um método para localizar bactérias em tecidos embebidos em parafina usando sondas de DNA direcionadas a rRNA 16S marcadas com DIG. Este protocolo pode ser aplicado para estudar o papel das bactérias em várias doenças, como periodontite, câncer e doenças imunológicas inflamatórias.

A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

O objetivo geral deste procedimento é localizar bactérias em tecidos emblocados em parafina utilizando sondas de DNA marcadas com DIG direcionadas ao RNA ribossomal 16 s. Isso é realizado primeiramente pela preparação da sonda com amplificação por PCR e marcação com DIG. O segundo passo consiste em preparar as seções de tecido para que tenham sítios-alvo mais acessíveis e menor ligação de fundo.Em seguida, as seções de tecido preparadas são hibridizadas com a sonda marcada com dig. Por fim, a sonda hibridizada é detectada com anticorpos anti-Dig marcados com fosfatase alcalina. Em última análise, este método de hibridização in situ pode demonstrar a presença de bactérias em tecidos emblocados em parafina.A vantagem do domínio deste método em relação a técnicas existentes, como a ING, é que este pode detectar bactérias SHS no contexto de certas estruturas histológicas. Este método pode fornecer informações sobre a patogênese, mas também envolve várias condições inflamatórias, como a periodontite e o R planet. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de preparação do tecido e digestão por hibridação são difíceis de executar, porque as seções de tecido são facilmente danificadas.Para produzir a sonda para bactérias U, utilize um fragmento de DNA de 70 pares de bases como molde e dois primers de 15 pares de bases para amplificar a sonda por PCR. Colete o amplicon em tampão com concentração conhecida. Em seguida, marque a sonda com um kit de marcação e detecção de DNA dig.Primeiro, misture três microgramas da sonda em 15 microlitros de água. Desnature a sonda no bloco térmico por 10 minutos a 95 graus Celsius. Em seguida, coloque a sonda desnaturada em gelo.Em seguida, adicione dois microlitros de nucleotídeos 10 XH, dois microlitros de DN NTPs e um microlitro de enzima canal. Após a mistura, deixe a sonda incubar a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas. Interrompa a reação aquecendo a mistura a 65 graus Celsius.Em seguida, meça a concentração de DNA da sonda marcada em 260 nanômetros e ajuste a concentração para 100 nanogramas por microlitro. Utilizando o kit, verifique primeiro a sensibilidade da sonda em uma membrana de náilon, aplicando um microlitro do controle positivo diluído em série. Sonda e sonda digoxigenina-marcada.Deixe a membrana secar por cinco minutos. Após a secagem, mergulhe brevemente a membrana em 2XSSC e, em seguida, transfira-a para uma incubadora a 80 graus Celsius por uma hora. Para imobilizar o DNA após a incubação, embeba brevemente a membrana em tampão de ácido málico, depois transfira-a para o tampão de bloqueio concentrado com anticorpos conjugados à fosfatase alcalina em uma diluição de um para 5.000 após meia hora.Lave a membrana em MABT. Em seguida, misture 40 microlitros de N-B-T-B-C-I-P em dois mililitros de tampão de detecção. E após a incubação, adicione esta mistura à membrana por um minuto.Após remover a parafina e reidratar as seções de tecido conforme descrito no protocolo textual, prepare-as para hibridização in situ imersão primeiro as lâminas em ácido clorídrico 0,1 normal por 20 minutos. Após o banho ácido, lave as lâminas com água tratada com DEPC por 30 segundos. Em seguida, usando uma caneta de cera, delimite os espécimes em cada lâmina.Em seguida, adicione de 50 a 400 microlitros de solução de proteinase K às amostras, dependendo do seu tamanho. Deixe a enzima atuar por 30 minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, lave as lâminas em PBS 1X tratado com DEPC por um minuto. Agora, transfira as lâminas para paraformaldeído a 4% em PBS tratado com DEPC por 10 minutos.Lave o fixador com PBS como antes. Em seguida, mergulhe as lâminas em cloreto de trietanolamina 0,1 molar, pH 8, com ácido acético e hidreto a 0,5% após 20 minutos, e lave as lâminas com água limpa como antes. Agora, inicie a hibridização em C2 imergindo primeiro as lâminas em 2XSSC por 20 minutos.Enquanto isso, dilua a sonda marcada a um nanograma por microlitro em tampão de hibridização para um controle negativo. Use 10 vezes a concentração da sonda não marcada. Em seguida, desnature as sondas aquecendo-as a 90 graus Celsius por 10 minutos, seguido de resfriamento rápido em gelo.Em seguida, aplique em cada lâmina o mesmo volume da diluição da sonda que foi previamente aplicado de proteinase K. Então, cubra cuidadosamente com lamínula e feche as seções usando esmalte. Agora, aqueça as lâminas em um bloco de máquina de PCR a 90 graus Celsius por 10 minutos e transfira-as para uma incubadora úmida a 45 graus Celsius durante a noite no dia seguinte.Resfrie as lâminas a quatro graus Celsius por meia hora e, em seguida, remova cuidadosamente as lamínulas. Os tecidos são frágeis. Por fim, passe as lâminas por uma série de tampão SSC à temperatura ambiente.Primeiro, lave as duas lâminas hibridizadas NC por cinco minutos em MABT. Em seguida, aplique de 50 a 400 microlitros de solução bloqueadora com 1% de tween 20 por 20 minutos. Após a incubação com a solução bloqueadora, aplique de 50 a 400 microlitros de anticorpo anti-D dig fosfatase alcalina na proporção de um para 1000 em solução bloqueadora.Deixe incubar por 90 minutos a 37 graus Celsius após a aplicação do anticorpo primário. Lave as lâminas em MABT por 10 minutos. Em seguida, coloque as lâminas no tampão de detecção com 1% de tween 20 por cinco minutos.Aplique agora 50 a 400 microlitros de oleína um milimolar em solução tampão de detecção a cada lâmina e incube-as por cinco minutos para inativar a fosfatase alcalina endógena. Em seguida, adicione 50 a 400 microlitros de N-B-T-B-C-I-P diluído no tampão de detecção na proporção de um para 100 a cada lâmina e deixe as lâminas incubarem por duas a três horas em uma câmara umidificada, conforme a experiência.Lave as lâminas com água DI, depois aplique verde metila a 0,05% peso por volume e deixe a coloração de contraste atuar no tecido por 10 minutos, a 37 graus Celsius. Lave novamente as lâminas com água DI e, em seguida, desidrate-as com etanol a 100%, seguido por uma imersão em xilol.Por fim, aplique 80 microlitros de meio de montagem e cubra com lamínula. Os lâminas após os sondas foram marcadas com dig. Sua sensibilidade foi comparada à diluição da sonda controle positivo.A sonda específica de 343 pares de bases para P. gingivalis foi 25 vezes mais sensível do que a sonda bacteriana projetada de 70 pares de bases. As duas sondas foram então aplicadas a tecidos gengivais de pacientes com periodontite crônica em alta magnificação. As diversas formas de bactérias foram discerníveis utilizando a sonda bacteriana.Embora a sonda específica para P. gingivalis tenha detectado apenas bactérias em forma de bastonete, um agente químico disruptor das junções apertadas, DSS, foi aplicado na mucosa gengival de camundongos. Amostras de tecido desses animais foram utilizadas para comparar as sondas em um contexto diferente. Neste caso, a sonda bacteriana U foi capaz de detectar as bactérias que a outra sonda não detectou.A sonda bacteriana U foi posteriormente testada quanto à sua capacidade de detectar outras bactérias em cortes de tecido pulmonar contendo tumores. Bactérias foram detectadas fora do tumor, bem como dentro do tumor. Ao examinar tecidos de pacientes com líquen plano oral, uma doença de etiologia desconhecida, a sonda bacteriana detectou sinais bacterianos dentro das células do epitélio e da lâmina própria, onde foi observada infiltração inflamatória.Desde o seu desenvolvimento, esta técnica tem auxiliado pesquisadores na área de doenças infecciosas a explorar a invasão bacteriana em tecidos tanto em humanos quanto em animais seguindo este procedimento. Outros métodos, como a detecção imunoquímica do crescimento de marcadores celulares, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como que tipo de células abrigam as bactérias dentro dos tecidos.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA (Vídeo) | JoVE Journal

A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA

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