A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA

O objetivo geral deste procedimento é localizar bactérias dentro de tecidos embebidos em parafina usando RNA ribossômico 16 s marcado com DIG, visando sondas de DNA. Isso é feito preparando primeiro a sonda com amplificação por PCR e marcação DIG. O segundo passo é preparar as seções de tecido para ter locais-alvo mais acessíveis e menos ligação de fundo.

Em seguida, as seções de tecido preparadas são hibridizadas com a sonda marcada com escavação. Finalmente, a sonda hibridizada é detectada com fosfatase alcalina, marcada com anticorpos anti-D dig. Em última análise, este método de hibridização em C dois pode mostrar a presença de bactérias com tecidos embebidos em parafina.

A vantagem de domínio dessa detecção sobre o método existente, como o ING, é que esse método pode detectar bactérias SHS no contexto de algumas estruturas histológicas. Este método pode fornecer informações sobre a patogênese, mas vários inflamatórios, como periodontite e planeta R. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de preparação do tecido e digestão híbrida são difíceis de executar porque as seções do tecido são facilmente danificadas.

Para fazer a sonda de bactérias U, use um fragmento de DNA de 70 pares de bases como molde e dois primers de 15 pares de bases para amplificar a sonda por PCR. Colete o amplicon em buffer em uma concentração conhecida. Em seguida, rotule a sonda com um kit de marcação e detecção de DNA de escavação.

Primeiro misture três microgramas da sonda em 15 microlitros de água. Desnature a sonda no bloco de calor por 10 minutos a 95 graus Celsius. Em seguida, coloque a sonda desnaturada no gelo.

Em seguida, adicione dois microlitros de 10 nucleotídeos XH, dois microlitros de DN NTPs e um microlitro de enzima de canal. Uma vez misturada, deixe a sonda incubar a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas depois. Pare a reação aquecendo a mistura a 65 graus Celsius.

Em seguida, meça a concentração de DNA da sonda marcada em 260 nanômetros e ajuste uma concentração para 100 nanogramas por microlitro. Usando o kit, verifique a sensibilidade das sondas primeiro em uma carga de membrana de náilon de um microlitro de controle positivo diluído em série. Sonda e sonda rotulada de escavação.

Deixe a membrana secar por cinco minutos. Depois de seca, mergulhe brevemente a membrana em dois XSSC e transfira-a para uma incubadora de 80 graus Celsius por uma hora. Para imobilizar o DNA após a incubação, mergulhe brevemente a membrana em tampão de ácido maleico e, em seguida, transfira-o para um tampão de bloqueio concentrado com anticorpos conjugados AP em uma diluição de um a 5.000 após meia hora.

Lave a membrana em MABT. Em seguida, misture 40 microlitros de N-B-T-B-C-I-P em dois mililitros de tampão de detecção. E após o banho, adicione esta mistura à membrana por um minuto.

Depois de remover a parafina e reidratar as seções de tecido conforme descrito no protocolo de texto, prepare-as para em C duas hibridização primeiro mergulhe as lâminas em ácido clorídrico normal 0,1 por 20 minutos. Após o banho de ácido, lave as lâminas com água tratada com DEPC por 30 segundos. Em seguida, usando uma caneta de cera, contorne os espécimes em cada lâmina.

Em seguida, adicione 50 a 400 microlitros de solução de proteinase K às amostras, dependendo do tamanho. Deixe a enzima agir por 30 minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, lave as lâminas em um XPBS tratado com DEPC por um minuto. Agora transfira as lâminas para aldeído paraforme a 4% em PBS tratado com DEPC por 10 minutos.

Lave o fixador com PBS como antes. Em seguida, banhe as lâminas em cloridrato de trietanolamina 0,1 molar em pH oito com 0,5% acético e hidreto após 20 minutos, lave as lâminas com água limpa como antes. Agora comece o em C dois imergindo primeiro os slides em dois XSSC por 20 minutos.

Enquanto isso, dilua a sonda marcada para um nanograma por microlitro em tampão de hibridização para um controle negativo. Use 10 vezes a concentração da sonda de sonda não marcada. Em seguida, desnature as sondas aquecendo-as a 90 graus Celsius por 10 minutos, seguido de resfriá-las rapidamente no gelo.

Em seguida, aplique o mesmo volume de diluição da sonda em cada lâmina que a proteinase K que havia sido aplicada anteriormente. Em seguida, cubra cuidadosamente as seções de deslizamento e sele com esmalte. Agora, aqueça as lâminas em um bloco de máquina de PCR a 90 graus Celsius por 10 minutos e transfira-as para uma incubadora umidificada a 45 graus Celsius durante a noite no dia seguinte.

Resfrie as lâminas a quatro graus Celsius por meia hora e, em seguida, remova cuidadosamente as lamínulas. Os tecidos são frágeis. Por fim, passe as lâminas por uma série de tampão SSC à temperatura ambiente.

Primeiro, lave as duas lâminas hibridizadas NC por cinco minutos em MABT. Em seguida, aplique 50 a 400 microlitros de solução de bloqueio em 1% entre 20 por 20 minutos. Após a incubação do bloco, aplique 50 a 400 microlitros de um a 1000 anticorpo anti-D anti-D fosfatase alcalina e solução de bloqueio.

Deixe ligar por 90 minutos a 37 graus Celsius após a aplicação do primário. Lave as lâminas em MABT por 10 minutos. Em seguida, por cinco minutos, coloque as lâminas no tampão de detecção com 1% entre 20.

Agora aplique 50 a 400 microlitros de um ole milimolar em solução tampão de detecção em cada lâmina e incube-os por cinco minutos para inativar a fosfatase alcalina endógena. Em seguida, adicione 50 a 400 microlitros de N-B-T-B-C-I-P diluído na detecção. Buffer de um a 100 para cada lâmina e deixe as lâminas incubarem por duas a três horas em uma câmara umidificada com base na experiência.

Enxágue as lâminas com água DI, aplique verde de metila a 0,05% de peso em volume e deixe a contra-coloração agir no tecido por 10 minutos. A 37 graus Celsius. Lave as lâminas com água DI novamente e desidrate-as com etanol 100%, seguido de um mergulho em xileno.

Por fim, aplique 80 microlitros de mídia de montagem e lamínula. As lâminas após as sondas foram rotuladas. Sua sensibilidade foi comparada à diluição da sonda de controle positivo.

A sonda específica de 3 43 pares de bases p gengivalis foi 25 vezes mais sensível do que a sonda de bactérias de 70 pares de bases projetada. As duas sondas foram então aplicadas aos tecidos gengivais de pacientes com periodontite crônica em alta ampliação. As várias formas de bactérias eram discerníveis usando a sonda de bactérias.

Enquanto a sonda específica p gengivalis detectou apenas bactérias em forma de bastonete, um DSS químico disruptor de junção apertada foi aplicado na mucosa gengival de camundongos. Amostras de tecido desses camundongos foram usadas para comparar as sondas em um contexto diferente. Aqui, a sonda bacteriana U foi capaz de detectar as bactérias que a outra não conseguiu.

A sonda de bactérias U foi testada em seguida quanto à sua capacidade de detectar outras bactérias em seções de tecido pulmonar contendo tumores. As bactérias foram detectadas fora do tumor, bem como dentro do tumor. Ao examinar tecidos de pacientes com líquen plano oral, uma doença de etiologia desconhecida, a sonda de bactérias detectou sinais bacterianos dentro das células do epitélio e da lâmina própria, onde foi observada infiltração inflamatória.

Desde o seu desenvolvimento, esta técnica tem ajudado o pesquisador na área de doenças infecciosas a explorar a invasão de bactérias em tecidos em humanos e animais após este procedimento. Outros métodos, como o crescimento da detecção imunoquímica para o marcador celular, podem ser ED para responder a perguntas adicionais, como que tipo de células abrigam as bactérias nos tecidos.