Name: Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda a realizar injeções intramusculares ao longo das placas motor end para transporte retrógrado de traçadores em neurônios motores da medula espinal. Este método minimamente invasivo utiliza reação histoquímica de acetilcolinesterase para localização precisa das placas e microscopia de fluorescência para visualização.

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Este trabalho foi apoiado por um Centro de Pesquisa Nacional de Saúde e cuidados médicos (NHMRC) subvenção de projecto para RM

Todos os procedimentos experimentais descritos aqui cumprido o Cuidado e Comitê de Ética da UNSW Austrália Animal e foram realizados de acordo com o Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho da Austrália regulamentos para a experimentação animal. Todos os procedimentos deste protocolo deve ser realizado de acordo com a exigência do Comitê Animal Care and Ethics relevante. 1. Acetylcholinesterase histoquímico Coloração <ol><li> Preparar a mistura de reacção acetilcolinesterase <ol><li> Adicionar 290 mg de iodeto de acetiltiocolina a 200 ml de tampão 0,1 M de fosfato (PB). Misturar com um agitador magnético a 900 rpm. </li><li> Adicionar 600 mg de glicina sob agitação contínua. </li><li> Adiciona-se lentamente 420 mg de sulfato de cobre para a mistura reaccional, sob agitação contínua até o produto estar completamente dissolvido. </li></ol></li><li> Retirar a pele na parte da carcaça do animal (obtido através de partilha de tecido) fazendo incisõesna pele de um rato ou rato perfundido, agarrando a pele da área de pescoço e puxando-o passado seus pés. Certifique-se de que a fáscia que cobre cada músculo é removido ou perfurado de forma significativa para assegurar exposição suficiente das fibras musculares para a solução reaccional. </li><li> Imergir todo o corpo ou parte do interesse na mistura de reacção e incuba-O / N a 4 ° C. </li><li> Lava-se a carcaça durante 2 min em água destilada. Nota: Nesta fase, os músculos exibem uma coloração azul e as placas motoras terminais (MPE) pode ser vista como pontos brancos. </li><li> Expor a carcaça para uma solução de sulfureto de amónio a 10% durante 3-5 segundos. Nota: As fibras musculares vai rapidamente virar marrom e os deputados do Parlamento Europeu será observável como pontos salpicados pretos. Se a reacção ocorre muito rapidamente, e as fibras musculares são coradas muito escuro para distinguir entre os eurodeputados e as fibras musculares tente usar concentrações mais baixas da solução de sulfureto de amónio (por exemplo, 5%). O tempo de reacção para obter oóptimo contraste entre os eurodeputados e as fibras musculares varia de uma amostra para a outra. Por conseguinte, é difícil definir o tempo de exposição exacto com o reagente. A reacção deve ser cuidadosamente monitorizado e parado quando o contraste é considerada adequada. </li><li> Lave a carcaça duas vezes, com agitação em água destilada e suavemente pat a seca de carcaça. </li><li> Fotografia tanto os aspectos lateral e medial do membro, garantindo que os deputados do Parlamento Europeu para todos os músculos de interesse são capturados. </li></ol> 2. As injeções intramuscular nas placas Motor End <ol><li> Puxe micropipetas de vidro com um puxador de micropipeta (o uso de micropipetas graduadas com êmbolos é recomendado). Com a ajuda de um microscópio de dissecação, quebrar as pontas das micropipetas com um par de pinças de modo a que o diâmetro interno do lúmen da micropipeta é aproximadamente 0,5 mm. </li><li> Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos utilizados são recém-autoclavado e thna área cirúrgica é estéril. </li><li> Encha as micropipetas com Fluoro-Gold (5% em água destilada). </li><li> Anaesthetise induzir no animal numa câmara de indução com isofluorano (4% em O 2). Verifique se há reflexo de endireitamento e garantir a sua ausência antes de o retirar da câmara de indução. Garantir um cone de nariz através da focinho do rato e entregar isofluorano (2% em O 2) para a manutenção da anestesia. Comprima dedos do animal e gentilmente tocar o olho do animal para garantir que tanto a retirada pedal e os reflexos da córnea estão ausentes. Nota: Uma mistura de cetamina e xylazil também pode ser usada (80 e 10 mg / kg, respectivamente, entregue por via intraperitoneal). A ketamina é um anexo 8 (&quot;Controlada&quot;) de drogas e protocolos necessários associados com a compra, uso, armazenamento e eliminação da droga terão de ser respeitados. </li><li> Aplicar lubrificante olho para evitar a secagem dos olhos durante o decurso do processo. </li><li> Raspar a tmembro argeted e uso de gaze para limpar a área raspada com três esfrega alternadas de clorexidina e álcool 70%. Transferir o animal à zona cirúrgica. </li><li> Colocar o animal em um underpad limpo e posicioná-lo de forma adequada para garantir um bom acesso ao músculo alvo (s). </li><li> Utilizar um par de pinças com dentes apertos para levantar a pele sobre o músculo orientada para longe da musculatura subjacente e fazer uma incisão na pele com tesouras cirúrgicas. Assegure-se que a incisão seja suficientemente grande para expor completamente o músculo (s) de interesse. Certifique-se de que não há o mínimo de interrupção para a fáscia. </li><li> Use as fotografias de MEP para transpor mentalmente a localização e forma da região de MEP para o músculo (s). Nota: Um marcador de feltro fino poderia ajudar a reproduzir a região do MEP da fotografia para o músculo (s) de interesse. </li><li> Executar múltiplas injecções ao longo do comprimento total da região de MEP (para Fluoro-Gold, 3 a 4 injecções de 1-2 ul cada should ser suficiente). Limpe cuidadosamente o músculo (s) para remover qualquer infiltração. </li><li> Traga as duas extremidades da pele incisão perto junto com uma pinça sem corte e fechar a ferida com grampos cirúrgicos. Se infiltrar Bupivacaína 0,1 ml (0,5% em água) (ou outros anestésicos locais) ao longo de toda a extensão da ferida. </li><li> Desligue a máquina anestésico fora e monitorar o animal até que ele tem está totalmente recuperado da anestesia. </li><li> Esperar durante 14 dias entre a administração de injecções intra-musculares e a perfusão dos animais. </li></ol> 3. As perfusões <ol><li> Administrar uma dose letal de pentobarbitona solução de sódio (por exemplo Lethabarb; 150 mg / kg) ao animal por injecção intraperitoneal. <ol><li> Acompanhar de perto o animal até um nível profundo de anestesia é alcançado, como foi confirmado pela ausência da retirada pedal e os reflexos da córnea. </li></ol></li><li> Posicione o animal à sua volta em uma placa de dissecação colocado sobre um perfusion pia. </li><li> Utilizar um par de pinças com dentes apertos para levantar a pele que cobre a base do esterno. Faça uma pequena incisão na pele com um par de tesouras cirúrgicas fortes imediatamente abaixo do esterno e em seguida, usar a pinça para agarrar a cartilagem xifóide do esterno. Mantendo a cartilagem xifóide, alargar a incisão em ambos os lados da cavidade torácica, a partir do esterno para as axilas. </li><li> Cortar o diafragma para expor o coração. <ol><li> Injectar 0.ml de heparina directamente para o vértice do coração para impedir a coagulação do sangue. </li><li> Cortar o vértice para permitir a inserção de uma cânula no ventrículo esquerdo, e, em seguida, apertar rapidamente a cânula no lugar com a ajuda de um hemostático. </li><li> Faça uma incisão no átrio direito com um par de tesouras finas e iniciar imediatamente a bomba peristáltica. Perfundir com 0,1 M PB até que o líquido que flui para fora do átrio é quase livre de sangue e a cor do fígado torna-se castanho claro. Em seguida, perfundir com uma solução de paraformaldeído (4% em 0,1 M PB) até que todo o corpo do animal se torna rígida. </li></ol></li></ol> 4. Cervical Spinal Cord Dissecção e Preparação para Histologia <ol><li> Coloque a carcaça do animal em seu abdômen. </li><li> Cortar a pele na linha média do corpo com um bisturi e reflectir a partir da base do crânio até ao nível do osso ilíaco. </li><li> Cortar e refletem os músculos paravertebrais para expor o aspecto dorsal da coluna vertebral. </li><li> Identificar o processo espinhoso óssea do Atlas, o segundo segmento cervical (ou seja, C2), e removê-lo com um par de fórceps ou pinças cirúrgicas para localizar a raiz dorsal correspondente subjacente. <ol><li> Identificar a raiz C2 direito colorindo-o com um marcador de feltro permanente. </li><li> Remover o próximo vértebras, um por um e marcar as raízes dorsais direito com cores alternadas (ou seja, C2, C4, C6, C8 e pode ser colorido de verde e C3, C5, C7, T1 pode ser colORed em azul). </li></ol></li><li> Utilize uma pequena agulha cirúrgica (por exemplo, 30 L agulha de calibre) para suavemente perfure através da dura-máter que cobre a extremidade inferior da medula espinhal. Com o bisel da agulha virada para cima, levantar a dura-máter longe do cabo enquanto move a agulha de rostral para fazer uma fenda longitudinal. <ol><li> Reflectem a dura. </li></ol></li><li> Corte o transversalmente da medula espinhal em blocos de um ou dois segmentos com uma nova lâmina de bisturi. <ol><li> Deixar os segmentos da medula espinhal in situ e, para cada bloco, cuidadosamente fazer uma pequena marca fiducial no lado esquerdo de cada bloco com a meio caminho entre a lâmina de bisturi duas raízes adjacentes. Certifique-se de que a marca fiducial é suficientemente profundo através do tecido a ser visível a partir do aspecto ventral dos blocos. Adicione a marca fiducial a um ângulo de aproximadamente 45 °, que aponta ou anteriormente ou posteriormente com respeito à anatomia animal, para auxiliar na orientação do segmento de tecido a seguir a dissecção. </li></ol></li><li> Recolher os blocos individuais em frascos pequenos, claramente marcado contendo uma solução de paraformaldeído (4% em 0,1 M PB) e deixar à TA S / N. </li><li> Transferir os blocos em garrafas limpas, claramente marcado contendo uma solução de sacarose (30% em 0,1 M PB) e manter a 4 ° C durante pelo menos dois dias. </li><li> Coloque os segmentos em crio moldes e os cobriu com meio congelamento do tecido. Para a preparação histológica longitudinal, orientar os blocos com o dorso voltado para cima e usar a marca fiducial para orientar o bloco nos moldes crio. </li><li> Congelar as crio-moldes à temperatura de -20 ° C e cortado com um crióstato em secções de 50 micrometros de espessura. Nota: As secções podem ser directamente montadas em lâminas de microscópio de adesão e deixa-se secar S / N. Em alternativa, as seções podem ser lançada em placas de 48 poços cheios de 0,1 M PB e posteriormente montado usando a marca fiducial para orientar as secções de tecido sobre os slides. </li></ol> 5. lombar Spinal Cord Dissecção e Preparação para Histologia <ol><li> Coloque a carcaça do animal nela está para trás. </li><li> Realizar uma incisão na linha média ao longo do abdómen do animal e remover as vísceras. Dissecar os músculos da parede abdominal posterior para expor o aspecto ventral da coluna vertebral. </li><li> Localize a costela caudal-mais curto e sua adjacente vértebra T13 onde a raiz ventral T13 sai do osso. <ol><li> Consecutivamente remover um por um a rostral dois ou três vértebras para T13 (isto é, T12, T11 e, se necessário, T10) com fórceps cirúrgicas finas para seguir a raiz ventral T13 até ao seu ponto de entrada na face ventral da medula ventral e marcá-lo com um marcador de feltro permanente. </li><li> A partir deste ponto em diante, repetir o mesmo processo para identificar a localização dos pontos de entrada de raiz ventral para L1, L2, L3, L4, L5, L6 e S1, colori-los com cores alternadas. </li></ol></li><li> Siga o mesmo procedimento como descrito na Seção 4,5-4,10 para lumbar dissecção da medula espinhal. </li></ol>

<ol><li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li>
<li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li>
<li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li>
<li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li>
<li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li>
<li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11(2011).</li>
<li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li>
<li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1%2F2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li>
<li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li>
<li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li>
<li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li>
<li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li>
<li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li>
<li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li>
<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Alternative+energy+for+neuronal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li>
<li>Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li>
<li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb%3A+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li>
<li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li>
<li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58(2013).</li>
<li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons%3A+an+approach+to+maximize+retrograde+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li>
<li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li>
<li>Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755(2013).</li>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Segmentação intramuscular e subsequente transferência de transgenes retrógrada terapêuticas para os correspondentes neurónios motores α para o tratamento experimental da condição neuromuscular não é uma nova estratégia. Por exemplo, este método de entrega tem sido usado para retardar a degenerescência neuromuscular em diferentes fases da progressão de ALS em ratinhos e ratos SOD1 1,9-12, bem como em ratinhos com SMA 13. Embora promissora, a eficácia destes cenários de terapia de gene tem sido limit...

A perda de controle do movimento voluntário que resulta de condições neurológicas, como a doença do neurônio motor e spinal-, bem como atrofia muscular de Duchenne é uma condição debilitante que tem um impacto elevado e duradouro na vida todos os dias dos indivíduos afetados. Durante a última década, os esforços de pesquisa com o objetivo de parar ou pelo menos retardar os efeitos deletérios dessas doenças neuromusculares tem sido uma prioridade para muitos médicos e cientistas de todo o mundo. A este respeito, a recente geração de modelos animais que imitam estas doenças neuromusculares foi essencial na obtenção de conhecimentos fundamentais sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes ao desenvolvimento e à progressão destas condições 1-13. O tratamento destas doenças neuromusculares requer acesso directo à medula espinal e pode ser conseguida através de injecções na medula espinhal 14,15. Os recentes avanços na terapia genética também têm como alvo os músculos estriados do superior emembros inferiores a genes terapêuticos de transporte para os neurônios motores α correspondentes que estão localizados dentro do corno anterior da medula espinhal 1,9-13. No entanto, esta estratégia promissora uma vez não conseguiu melhorar o resultado dessas condições neurológicas. Embora seja justo concluir que estes resultados pobres poderia ser, pelo menos em parte, ser atribuída à baixa eficácia destes genes protetores, não se pode excluir a baixa eficácia destes métodos de entrega de genes. Placas motoras (MPE) são regiões especializadas das miofibras esqueléticos que são recuados pelos terminais do axônio de grandes fibras motoras periféricas provenientes de α neurônios motores. Em conjunto, as terminações de fibras nervosas periféricas e os eurodeputados formar a junção neuromuscular, ou seja, o local onde os impulsos sinápticos são desencadeadas pela libertação anterógrada do neurotransmissor, acetilcolina. Importante, a relação entre as fibras nervosas periféricas e os eurodeputados é bi-direccional, embora diferentes motores são responsáveis ​​pelo transporte de moléculas e organelas, bem como no sentido para longe do neurónio somata 16-18. À luz dessas considerações anatômicas, os deputados parecem ser os alvos de escolha para a entrega e transporte retrógrado subsequente de material genético para os neurônios motores correspondentes. Neste contexto, não é surpreendente que o sucesso da transdução de neurónio motor depende muito da distância entre a injecção intramuscular de vectores virais e do PE do músculo 19-20. Surpreendentemente, no entanto, a localização exacta das zonas de MEP nos miofibras do rato de laboratório e do rato, as duas espécies de escolha para modelar doenças neuromusculares, não estavam disponíveis até recentemente. Temos produzido mapas detalhados da região do MEP para vários músculos forelimb no rato eo rato 21-22. Mais recentemente, nós mostramos os detalhes da organização do MEP region por vários músculos do membro posterior do rato 23 e estamos actualmente a analisar as características dos deputados do Parlamento Europeu sobre o membro posterior de ratos. Em nossas mãos, injeções intramusculares de traçadores retrógrados dirigidos às zonas inteiras MEP nestes músculos deu origem a neurônios motores mais marcadas que estão abrangendo segmentos da medula espinhal mais do que o relatado anteriormente. Aqui apresenta-se o protocolo que tem sido desenvolvida ao longo dos últimos anos a revelar a localização dos eurodeputados na superfície externa, bem como em toda a profundidade do membro posterior e músculos do membro anterior, tanto no rato e na ratazana.

<table><tbody><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>Nil</td><td>Diluído a 5%</td></tr><tr><td>Drummond PCR Micropipets 1-10 &micro; l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>acompanhado de êmbolos</td></tr><tr><td>Acetiltiocolina Iodeto Sigma</td><td>Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Cobre(II) Anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek O.C.T Sakura</td><td>Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetrametilrodamina e biotina</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Diliuted em água destilada</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Isoflurano vapor de inalação</td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wound Clips Texas</td><td>Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Austrália) Pty Ltd.</td><td></td><td></td>LETHA450</tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus lâminas de vidro</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sulfeto de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>diluído a 10%</td></tr> <tr><td>Marcain Spinal 0,5% (cloridrato de bupivacaína)</td> <td>Astrazenca</td><td></td><td>diluído a 0,25%</td></tr></tbody></table>

injecções intramusculares ao longo das placas motor end: uma abordagem minimamente invasiva para shuttle tracers diretamente em neurônios motores

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Doenças que afetam a integridade da medula espinhal neurônios motores estão entre as doenças neurológicas mais debilitantes. Durante as últimas décadas, o desenvolvimento de vários modelos animais destas doenças neuromusculares forneceu a comunidade científica com cenários terapêuticos diferentes destinadas a retardar ou inverter a progressão destas condições. Tirando partido da maquinaria retrógrada de neurónios, uma destas abordagens tem sido a alvejar os músculos esqueléticos, a fim de genes terapêuticos de transporte em correspondentes neurónios motores da medula espinal. Embora uma vez promissora, o sucesso da abordagem de entrega de tal gene tem sido dificultada pelo número sub-ótimo de neurônios motores transduzidas até agora tem mostrado a ceder. Placas motoras (MPE) são regiões altamente especializados na musculatura esquelética que estão em contato direto sináptica para a medula espinhal α neurônios motores. A este respeito, é importante notar que, até agora, os esforços para retrogradamentegenes transferência para os neurônios motores foram feitas sem referência à localização da região de MEP nos músculos alvo. Aqui, descrevemos um protocolo simples 1) para revelar a localização exata dos deputados na superfície dos músculos esqueléticos e 2) usar esta informação para guiar a entrega intramuscular e transporte retrógrado ideal subsequente de traçadores retrógrados em neurônios motores. Esperamos utilizar os resultados desses experimentos de rastreamentos em novos estudos sobre investigando transporte retrógrado de genes terapêuticos para os neurônios motores da coluna vertebral cabo através da segmentação dos deputados.

Coloração histoquímica da acetilcolinesterase revela a localização das placas terminais do motor no sentido da largura dos músculos. A Figura 1 ilustra os resultados de coloração tais realizada em um membro anterior de rato inteiro. Sugere-se para optimizar a concentração da solução de sulfureto de amónio (por ex., 5-7% em vez de 10%), bem como o momento em que o espécimen é imerso na solução se a coloração de fundo não específica sobre as fibras musculares é demasiado excessivo. A Figu...

A eficácia da captação intramuscular e do transporte retrógrado de moléculas para os neurônios motores correspondentes depende da localização dos locais de injeção em relação às placas terminais motoras (MEPs). Aqui, descrevemos como localizar MEPs nos músculos esqueléticos para otimizar o transporte retrógrado de traçadores para os neurônios motores.

Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é aumentar a eficácia do transporte retrógrado de traçadores neuroanatômicos para os neurônios motores da medula espinhal após injeção intramuscular. Isso é alcançado pela iniciação de uma reação histoquímica de acetilcolinesterase em um tecido de interesse simulado, para identificar a localização das placas motoras terminais na musculatura do animal. Na segunda etapa, são realizadas injeções intramusculares do traçador retrógrado ao longo de toda a extensão da região da placa motora terminal.Nos músculos de interesse, os animais são então mantidos por 14 dias para permitir o transporte do marcador até a medula espinhal. Os neurônios motores que, em última instância, inervam toda a extensão da região da placa motora produzem um maior número de neurônios motores marcados, que se estendem por múltiplos segmentos da medula espinhal de roedores, quando visualizados por microscopia de fluorescência. As implicações deste estudo abrangem o desenvolvimento de terapias para disfunções neuromusculares, incluindo lesão medular e esclerose lateral amiotrófica.Como esta é uma maneira minimamente invasiva e, portanto, clinicamente relevante de entregar genes terapêuticos para a medula espinhal e neurônios motores, geralmente indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque as regiões das placas motoras terminais não podem ser visualizadas na musculatura de animais vivos. A demonstração visual desta técnica é fundamental, pois as injeções intramusculares exigem a transposição mental da placa motora terminal para os músculos. Para criar um mapa da placa motora terminal para a injeção intramuscular, comece imergindo o corpo ou membro descartado de interesse na mistura reacional para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave o cadáver por dois minutos em água destilada.Nesta fase, os músculos terão uma coloração azul e as placas motrizes aparecerão como pontos brancos. Mergulhe a carcaça em sulfeto de amônio, lave a carcaça três vezes, seque o membro delicadamente e detecte a região da placa motriz, em seguida analise o contraste para injetar o músculo vivo nas placas motrizes. Primeiro, use um puxador de micropipetas para puxar microeletrodos de vidro graduados equipados com êmbolos. Em seguida, utilizando um microscópio estereoscópico, quebre as pontas das micropipetas com uma pinça, de modo que o diâmetro interno de cada lúmen seja aproximadamente 0,5 milímetros.Em seguida, preencha as pipetas do aplicador com flora gold. Agora aplique lubrificante ocular em um animal anestesiado e retire os pelos do membro a ser injetado. Use gaze para limpar a área depilada com três esfrega&ccedil;&otilde;es alternadas de clorexidina e &aacute;lcool 70%.Em seguida, posicione o animal sobre uma almofada limpa para permitir o acesso ao músculo alvo. Quando o animal estiver posicionado, use um par de pinças com pontas dentadas para levantar a pele sobre o músculo alvo, separando-a da musculatura subjacente, e utilize tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na pele. Tenha cuidado para que a incisão seja grande o suficiente para expor completamente o músculo de interesse, com mínima perturbação da fáscia.Em seguida, utilize as fotografias da placa motora para transpor mentalmente a localização e a forma da região de interesse da placa motora para o músculo e administre três a quatro injeções de um a dois microlitros de floral gold ao longo de todo o comprimento da região da placa motora. Após a última injeção, limpe suavemente o músculo para remover qualquer vazamento. Em seguida, use pinças rombas para aproximar as duas extremidades da pele incisada, feche a ferida com clipes cirúrgicos e infiltre todo o trajeto da ferida com o anestésico local apropriado.Duas semanas após as injeções, realize a perfusão intracardíaca do animal com fixador. Para dissecar a medula espinhal cervical, posicione o animal em decúbito ventral e use um bisturi para cortar a pele ao longo da linha média do corpo. Retraia a pele desde a base do crânio até o nível do osso ilíaco.Em seguida, corte e retraja os músculos paravertebrais para expor a face dorsal da coluna vertebral. Após identificar o processo espinhoso ósseo do áxis, remova o segmento com um par de pinças para localizar a raiz dorsal subjacente correspondente. Marque a raiz C dois direita com uma caneta permanente de ponta de feltro.Em seguida, remova as vértebras sucessivas uma a uma, marcando as raízes dorsais direitas com cores alternadas. Por exemplo, aqui, C2, 4, 6 e 8 foram coloridas em azul, enquanto C3, 5, 7 e T1 foram marcadas em preto. A seguir, use uma agulha cirúrgica de calibre 30 para perfurar suavemente a dura-máter que recobre a extremidade inferior da medula espinhal, com o bisel da agulha voltado para cima.Levante a dura afastando-a do cordão enquanto movimenta a agulha cuidadosamente. Para fazer um corte longitudinal e refletir a dura, use uma lâmina nova de bisturi para cortar transversalmente a medula espinhal em blocos de um a dois segmentos, a fim de auxiliar na orientação do segmento tecidual após a dissecação. Deixe os segmentos no lugar e, para cada bloco, use o bisturi para fazer cuidadosamente uma pequena marca fiducial no lado direito de cada bloco, na metade da distância entre as duas raízes adjacentes.Em seguida, para preparar os tecidos para análise histológica, transfira os blocos individuais para pequenos frascos claramente rotulados contendo paraformaldeído, mantendo-os em incubação durante a noite à temperatura ambiente. Na manhã seguinte, transfira os blocos para novos frascos contendo solução de sacarose a quatro graus Celsius. Após pelo menos dois dias, transfira os segmentos para moldes criogênicos individuais.Oriente os blocos com a face dorsal voltada para cima e cubra-os com meio de congelamento para tecidos. Em seguida, congele as formas criostáticas a menos 20 graus Celsius e corte seções de 50 mícrons com um criostato. Para dissecar a medula espinhal lombar, posicione o animal em posição supina e faça uma incisão mediana ao longo do abdômen.Remova as vísceras e dissecque os músculos da parede abdominal posterior. Para expor a face ventral da coluna vertebral, localize a costela mais curta adjacente à vértebra T13, onde a raiz ventral de T13 sai do osso. Em seguida, utilizando pinças cirúrgicas finas consecutivamente, remova até três vértebras rostrais a T13 para acompanhar a raiz ventral de T13 até o seu ponto de entrada na face ventral da medula espinhal.Marque a raiz ventral com uma caneta permanente de ponta de feltro. Em seguida, remova as vértebras conforme demonstrado anteriormente, marcando L1 a L6 e S1 com cores para facilitar sua identificação. Por fim, dissecar os blocos e prepará-los para histologia conforme demonstrado anteriormente. Neste tecido representativo simulado durante a coloração histoquímica de acetilcolinesterase, as placas motrizes do trapézio acromial, deltoide espinhal e tríceps braquial são aparentes como pontos brancos salpicados que formam uma linha contínua atravessando toda a largura do músculo, enquanto as fibras musculares adquirem um tom verde-azulado.Após a imersão e o sulfeto de amônio, as placas motrizes tornaram-se pretas sobre as fibras musculares marrons. Em seguida, um marcador neuronal retrógrado foi injetado ao longo da região da placa motriz do músculo tríceps braquial de um camundongo vivo. Como esperado, o marcador identificou neurônios motores formando uma coluna longitudinal que se estendia por múltiplos segmentos da medula espinhal, direcionando-se apenas a uma parte da região da placa motriz, conforme mostrado aqui pelas áreas verdes, azuis ou vermelhas do tríceps.A região da placa motora terminal do braquial resulta em uma rotulagem reduzida dos neurônios motores, conforme mostrado pelas colunas motoras verde, azul ou vermelha. Portanto, para obter a captação máxima do marcador nos neurônios motores inervantes, toda a região da placa motora terminal deve ser injetada após este procedimento. Outros métodos, como imunohistoquímica ou contagem estereológica de células, podem ser realizados para responder questões adicionais, como reações antígeno-anticorpo e a morfologia dos neurônios motores marcados após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da neurociência desenvolverem estratégias terapêuticas como terapia gênica, modelos de roedores ER de disfunção neuromuscular.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores (Vídeo) | JoVE Journal

Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

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