Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de Escherichia coli Para engenharia de tecidos da pele

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar as etapas envolvidas na construção e produção de proteínas ECM artificiais ou A ECM contendo repetições semelhantes à elastina. Isso é feito primeiro construindo genes recombinantes que codificam as proteínas A ECM. Em seguida, os genes recombinantes são inseridos em hospedeiros bacterianos.

Neste ponto, as proteínas recombinantes são expressas nos hospedeiros bacterianos e, em seguida, colhidas após a extração de proteínas por lise celular. A etapa final é purificar as proteínas usando o ciclo de transição inversa ou ITC, que explora o comportamento único de transição de fase da elastina. Como polipeptídeos.

Os ciclos de centrifugação são feitos a quatro graus Celsius e 37 graus Celsius. Em última análise, as técnicas de eletroforese em gel e western blot são usadas para identificar as proteínas recombinantes e determinar suas purezas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como colunas de afinidade, é que podemos extrair grandes quantidades de proteínas de forma relativamente barata.

Comece este procedimento com todo o design do ligamento, conforme descrito no protocolo de texto. Uma vez obtidos os oligômeros, anil os oligômeros de DNA para obter a sequência gênica desejada. Primeiro dissolva os oligonucleotídeos de DNA no tampão oligo de DNA até uma concentração final de um micrograma por microlitro.

Adicione quatro microlitros de cada ligamento a 32 microlitros de DNA e tampão ajoelhado para obter uma mistura total de 40 microlitros. Em seguida, ferva um copo de água com uma placa quente e mergulhe a mistura durante cinco minutos. A 95 graus Celsius, remova o béquer e resfrie gradualmente toda a configuração em uma caixa de isopor durante a noite, os oligômeros já estão ajoelhados e prontos para a digestão.

Adicione as enzimas de restrição correspondentes para digerir os oligômeros de al e os vetores hospedeiros separadamente, conforme descrito no texto Protocolo Digerir por três a quatro horas a 37 graus Celsius. Depois de executar os produtos da digestão em um gel de agarose e purificar o DNA, combine o gene de interesse sequencialmente ligando a inserção de DNA digerido no vetor plasmídico com T quatro ligase. Usando a receita encontrada no protocolo de texto, incube a mistura de ligadura em temperatura ambiente por duas horas.

Em seguida, transforme as células usando choque térmico por Ali. Citando 50 microlitros de células competentes em tubos de microcentrífuga pré-resfriados limpos. Pipete cinco microlitros da mistura de ligadura nas células, pipetando suavemente para cima e para baixo para misturar.

Deixe a mistura no gelo por 20 minutos. Em seguida, mergulhe o tubo de microcentrífuga contendo a mistura de células em banho-maria a 42 graus Celsius por dois minutos e retorne ao gelo por dois minutos. Adicione 500 microlitros de meio SOC no tubo da microcentrífuga e incube a 37 graus Celsius com agitação por uma hora.

Após a incubação, espalhe 50 a 500 microlitros da mistura de ligadura celular em uma placa de trado YT duas vezes contendo ampicilina que foi pré-aquecida à temperatura ambiente. Incube as placas de cabeça para baixo a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, pegue as colônias de DNA da placa helicoidal usando pontas de pipeta limpas.

Cultive as colônias em cinco mililitros de duas vezes. Meio YT contendo ampicilina durante a noite a 37 graus Celsius durante a noite com agitação no dia seguinte. Use um kit de isolamento de plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante para extrair os plasmídeos de DNA para cada colônia.

Escolhido eluir, o DNA com 50 microlitros de água após a transformação do plasmídeo recombinante no hospedeiro de expressão bacteriana conforme descrito no protocolo de texto. Escolha uma colônia da placa de trado transformada com um inoculante de ponta de pipeta. 10 mililitros de caldo estéril e fantástico ou meio de TB contendo antibióticos ampicilina e cloranfenicol em um tubo de ensaio.

Incube esta cultura inicial a 37 graus Celsius durante a noite com agitação a 225 RPM. Em seguida, transfira 10 mililitros da cultura inicial para um litro de meio de TB fresco e estéril. Suplementado com os mesmos antibióticos em um frasco de três litros erlin Meyer.

Incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação a 225 RRP M por duas a três horas. Observe a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros ou OD 600 para confirmar que atingiu 0,6 a 0,8 pipetando um mililitro de cultura em um veterinário Q vazio para leitura. Em seguida, induzir a cultura com IPTG a uma concentração final de um milimolar e incubar a 37 graus Celsius com agitação a 225 RPM por mais quatro horas.

Colha as células transferindo a cultura para uma centrífuga de um litro, garrafas e centrifugando a 12.000 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, pesar os grânulos celulares e ressuspender em tampão 10 a 0,5 gramas por mililitro. Congele a cultura de células ressuspensa a 80 graus Celsius negativos durante a noite.

No dia seguinte, descongele a cultura de células congeladas em banho-maria à temperatura ambiente ou no gelo. A L as células adicionam desoxi ribonuclease, uma ribonuclease a e fenil metil suen fluoreto. Enquanto descongela a solução, homogeneizar a solução com agitação lenta.

Depois que todas as células ressuspensas forem descongeladas, ajuste a solução para pH 9,0 para aumentar a solubilidade da proteína em água com muito cuidado. Adicionando seis N hidróxido de sódio gota a gota com agitação no gelo para obter uma consistência homogênea. Em seguida, piolhos as células por interrupção ultrassônica por 20 minutos no gelo, usando uma ponta plana de dois milímetros de diâmetro e um pulso de cinco segundos.

Centrifugar a solução celular a 12 000 Gs durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernat para uma garrafa limpa e vazia e armazene a quatro graus Celsius para purificação posterior. Enquanto isso, ressuspenda o pellet celular novamente com 10 tampão e economize 20 microlitros do lisado celular.

Para caracterização da página SDS, congele novamente o pellet celular ressuspenso a menos 80 graus Celsius para completar a lise celular. Repita o processo de congelamento, descongelamento e sonicação até três vezes. Agrupe o lisado celular anterior e prossiga para purificar as proteínas A ECM usando ITC, no qual os ciclos de centrifugação são realizados em diferentes temperaturas em condições de alto sal.

Divida o lisado celular em centrífuga de 50 mililitros, garrafas e centrífuga a 40.000 Gs por duas horas a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante pipetando para obter uma separação limpa do pellet. Recolher o sobrenadante em frascos de centrifugação limpos e adicionar cloreto de sódio até obter uma concentração final de um molar.

Aqueça a solução a 37 graus Celsius por duas horas com agitação a 225 RPM. Próxima centrífuga. O sobrenadante a 40.000 Gs por duas horas a 37 graus Celsius.

Após a decantação, o sobrenadante esmaga o pellet usando uma espátula de metal e ressuspende os pedaços de pellet no gelo. Água destilada em autoclave fria com agitação vigorosa durante a noite a quatro graus Celsius usando uma barra de agitação magnética e placa até que o pellet esteja completamente dissolvido. Repita esses ciclos até que o pellet a 37 graus Celsius esteja branco, momento em que pode ser dissolvido em água durante a noite e centrifugar.

Para obter a solução proteica, dessalinize a solução proteica dialisando-a contra água destilada a quatro graus Celsius, trocando a água a cada quatro horas ou oito horas durante a noite por dois a três dias após economizar 20 microlitros da proteína purificada para a página SDS liofilizar o restante da proteína purificada conforme mostrado aqui. Uma banda de proteína intensa está no peso molecular previsto na amostra induzida. Também é mostrado o gel de página SDS contendo uma amostra de proteína purificada com um peso molecular de 22 kilodaltons correspondente à laminina cinco A ECM.

A pureza estimada das proteínas A ECM é de cerca de 90 a 95%Este valor foi obtido comparando as proporções das intensidades de banda da proteína alvo e outras bandas de proteínas presentes no gel SDS. Finalmente, para determinar se a proteína purificada era de fato as proteínas A ECM, o Western blotting foi realizado aqui. A pureza da proteína das três proteínas A ECM é mostrada com um gel de página SDS e comparada com uma imagem da membrana de nitrocelulose para western blotting.

A análise revela a presença das proteínas-alvo colágeno quatro A ECM e laminado cinco A ECM marcadas usando anticorpos anti-hexa-histidina conjugados com peroxidase de rabanete. Os rendimentos finais das proteínas A ECM variaram entre 60 miligramas por litro e 120 miligramas por litro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como contrair e purificar proteínas contendo domínios leves de elastina para sua aplicação específica.