Name: Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de Escherichia coli Para engenharia de tecidos da pele (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a construir e purificar proteínas de matriz extracelular artificial com repetições tipo elastina usando Escherichia coli. Este método demonstra expressão recombinante e purificação por ciclagem de transição inversa para engenharia de tecidos.

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Os autores gostariam de agradecer financiamento do Ministério da Educação ACRF Tier 1 (RG41) e start-up bolsa da Universidade Tecnológica de Nanyang. Baixo e Tjin são financiados pelo Bolsista de Investigação (RSS) a partir de Nanyang Technological University, Cingapura.

1. Clonagem de plasmídeos que codificam para Recombinante AECM Proteínas <ol><li> Desenhar a sequência de aminoácidos do domínio funcional (por exemplo, o domínio de ligação celular e repete-elastina semelhantes). Locais de restrição que flanqueiam as extremidades desenho dos domínios funcionais para facilitar a sub-clonagem utilizando software livre de acordo com as instruções de software (por exemplo, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Aqui, seleccionar locais de restrição únicos que não estão presentes no domínio funcional para confinar a digestão para os locais pretendidos. Escolha locais de restrição que aparecem no local de clonagem múltipla (MCS) do vector hospedeiro (por exemplo, pET22b (+)) para a sub-clonagem. </li><li> Inverter traduzir a sequência de aminoácidos para a sequência de nucleótidos utilizando sítios livres de acordo com as instruções de software. (Por exemplo, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Garantir códons são otimizados para E. anfitriões coli. </li><li> Gene de interesse pode ser purchasoligonucleótidos de cadeia ed comercialmente como simples (isto é, se os oligonucleótidos &lt;100 pares de bases (pb)) e efectuar o recozimento de ADN (ver passo 1.4), para reduzir o custo. Caso contrário, para genes maiores que 100 pb, eles poderiam ser comprados por intermédio de empresas comerciais. </li><li> ADN recozimento dos oligonucleótidos <ol><li> Recozer os oligómeros de ADN para se obter a sequência de gene pretendida. Dissolve-se oligonucleótidos de ADN num tampão de oligómero de ADN (10 mM de Tris: 2-amino-2- (hidroximetil) -propan-1,3-diol, pH 8,0, filtrada) para uma concentração final de 1 ug / uL. </li><li> Adicionar 4 mL de cada oligómero com 32 ul de tampão de hibridação de ADN (Tris 10 mM, NaCl 100 mM e MgCl2 100 nm) para se obter uma mistura total de 40 ul. </li><li> Ferver num copo de água utilizando uma placa de aquecimento e imergir a mistura durante 5 min, 95 ° C. Retirar o copo e gradualmente resfriar todo o conjunto em uma caixa de isopor O / N. Os oligômeros foram recozido e está pronto para a digestão. </li></ol></li&gt; <li> Adicionar as enzimas de restrição correspondentes de digerir os oligómeros hibridados (ou seja, designado por inserção) e vector hospedeiro (ou seja, pET22b (+)) separadamente. Utilize a seguinte receita (1-2 ug de ADN, 2 ul de cada uma das enzimas de restrição, 5 uL de tampão de enzima de restrição 10x, e água até um total de mistura de 50 ul) durante 3-4 h a 37 ° C. NOTA: O pET22b (+) vector plasmídico é resistente aos antibióticos ampicilina e contem um 6x-His no C-terminus. A-Sua 6x tag presente em pET22b (+) nos permite usar anticorpos marcada com His para identificar a proteína alvo via transferência de western na etapa 7. </li><li> Adicionar corante 6x a cada mistura de digestão. Executar as misturas de digestão incluindo separadamente uma escada de ADN em géis de agarose a 1,2% contendo ADN de um corante de ADN fluorescente à luz ultravioleta durante 1 h a 100 V. visualizar o DNA em gel de agarose a 1,2% com um iluminador de luz UV. </li><li> Cortar o gel para extrair produtos de ADN digeridos, utilizando kits de purificação de gel comercial. Elute utilizando o volume mínimo para a coluna para atingir uma concentração mínima de ADN de 50-100 ng / mL. </li><li> Combinar o gene de interesse sequencialmente por ligação da inserção de ADN digerido (ou seja, repete elastina ou domínios de ligação de células obtidas por hibridação de ADN) no vector de plasmídeo usando ligase de T4 usando a seguinte receita: (2 jil de vector, 1 ul de ligase de T4, 1,5 ul de tampão de ligação de T4, x ul de inserção, 10,5 x ul de água para um total de mistura de 15 uL). Incubar a mistura de ligação à temperatura ambiente durante 2 h. NOTA: A concentração molar de vector para inserção deve ser variada para optimizar a eficiência da ligação. Volume de inserção descrita como x na receita depende da concentração de ADN eluído a partir do passo 1.7. </li><li> Thaw E. coli DH5a células quimicamente competentes (ou qualquer estirpe de clonagem) em gelo. Placas de agar 2xYT Quente (Tabela 1) contendo ampicilina (25 ug / ml) a 37 ° C. </li><li> Transformar as células usandochoque térmico: <ol><li> Alíquota de 50 ul de células competentes para, pré-refrigerada micro-tubos de centrífuga limpo. Pipetar 5 ul (entre 100 pg e 100 ng) da mistura de ligação para as células, pipetar suavemente para cima e para baixo para misturar. Deixar a mistura em gelo durante 20 min. </li><li> Imergir o tubo de micro-centrifugadora contendo a mistura de células num banho de água a 42 C ° durante 2 minutos e voltou para em gelo durante 2 min. Tempo a duração de imersão para minimizar os danos do calor para as células. </li><li> Adicionar 500 ul de meio SOC (Tabela 1) para dentro do tubo de micro-centrífuga e incuba-se a 37 ° C com agitação durante 1 h. </li><li> Espalhe 50 500 uL da mistura de célula / ligadura numa placa de agar 2xYT que foi pré-aquecida até à TA, contendo ampicilina (25 ug / ml) e incubar as placas de cabeça para baixo, a 37 ° CO / N (12-16 h) . </li></ol></li><li> No dia seguinte, escolha colônias de DNA da placa de agar utilizando pontas de pipeta limpas. Crescer as colônias em 5 ml de meio 2YT (Tabela1) contendo ampicilina (25 ug / ml) O / N a 37 ° CO / N (12-16 h) com agitação (225 rpm). </li><li> No dia seguinte, utilizar um kit de isolamento de plasmídeo para extrair os plasmídeos de ADN para cada colónia escolhido de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN com 50 ul de água. </li><li> Executar um teste de digest com enzimas de restrição usando a seguinte receita: (5 uL de ADN, 0,2 ul de cada uma das enzimas de restrição, 1 ul de tampão de enzima de restrição e 10x superior para cima de água para um total de mistura de 10 ul), incubar durante 2 horas a 37 ° C a tela de colônias que provavelmente contêm a inserção e correr em 1,2% em gel de agarose DNA como no passo 1.6. NOTA: Após a digestão, uma ligação bem sucedida deve resulta em duas bandas, uma para cada vector e inserção que correspondem ao respectivo peso molecular (Figura 1). </li><li> Envie as colônias prováveis ​​para a sequenciação de ADN utilizando o promotor T7 para a frente e primers para sequenciadores comerciais reverter. </li></ol><ol><li> A partir do resultado de sequenciação, seleccionar uma colónia que foi ligado com êxito e usar o plasmídeo de ADN para transformação em E. hospedeiro de expressão E. coli. </li><li> Thaw E. coli estirpe de expressão (células BL21 (DE3) pLysS) em gelo. Enquanto isso, as placas quentes de agar contendo ampicilina (25 ug / ml) e cloranfenicol (34? G / ml) à temperatura ambiente. NOTA: O plasmídeo pLysS presente em bactérias estirpe BL21 (DE3) pLysS contém um gene de resistência ao cloranfenicol. O plasmídeo pLysS contém um gene repressor de T7, que é expresso constitutivamente para limitar a expressão da proteína gotejante MECa. O cloranfenicol é necessário seleccionar as bactérias células que contém pLysS durante a cultura. </li><li> Repita o passo 1.10 para obter transformada E. coli que estão prontos para expressar as proteínas artificiais. Enrole placas de agar em Parafilm e armazenar de cabeça para baixo em 4 6; C, durante até um mês. </li></ol> 3. Expressão Bacteriana de AECM Proteínas <ol><li> Consultar a Figura 2, escolher uma colónia da placa de agar transformada com uma ponta de pipeta e inocular em 10 ml de Terrific Broth estéril (TB) meios (Tabela 1) contendo ampicilina e cloranfenicol antibióticos num tubo de ensaio. Incubar na cultura inicial a 37 ° CO / N (12-16 h) com agitação a 225 rpm. </li><li> Transferir 10 ml da cultura de arranque em 1 L de TB fresco meios estéreis e suplementadas com os mesmos antibióticos num balão de Erlenmeyer de 3 L. Incubar a cultura a 37 ° C com agitação a 225 rpm durante 2-3 h e observar a densidade óptica da cultura (OD 600) atingiu 0,6-0,8 pipetando 1 ml de cultura para uma cuvete vazio para leitura. Guardar a 1 ml de cultura antes da indução para a caracterização por SDS-PAGE. <ol><li> Para medir DO600 da cultura de células, preparar um frasco de meios TB numa cuvetepara uma medição em branco. Separadamente, transferir 1 mL de cultura do frasco de cultura em um novo cuvete vazio. Medir a densidade óptica da cultura utilizando um espectrofotómetro contra o branco de controlo a uma absorvância de 600 nm. </li><li> Guardar a amostra (para subsequente análise de SDS-PAGE), transferindo as amostras de 1 ml da cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, de centrifugação a 12.000 xg durante 2 minutos, e decantar o sobrenadante. </li></ol></li><li> Induzir a cultura com isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para uma concentração final de 1 mM e incuba-se a 37 ° C com agitação a 225 rpm durante mais 4 h. Guardar a 1 ml da cultura no final da indução a 4 horas para a caracterização por SDS-PAGE. </li><li> Colher as células por transferência da cultura para frascos de centrífuga de 1 L e centrifugar a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante, os sedimentos celulares pesar e ressuspender em tampão TEN (Tris 1 M, EDTA 0,01 M, NaCl 0,1 M, pH = 8,0) a 0,5 g / ml. </li></ol> 4. A lise das culturas bacterianas <ol><li> Congelar a cultura de células re-suspensas a -80 ° CO / N. Descongelar a cultura de células congelado num banho de água à temperatura ambiente ou em gelo para lisar as células. Adiciona-se 10 ug / ml de desoxirribonuclease I (ADNase I), 10 ug / ml de ribonuclease A (RNase I), e 50 ug / ml de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante a descongelação e homogeneizar a solução, com agitação lenta. </li><li> Depois de todas as células ressuspensas foram descongeladas, ajustar a solução para pH 9,0 para aumentar a solubilidade da proteína em água 12. Adicionar NaOH 6 N gota a gota com agitação sobre gelo para obter uma consistência homogénea. Lyse pela ruptura de ultra-sons durante 20 minutos em gelo usando um ponta plana de diâmetro 2 mm, 5 seg pulso. </li><li> Centrifugar a solução de células a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um ambiente limpo, garrafa vazia e armazenar a 4 ° C para posterior purificação. </li><li> Enquanto isso, ressuspender o sedimento de células com tampão TEN novamente e re-congelamento a -80 ° C. Paralise celular completo, repita congelamento / descongelamento e de ultra-sons processo até três vezes. Economize 20 ligado celular ul para caracterização SDS-PAGE. </li></ol> 5. Purificação de Proteínas AECM Usando inversa Transição Bicicleta <ol><li> Agrupar o ligado celular a partir do passo 4.3 e prossiga para purificar as proteínas AECM usando ITC, semelhante ao utilizado para a purificação de proteínas à base de elastina 21. Ciclos vai ser feito com as diferentes temperaturas que são 4 ° C (referido como &quot;fria&quot;) e 37 ° C (referido como &quot;quentes&quot;) ciclos, respectivamente. </li><li> Dividir o lisado celular em 50 ml de frascos de centrifugação, e centrifugar a 40000 xg durante 2 horas a 4 ° C. A aparência do sedimento celular deve ser marrom escuro e procurar a pingar. </li><li> Remover o sobrenadante por pipetagem para obter uma separação limpa a partir do sedimento. Recolhe-se o sobrenadante em frascos de centrífuga limpo e adicionar NaCl para uma concentração final de 1 M (até um máximo de 3 M). Quentea solução para 37 ° C durante 2 horas com agitação a 225 rpm. NOTA: A adição de NaCl irá disparar a transição do componente de elastina da MECa causando agregação. O sobrenadante ficará turva. Se a concentração de proteína é suficientemente elevada, a proteína espumoso branco pode ser visto com os lados da garrafa centrífuga. </li><li> Centrifugar o sobrenadante do passo de 5,3 a 40000 xg durante 2 horas a 37 ° C. Decantar o sobrenadante. Triturar o sedimento utilizando uma espátula de metal e ressuspender o pellet em pedaços autoclavado água destilada gelada (50 mg / mL) com agitação vigorosa O / N a 4 ° C utilizando uma barra de agitação magnética e placa. O sedimento deve ser completamente dissolvido. </li><li> Repita os passos 5,2-5,4 por mais três a cinco vezes para se obter um grau de pureza mais elevada da proteína. </li><li> Após o ciclo final de purificação, dessalinizar a solução de proteína por diálise contra água destilada a 4 ° C. Dialisar solução de proteína contra a água durante 2-3 dias com as mudanças na água a cada 4hr ou 8 horas para O / N. Guardar a 20 ul da proteína purificada por SDS-PAGE e liofilizar o resto da proteína purificada e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 6. Caracterização de Proteínas AECM utilizando SDS-PAGE A electroforese <ol><li> Preparar um gel de 12% SDS-PAGE (se o peso molecular é grande, utilizam 8% de gel SDS-PAGE para uma melhor separação). Adicionar tampão de carga de SDS 2x a cada amostra, aquecer as amostras durante 10 min a 100 ° C e processar as amostras no gel durante 1 hora a 100 V ou até que a escada proteína correspondendo ao peso molecular da proteína MECa atinge o meio da gel. </li><li> Recuperar o gel da SDS-PAGE configurar e adicionar Coomassie Brilliant mancha azul (Tabela 2), com um volume de submergir o gel durante 1 hora em uma placa de Petri. Enxaguar em gel de uma solução de descoloração (Tabela 2) durante 5 min num agitador rotativo. Mude a solução de descoloração, e continuar a destain o gel com balanço até que o fundo de tele gel torna-se clara. As bandas de proteína deve ser claramente visível. </li><li> Comparar a posição da proteína alvo contra a escada proteína para determinar o peso molecular da proteína alvo. </li><li> Para confirmar ainda mais a presença da proteína alvo, efectuar transferência de western como no passo 7. </li></ol> 7. Caracterização de proteínas utilizando AECM Western Blotting <ol><li> Executar as amostras sobre um gel de 12% SDS-PAGE como na secção 6 com nenhuma coloração. </li><li> Cortar membrana de nitrocelulose para um tamanho ligeiramente maior do que o gel de SDS-PAGE. Cortar quatro peças de papel de filtro para o mesmo tamanho. </li><li> Wet um pedaço de papel de filtro com tampão de transferência Ocidental (20% v / v de metanol, Tris 25 mM, Glicina 190 mM, pH 8,3), colocar o gel de SDS-PAGE no topo do papel de filtro, seguida de uma outra peça de papel de filtro , em seguida, a membrana de nitrocelulose e um final de outros dois pedaços de papel de filtro. Certifique-se de todo o set-up está submersa com tampão de transferência western suficiente. NOTA: O gel e a membrana não deverá estar em contacto neste ponto de tempo como se podia ligar a proteínas da membrana quando em contacto. </li><li> Transferir as proteínas para a membrana de nitrocelulose colocando dois filtros de papel para uma unidade de transferência semi-seca ocidental, seguindo-se a membrana de nitrocelulose, e colocar cuidadosamente o gel de SDS-PAGE dentro e sobre a membrana, por fim, colocar os dois últimos papel de filtro molhado sobre o gel de SDS-PAGE. Executar a transferência ocidental a 45 mA, 30 min. Adicionar tampão se a tensão é maior do que 30 V. NOTA: De um modo preferido colocar o gel de SDS-PAGE sobre a membrana com uma tentativa e evitar a transferência do gel desnecessariamente na membrana como proteínas poderiam ligar-se à membrana quando em contacto. </li><li> Recuperar e bloquear a membrana de nitrocelulose com solução de bloqueio (5% de leite desnatado em PBS pH 7,4, filtrada com papel de filtro) durante 2 h à TA. Descarte de tampão de bloqueio e adicionar PBS para lavar. NOTA: Mudança para novas luvas para evitar a contaminação da membrana com prote indesejadoins. </li><li> Incubar anti His-anticorpo primário com diluição em PBS a 1: 1000 em TA durante 1 h com agitação. Prepara-se uma mistura em um volume que pode submergir toda a membrana, por exemplo, com a razão de diluição 1: 1000, adicionar 1 ml de anticorpo (concentração: 1 mg / ml) a 999 ul de PBS para uma mistura total de 1 ml. </li><li> Lavar a membrana com 5 mL de PBST (PBS com 0,1% de Tween 20). </li><li> Incubar com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) com diluição em PBS a 1: 5000 em TA durante 1 h com agitação. Prepara-se uma mistura em um volume que pode submergir toda a membrana, por exemplo, com a razão de diluição 1: 5000, adicionar 1 ml de anticorpo (concentração: 1 mg / ml) para 4999 uL de PBS para uma mistura total de 5 ml. </li><li> Lava-se a membrana com 5 mL de PBST e repetir duas vezes. </li><li> Aplicar o substrato quimioluminescente para a membrana com um volume para cobrir a membrana e incubar, seguindo as instruções para o substrato utilizado. NOTA: A sensibilidade da substrato para detecção de proteína pode variar, recomendamos um substrato com sensibilidade máxima para sinais muito baixos, no caso o aumento da concentração de anticorpos não aumenta sinais. </li><li> Capturar os sinais quimioluminescentes que utilizam um gerador de imagens CCD com base. Ajuste a razão de diluição de anticorpo primário e secundário, se os sinais são fracos e não-específica. Incubar mais em solução de bloqueio se o sinal de fundo é elevado. </li></ol>

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<li>MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-chromatographic+Purification+of+Recombinant+Elastin-like+Polypeptides+and+their+Fusions+with+Peptides+and+Proteins+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583(2014).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Engenharia de proteína recombinante é uma técnica versátil para criar novos materiais de proteína usando uma abordagem bottom-up. Os materiais à base de proteínas podem ser concebidos para ter várias funcionalidades, adaptado de acordo com a aplicação de interesse. Devido ao aumento do avanço nas tecnologias de clonagem e de expressão de proteínas, tornou-se relativamente simples (e de baixo custo) para criar uma variedade de proteínas artificiais de uma maneira reprodutível e escalonável. O domínio semelhante a elastin...

Por várias décadas, materiais sintéticos e naturais foram explorados para uso como andaimes na engenharia de tecidos1,2. Embora os materiais sintéticos, como polímeros, ofereçam excelente integridade estrutural e propriedades mecânicas ajustáveis, eles geralmente têm bioatividade insuficiente para promover o crescimento e a infiltração dos tecidos. Por outro lado, materiais naturais como proteínas de matriz extracelular (MEC) têm excelente atividade biológica, mas têm limitações como variabilidade lote a lote, degradação rápida e problemas de imunogenicidade. Dessa forma, as proteínas recombinantes são desejadas, uma vez que podem ser projetadas para mimetizar apenas as propriedades desejáveis das proteínas nativas3,4.
A engenharia de proteínas recombinantes tem atraído amplo interesse como uma plataforma versátil para o design e produção de novos biopolímeros de proteínas artificiais. Ao controlar a sequência genética, as funcionalidades das proteínas artificiais podem ser adaptadas para uma ampla variedade de aplicações5,6. Em particular, as proteínas artificiais da matriz extracelular (aECM) podem ser adaptadas para ter múltiplas funcionalidades para aplicações em engenharia de tecidos, regeneração e reparo de feridas2,7. Mais importante, os avanços nas tecnologias de clonagem e purificação aumentaram a escalabilidade e reduziram tremendamente o custo de fabricação de proteínas recombinantes. É possível produzir grandes quantidades de proteínas recombinantes com baixo custo de produção e econômicas para uso na clínica5. 
Proteínas artificiais da matriz extracelular foram desenvolvidas para aplicaçõesde engenharia de tecidos 8-11. Por exemplo, Tirrell et al. projetaram um enxerto vascular de pequeno diâmetro usando proteínas artificiais contendo fibronectina CS5 e repetições semelhantes à elastina (ELP-CS5). Eles mostraram que as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram capazes de aderir e crescer nesses materiais12. Outros também incorporaram sequências bioativas curtas retiradas de fibronectina, colágeno, laminina, fibrinogênio e vitronectina, bem como domínios estruturais que imitam elastina, seda de aranha e colágenos para criar uma variedade de proteínas de fusão10. Filmes reticulados em massa feitos de proteínas aECM à base de elastina também exibiram propriedades mecânicas semelhantes às da elastina nativa (os módulos elásticos variam entre 0,3-0,6 MPa) 13 . Posteriormente, também foi relatado que proteínas aECM contendo fragmentos de fibronectina mais longos aceleram a cicatrização de feridas in vitro devido ao aumento das afinidades de ligação à integrina8. 
Recentemente, proteínas ECM artificiais específicas para integrina foram desenvolvidas por Tjin e colaboradores14. Cada proteína aECM contém um domínio de ligação celular bioativo retirado de componentes ECM da pele humana nativa2,7,15, como laminina-5, colágeno-IV e fibronectina. Por exemplo, a integrina α3Β1 demonstrou se ligar à sequência PPFLMLLKGSTR encontrada no domínio globular 3 da cadeia laminina-5 alfa-3 (LG3) 16 , 17 . Em seu relatório, eles mostraram que os queratinócitos epidérmicos primários da pele humana envolvem preferencialmente diferentes integrinas para se ligar a cada uma das proteínas aECM, dependendo do tipo de domínio de ligação celular presente.
As proteínas aECM discutidas no trabalho de Tjin et al. contêm domínios semelhantes à elastina flanqueadores {(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8 que conferem elasticidade que imita as propriedades mecânicas da pele humana. Além disso, a incorporação de resíduos de lisina nas repetições semelhantes à elastina também aumenta a solubilidade geral da proteína em solventes aquosos. Além disso, os resíduos de lisina também servem como locais de reticulação para facilitar a formação de filmes de aECM reticulados12. A inclusão de repetições semelhantes à elastina na sequência da proteína aECM permite que as proteínas sejam prontamente purificadas por meio do Ciclo de Transição Inversa (ITC) 14 . As elastinas passam por uma transição de fase acentuada e reversível a uma temperatura específica conhecida como temperatura crítica inferior da solução (LCST) ou temperatura de transição inversa (Tt)18-20. Elastinas e repetições semelhantes a elastinas adotam conformações de bobinas aleatórias hidrofílicas abaixo de seu LCST e tornam-se solúveis em água, enquanto acima de seu LCST, as elastinas se agregam rapidamente em partículas de tamanho de mícron. Essas transições de fase são reversíveis e, portanto, podem ser exploradas para permitir que as proteínas aECM à base de elastina sejam prontamente purificadas por meio da técnica ITC21.
Neste trabalho, relatamos um procedimento generalizado para projetar, construir e purificar proteínas ECM artificiais contendo domínios bioativos de ligação celular, fundidos a repetições semelhantes à elastina. O processo para projetar e clonar os plasmídeos que codificam as sequências de aminoácidos para as proteínas aECM é descrito. As etapas envolvidas para purificar as proteínas aECM usando ITC são descritas. Finalmente, os métodos para determinar a pureza das proteínas aECM obtidas usando eletroforese SDS-PAGE e Western Blotting são discutidos.

<table><tbody><tr><td>pET22b (+)</td><td>Novagen</td><td>69744</td><td>Vetores de expressão T7 com resistência à ampicilina&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C6060-03</td><td>antibióticos adicionais - cloranfenicol</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactosídeo (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>1 M solução estoque com água autoclavada, fazer fresco antes da indução.</td></tr><tr><td>Kit de minipreparação QIAprep Spin</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>kit de isolamento de plasmídeo</td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Affymetrix</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Affymetrix</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean&trade; gel kit de recuperação de DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>XL10-gold strain</td><td>Agilent Technologies</td><td>200315</td><td></td></tr></tbody></table>

design e construção de matriz extracelular artificial (meca) proteínas de<em&gt; escherichia coli</em&gt; para engenharia de tecidos da pele

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

A tecnologia recombinante é uma plataforma versátil para criar novas proteínas artificiais com propriedades ajustáveis. Na última década, muitas proteínas artificiais que incorporaram domínios funcionais derivados da natureza (ou criados de novo) foram relatados. Em particular, proteínas artificiais de matriz extracelular (aECM) foram desenvolvidas; essas proteínas aECM consistem em domínios biológicos retirados da fibronectina, lamininas e colágenos e são combinadas com domínios estruturais, incluindo repetições semelhantes à elastina, repetições de seda e colágeno. Até o momento, as proteínas aECM têm sido amplamente investigadas para aplicações em engenharia de tecidos e reparo de feridas. Recentemente, Tjin e colegas de trabalho desenvolveram proteínas aECM específicas para integrina projetadas para promover a fixação e propagação de queratinócitos da pele humana. Em seu trabalho, as proteínas aECM incorporam domínios de ligação celular retirados da fibronectina, laminina-5 e colágeno IV, bem como repetições semelhantes à elastina flanqueadoras. Eles demonstraram que as proteínas aECM desenvolvidas em seu trabalho eram candidatas promissoras para uso como substratos em pele artificial. Aqui, descrevemos o design e a construção de tais proteínas aECM, bem como seu processo de purificação usando as características termorresponsivas da elastina.

Na concepção de proteínas de fusão que contêm repetições de elastina semelhante, é importante para manter um teor de elastina geral, bastante grande fracção da proteína de fusão 18. Isto é para assegurar que a construção de proteína de fusão retém as suas características elásticas do tipo, a fim de utilizar CIT para purificação. A concepção e as sequências descritas nesta secção foram especificamente proteínas MECa retirado do trabalho por Tjin et ai. 14. Neste trabalho, três proteínas AEC...

As tecnologias recombinantes permitiram que os projetistas de materiais criassem novas proteínas artificiais com funcionalidades personalizadas para aplicações de engenharia de tecidos. Por exemplo, proteínas artificiais da matriz extracelular podem ser projetadas para incorporar domínios estruturais e biológicos derivados de ECMs nativos. Aqui, descrevemos a construção e purificação de proteínas aECM contendo repetições semelhantes à elastina.

Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para engenharia de tecidos da pele

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar as etapas envolvidas na construção e produção de proteínas de matriz extracelular artificiais ou A ECM contendo repetições semelhantes à elastina. Isso é realizado primeiramente pela construção de genes recombinantes que codificam as proteínas A ECM. Em seguida, os genes recombinantes são inseridos em hospedeiros bacterianos.Neste ponto, as proteínas recombinantes são expressas nos hospedeiros bacterianos e, em seguida, colhidas após a extração proteica por lise celular. O passo final consiste em purificar as proteínas utilizando o ciclo de transição inversa ou ITC, que explora o comportamento exclusivo de transição de fase da elastina, semelhante aos peptídeos.Os ciclos de centrifugação são realizados a quatro graus Celsius e a trinta e sete graus Celsius. Por fim, técnicas de eletroforese em gel e western blot são utilizadas para identificar as proteínas recombinantes e determinar suas purezas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como colunas de afinidade, é que podemos extrair grandes quantidades de proteínas de forma relativamente barata.Inicie este procedimento com todos os projetos de ligantes conforme descrito no protocolo textual. Após obter os oligômeros, anile os oligômeros de DNA para obter a sequência gênica desejada. Primeiro, dissolva os oligonucleotídeos de DNA em tampão para oligos de DNA até uma concentração final de um micrograma por microlitro.Adicione quatro microlitros de cada ligante a 32 microlitros de DNA e tampão de anelamento para obter uma mistura total de 40 microlitros. Em seguida, aqueça em ebulição um béquer de água usando uma placa aquecedora e mergulhe a mistura por cinco minutos. A 95 graus Celsius, retire o béquer e resfrie gradualmente todo o conjunto em uma caixa de isopor durante a noite; os oligômeros agora foram anelados e estão prontos para a digestão.Adicione as enzimas de restrição correspondentes para digerir separadamente os oligômeros al e os vetores hospedeiros conforme descrito no protocolo de digestão do texto, durante três a quatro horas a 37 graus Celsius. Após a corrida dos produtos de digestão em gel de agarose e a purificação do DNA, combine sequencialmente o gene de interesse ligando o inserto de DNA digerido ao vetor plasmidial com a ligase T4. Usando a receita encontrada no protocolo de texto, incube a mistura de ligação à temperatura ambiente por duas horas.Em seguida, transforme as células utilizando choque térmico por Ali. Transfira 50 microlitros de células competentes para tubos de microcentrífuga limpos e pré-resfriados. Pipete cinco microlitros da mistura de ligação para dentro das células, pipetando suavemente para cima e para baixo para homogeneizar.Deixe a mistura em gelo por 20 minutos. Em seguida, imerja o tubo de microcentrífuga contendo a mistura celular em banho-maria a 42 graus Celsius por dois minutos e retorne ao gelo por dois minutos. Adicione 500 microlitros de meio SOC ao tubo de microcentrífuga e incube a 37 graus Celsius com agitação por uma hora.Após a incubação, espalhe de 50 a 500 microlitros da mistura de ligação celular em uma placa de ágar YT 2x contendo ampicilina que tenha sido pré-aquecida à temperatura ambiente. Incube as placas viradas de cabeça para baixo a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, selecione colônias de DNA da placa de ágar utilizando ponteiras limpas.Cultive as colônias em cinco mililitros de meio YT duas vezes, contendo ampicilina, durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, utilize um kit de isolamento de plasmídeos conforme o protocolo do fabricante para extrair os plasmídeos de DNA de cada colônia.Escolha uma colônia da placa de transformação com a ponteira de uma pipeta e inocule em 10 mililitros de caldo terrific estéril, ou meio TB, contendo os antibióticos ampicilina e cloranfenicol em um tubo de ensaio. Em seguida, elua o DNA com 50 microlitros de água após a transformação do plasmídeo recombinante no hospedeiro bacteriano, conforme descrito no protocolo do texto.Incube esta cultura inicial a 37 graus Celsius durante a noite com agitação a 225 rpm. Em seguida, transfira 10 mililitros da cultura inicial para um litro de meio TB fresco e estéril, suplementado com os mesmos antibióticos, em um frasco Erlenmeyer de três litros.Incube a cultura a 37 graus Celsius com agitação a 225 RRP M por duas a três horas. Observe a densidade óptica da cultura a 600 nanômetros ou OD 600 para confirmar que atingiu entre 0,6 e 0,8, pipetando um mililitro da cultura em um Q vet vazio para leitura. Em seguida, induza a cultura com IPTG até uma concentração final de um milimolar e incube a 37 graus Celsius com agitação a 225 RPM por mais quatro horas.Recolha as células transferindo o cultivo para garrafas de centrífuga de um litro e centrifugando a 12.000 Gs durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após descartar o sobrenadante, pese os pellets celulares e re-suspenda em tampão 10 a 0,5 gramas por mililitro. Congele o cultivo celular re-suspenso a menos 80 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, descongele a cultura celular congelada em banho-maria à temperatura ambiente ou sobre gelo. Às células, adicione desoxirribonuclease, ribonuclease A e fluoreto de fenilmetilsulfonila. Durante o descongelamento da solução, homogeneíze-a com agitação lenta.Após o descongelamento de todas as células ressuspendidas, ajuste a solução para pH 9,0 para aumentar a solubilidade da proteína em água, com muito cuidado. Adicione hidróxido de sódio 6 N gota a gota, sob agitação em gelo, para obter uma consistência homogênea. Em seguida, lise as células por disruptura ultrassônica por 20 minutos em gelo, utilizando uma ponteira plana de dois milímetros de diâmetro e um pulso de cinco segundos.Centrifugue a solução celular a 12.000 Gs durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um frasco limpo e vazio e armazene a quatro graus Celsius para purificação posterior. Enquanto isso, re-suspenda o pellet celular novamente com 10 tampão e reserve 20 microlitros do lisado celular.Para a caracterização por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, reconstitua o pellet celular congelado a menos 80 graus Celsius para completar a lise celular. Repita o processo de congelamento-descongelamento e sonicação até três vezes. Reúna o lisado celular obtido anteriormente e prossiga com a purificação das proteínas A ECM utilizando ITC, no qual ciclos de centrifugação são realizados em diferentes temperaturas sob condições de alta salinidade.Divida o lisado celular em frascos de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue a 40.000 Gs por duas horas a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante por pipetagem para obter uma separação limpa do pellet. Colete o sobrenadante em frascos de centrífuga limpos e adicione cloreto de sódio até uma concentração final de um molar.Aqueça a solução a 37 graus Celsius por duas horas com agitação a 225 rpm. Em seguida, centrifugue o sobrenadante a 40.000 Gs por duas horas a 37 graus Celsius.Após a decantação, triture o precipitado com uma espátula de metal e ressuspenda os fragmentos do precipitado em gelo. Autoclave água destilada fria com agitação vigorosa durante a noite a quatro graus Celsius usando um bastão e placa de agitação magnética até que o precipitado esteja completamente dissolvido. Repita esses ciclos até que o precipitado a 37 graus Celsius fique branco, momento em que pode ser dissolvido em água durante a noite e centrifugado.Para obter a solução proteica, dessaline a solução proteica por diálise contra água destilada a quatro graus Celsius, trocando a água a cada quatro ou oito horas durante a noite, por dois a três dias, após reservar 20 microlitros da proteína purificada para eletroforese em gel de SDS-PAGE. Liofilize o restante da proteína purificada conforme mostrado aqui. Uma banda proteica intensa encontra-se no peso molecular previsto na amostra induzida. Também é mostrado o gel de SDS-PAGE contendo uma amostra de proteína purificada com um peso molecular de 22 kilodaltons, correspondente à laminina cinco A ECM.A pureza estimada das proteínas A ECM é de cerca de 90 a 95%. Esse valor foi obtido comparando as razões das intensidades das bandas da proteína alvo e das demais bandas proteicas presentes no gel de SDS-PAGE. Por fim, para determinar se a proteína purificada era de fato as proteínas A ECM, realizou-se um Western blot. A pureza proteica das três proteínas A ECM é mostrada em um gel de SDS-PAGE e comparada com uma imagem da membrana de nitrocelulose utilizada para o Western blot.A análise revela a presença das proteínas-alvo colágeno quatro A ECM e lâmina cinco A ECM marcadas utilizando anticorpos anti-marca de hexa-histidina conjugados com peroxidase de rábano-forrageiro. Os rendimentos finais das proteínas A ECM variaram entre 60 miligramas por litro e 120 miligramas por litro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir e purificar proteínas contendo domínios de elastina leve para sua aplicação específica.

design-construction-artificial-extracellular-matrix-aecm-proteins

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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